Summary
マウスは、感染症や消化管微生物によって引き起こされる病気を研究する非常に貴重な生体内でモデルを表します。ここで、細菌の植民地化およびピロリ菌のマウス ・ モデルにおける病理組織学的変化を研究するために使用するメソッドを説明-関連の病気。
Abstract
ピロリ菌は、世界の人口の半分に存在し人間の死亡率と罹患率の重要な原因は、胃の病原体です。胃ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のいくつかのマウス モデルというピロリ菌の人間のホストの胃を植民地化し、病を引き起こす分子・細胞メカニズムの研究開発されています。ここに、プロトコルについて述べる: 1) 胃内強制経口投与; を介してマウスの生体内感染の細菌懸濁液を準備2) ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、生菌数計測; マウス胃組織で細菌の植民地化のレベルを決定します。3) 組織学による病理学的変化を評価します。Helicobact小胞体に感染するのにマウス、特定病原体フリー (SPF) 動物は最初に懸濁液 (≥105コロニー形成単位、CFUs を含む) のいずれかのピロリ菌の系統のマウス-植民地化と再接種または動物から他胃のヘリコバクター属などピロリ felis 。適切な時点後感染症で胃は切除、幽門部と体の領域を構成する各 2 等しい組織片に大の解剖。他は組織学的処理に服従する中、これらのフラグメントの 1 つ、生菌数計測または DNA の抽出のいずれかの使用されます。細菌の植民地化および胃の病理組織学的変化は、胃組織切片を腺リンパ星空、ギムザまたはヘマトキシリンとエオシン (H & E) 汚れに応じて染色で日常的に評価が。免疫組織化学またはマウス胃組織切片を蛍光抗体法によって追加の免疫学的解析を実施もことがあります。下記プロトコルを人間関連のh. ピロリ菌に似た胃の病態のマウスの評価を有効にする設計疾患、炎症、腺萎縮とリンパ濾胞形成を含みます。接種材料の準備および胃内強制経口投与プロトコルもサルモネラ菌やシトロバクター属齧歯類などのマウスを植民地化他の腸溶性ひと病原体の病因を研究に適応させること。
Introduction
ピロリ菌、螺旋状で、グラム陰性菌、人間胃病原体すべての人口で現在 801順と推定される開発途上国の感染率で、世界中。ほとんどピロリの感染した人はいくつかのより重篤な疾患、胃癌2消化性潰瘍に至る開発、無症候性であります。H. ピロリ菌の上皮細胞 (GECs) の悪性変化またはリンパ節外胃、胃腺癌の結果または粘膜関連リンパ組織の形成によって関連付けられている癌の特徴広くティッシュ (モルト) リンパ腫、それぞれ。H. ピロリ菌は様々 な病原性因子とその付着、成長、このニッチ市場で代謝を促進する機構が存在するため胃の過酷な生態学的ニッチ市場で生き残るために適応高。特に、ピロリ菌の病原性菌株所有 40 kb cag病原性アイランド (cagパイ) タイプ 4 分泌システム (T4SS)3,4 の生産のために必要な約 30 遺伝子をエンコードします。.cagPAI 陽性ピロリ菌は胃癌の5の重要な前駆体として関与しているホストの慢性的な炎症のより高いレベルの誘導に関連付けられています。
ホスト、ピロリ感染と病気の結果6細菌と環境要因の相対的な貢献を調査する研究者を許可することで、生体内で動物モデル、特にマウスを非常に有益されています。H. ピロリ菌を延長する以前の調査は示した感染症慢性胃炎および腺の開発における C57BL/6 遺伝的背景結果上でマウスの萎縮、ピロリ感染7の両方の特徴。さらに、似たような病理と病進行人間 MALT リンパ腫8,9に見られるようにマウスで麦芽の形成を誘導する関連猫/犬細菌種H. felis感染が示されています。H. ピロリ菌を使用頻度の高いマウス植民地研究の分離は「シドニーひずみ 1」(SS1) ひずみ10、 cagパイ+ですが、非機能的な T4SS を持つ (T4SS−)11。他の広く使用されている系統は、 h. ピロリ菌B128 7.13 (cagパイ+/T4SS+)12 X47 2AL (cagパイ-/T4SS−)13。H. felis感染症、ひずみ CS1 (「猫スパイラル 1 を」、 cagパイ-/T4SS−) 一般的に使用される14。
本明細書で提供体内感染ヘリコバクター ・ ピロリ接種、マウスの胃内強制経口投与の手順だけでなく、病理組織学的変化の研究のためのティッシュの処理の方法の準備を記述するプロトコル胃。特に、この記事細菌の植民地化を視覚化し、感染マウスの胃粘膜における麦芽の形成を含む、病理組織学的変化を評価するために使用する組織学的方法に焦点を当てます。ここで説明する方法のいくつかはs.など他の腸病原体の研究に適応させることネズミチフス菌またはC. 囓。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 成長および細菌の接種の準備
- H. ピロリ菌またはH. felis15 -80 ° C とから成る馬血液寒天培地 (HBA) プレートのサブカルチャーからのグリセロールを解凍: 血液寒天培地ベース 2 号 (材料の表を参照)。変更された「スキロー抗生物質選択サプリメント」(バンコマイシン 10 G/ml; から成るポリミキシン B、25 ng/mL; トリメトプリム、5 μ G/ml; 2.5 μ g/mL アムホテリシン B);5-10% (v/v) 馬血15,16。細菌成長 2.5 または 3.5 L で 524 微好気条件下でよく適切なガス パック (材料の表を参照してください)、37 ° C でを含む嫌気性の瓶
注: H. felisインキュベーションの少なくとも 2 日間は一般に必要なに対し、これらの条件下で栽培したピロリ菌は培養の 1 – 1.5 日後継する必要があります。適切なカルチャおよびストレージ メディアに記載されている詳細以前15。 -
初期から半ば対数段階文化によるマウス感染の細菌により接種を準備します。ブレインハートインフュー ジョン (BHI) の 1-2 mL、各プレートを洪水によって寒天からそっと細菌を収穫します。パスツール ピペットを板から懸濁液を吸い出しなさい。
- また、16-18 h15BHI ブイヨンで伝播されているピロリ菌接種を準備します。この場合、4 ° C で 10 分間 2,200 x gで低速遠心分離によって細菌を収集します。
- 位相差顕微鏡 (100 倍目標) の下でウェット マウント標本を調べることによって、生存率および細菌の運動性を評価します。ガラス顕微鏡スライドのスープ、BHI の 10-20 μ L 液滴中の細菌の loopful を再してウェット マウントを準備します。H. felis、ピロリ菌よりもはるかに大きい菌である場合に、細菌の数を正確にカウントする、haemocytometer を使用します。グラム染色を行い文化純度を確認します。
注: は、細菌の大半が (形態は株に応じて変化する) 桿状または螺旋状の形をしている場合のみh. ピロリ菌接種を使用します。H. felis接種は主にらせん状細菌.を含める必要があります。ほとんどの細菌は、これらのフォームは成り立たないとマウスの感染を確立できませんが、球状の形態をある場合は、接種を使用しないでください。 -
位相差顕微鏡下で 1 つのフィールド (100 × 対物) 細菌のおおよその数を数えることによって、次のガイドを使用して接種菌数の推定: フィールドあたり 1 細菌 = 約 106コロニー形成単位 (CFU)ヘリコバクター ・ ピロリ/mL; のフィールドあたり 10 細菌 = 約 107 CFU/mL;フィールドあたり 100 細菌 = 約 10 8 CFU/mL 等
- Haemocytometer を使用して、CFU/mL 以下の数式を計算します。
CFU/mL = (4 x 4 のフィールドで菌の平均数) x (希釈率) x (104)。
- Haemocytometer を使用して、CFU/mL 以下の数式を計算します。
-
必要な場合は、約 107– 10 に8 CFU/mL BHI ブイヨンで希釈による菌の細菌の細胞密度を調整します。
- 最大の細菌の生存を確保するため、胃内強制経口投与の準備の後、できるだけ早く接種を使用します。
- 常に強制経口投与の手順 (下記参照) の直後に接種の生菌数計測を行いピロリ菌細胞の密度と生存率を確認します。これは、ない常にH. felis、可能通常培地に隔離されたコロニーは形成しません。接種可能なピロリs の番号は、このメソッドは実行可能な間は差別しないと光学密度計測 (600) だけによって決定できない (すなわち、桿状/らせん) と非実行可能 (すなわち、球状) 細菌。
- 光学濃度値を使用して、実行可能なh. ピロリ菌の数を予測する手段として接種が、この場合中の細菌成長曲線を生成するの先決です。このため、ピロリ文化の A の600の値の時間の経過とともに監視し、プレートを数えて、細菌数に対する直接相関します。
注: 10% CO2インキュベーターは、標準的な平らな底培養フラスコを使用して (セクション 1.2), 液体培地で菌を培養することそのような成長曲線の決定を実行するための便利な方法です。2-3 日間すべての 4-6 h を得られた文化の因数から決定 CFUs の番号は対応する600値17に比べてしています。重要なは、これらは異なる速度で成長可能性があり、さらに、すべての株が 10% CO2でよく育つ成長曲線を各ピロリ菌株に生成されなければなりません。
2 ヘリコバクター ・ ピロリとマウスの胃内強制経口投与
注: この方法で胃内強制経口投与は、腸など米植民地化他の細菌種に適用できます。ネズミチフス菌、C. 囓、リステリア菌。
- 6-8 週齢、特定病原体フリー (SPF) とヘリコバクター ・ ピロリを使用して-無料のオスかメスのマウス。H. ピロリ菌やH. felisでの感染実験の C57BL/6 遺伝的背景を持つ動物を使用します。本研究では、野生型 (WT) を使用し、遺伝子組み換え c57bl/6 マウス (ノックアウトまたは KO 動物と呼ばれる) キーの自然免疫受容体を欠けています。
注: その他の遺伝的背景にマウスはヘリコバクター ・ ピロリ感染症にも使用できます、ただし、植民地化レベルと病気の重症度のホスト背景18,19の種類によって影響する可能性があります。 - 使い捨ての 1 mL 注射器に菌 (ステップ 1.5) を吸引し、先貼付使い捨てポリエチレン カテーテル (長さ、6-8 cm; 0.58 mm 内径) は、23 ゲージ針に付属の針を置き換えます。プラスチックの小さなストリップのアプリケーションによって針にカテーテルを固定フィルム (材料の表を参照してください)。または、栄養チューブ滅菌プラスチックを使用する針とカテーテルのアセンブリを置換 (20 ゲージ x 38 mm)。
- 首と尾の首筋にしっかりしたグリップを持つマウスを物理的に抑制します。
注: 麻酔なしはまたは、15methoxyflurane やイソフルランなどの吸入麻酔薬の使用には、この手順を実行することができます。 - オープンジョーと食道に向かって尾側方向にガイド部にカテーテルを挿入します。ほとんどまで (と気管から離れて) 食道を通って胃へのアクセスの容易にできるようにマウスの首を延長またはカテーテルのすべてが表示されなくなります、抵抗を感じ、胃のベースに対応します。特定の因数は、通常 100 μ L 接種 (図 1) あたりを提供します。
注: マウスは ≥ 10 と gavaged する必要があります5 CFU 最適な植民地化および疾患の病理を確保するため。 - 家のマウス実験の持続期間のための SPF 動物施設。
注: 深刻な病状と WT c57bl/6 マウスの腺癌のみ約 24 ヶ月感染後20で観察されます。しかし、この効果は、いくつかの遺伝子改変動物や他の遺伝的背景を持つマウス加速があります。 - 強制経口投与の手順が完了したら、実行可能なh. ピロリ菌の数を決定するミスラ手法の変更で行う細菌がマウスに投与しました。このため、接種は直列で希釈した (から 10−5を 10− 1 ) BHI の手法では以前15詳細。
メモ: 単一コロニーの分離を確保するために HBA プレート暖め、使用する前に 10-15 分の生物学的安全キャビネットまたは 37 ° C の定温器で乾燥します。
3. マウス実験から組織の収穫
- 炭酸ガス吸入または動物実験に関連する倫理委員会によると、頚部転位によるマウスを安楽死させます。
- 腹腔内を開き、罰金、曲線はさみを使用して胃を切除します。
注: 血清は、ヘリコバクター ・ ピロリ感染に対する全身性反応の調査を支援するため心臓穿刺によっても収集できます。さらに、脾臓および旁胃壁リンパ節のコレクション、適応免疫の勉強に便利です。 - 胃大弯に沿ってカットし、50 mL チューブに穏やかな洗浄滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で残留食品を削除します。
- もう一度滅菌 PBS で胃を洗浄し、tared 6 cm プラスチック製シャーレを使用して湿重量を記録します。
- 胃を平らにし、それぞれを構成する 2 つの等しい組織片に大の解剖: 前庭部、体と非腺胃領域 (図 2)。非腺領域を削除し、1 つの重量を量るそれぞれの半分は滅菌 BHI のいずれか 1 つの mL (生菌数計測) を追加する前に胃またはスナップ (DNA ・ RNA の抽出) を液体窒素で凍結します。
注: を処理する準備ができるまで、BHI の組織を含むチューブを氷の上保存して必要があります。スナップ冷凍胃組織は、RNA または蛋白質 qPCR (量的な PCR) または西部のしみが付く分析をそれぞれ抽出するも使用できます。 - 他の胃の半分を 10% ホルマリンを含む 15 mL チューブを追加します。10 の 10% ホルマリンで組織を浸す s、チューブの上面を平らにします。再 24 h の最低 10% ホルマリン溶液に浸漬する前に修正するために、組織を許可します。
注: 組織は、組織学のための処理の前に多くの週 10% ホルマリンに維持できます。ただし、組織の長期貯蔵、その建築および/または下流解析のサブ最適な結果の結果として抗原性影響を与えます。
4. 胃の感染後の細菌の定着の確認
-
胃の中のピロリ菌の実行可能なカウント
- サプリメント滅菌 HBA 板感染マウス胃16からコロニー カウントを実行する前にその他の抗生物質 (200 μ g/mL バシトラシンと 10 μ g/mL naladixic 酸)。
- オートクレーブ ポリプロピレン micropestles を使用してまたは機械的解離器具を使用して、手動でか胃のセクションを均質 (材料の表を参照してください)。
- 滅菌 BHI の結果胃ホモジネートの重複シリアル希薄 (10− 210− 1 ) を準備します。
注: 希釈は与えられたh. ピロリ菌の得られた典型的な細菌の負荷に基づいてを決定すべき感染症の持続期間と同様、感染株。原液のサンプルも使用できます。 - 予備乾燥された HBA プレート (上記のメモを参照) を 3 つまたは 4 つのセグメントに分割します。ミスラの技術の適応を使用して、各希釈寒天プレートのセグメント上の 10-100 mL を追加し、滅菌プラスチック ループ15を使用して拡散します。
- 乾燥し、嫌気性ガス瓶内の逆位置 (蓋側を下) にそれらを配置するプレートを許可します。Jar ファイル内の湿度を維持するために水の入ったシャーレに入れます。
- コロニー形成 (通常 4-7 日) までは、37 ° C で瓶を孵化させなさい。
- 10 と 100 の隔離されたコロニー間にセグメントを含む列挙です。
注: h. ピロリ菌のコロニーとH. felis成長板標準ウレアーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ テストを使用してマウスの胃内細菌の他のメンバーのものと区別できます。ピロリ菌とH. felisすべての 3 つのテストのため正です。 - (組織の CFU/g) として細菌負荷を計算する次の数式を使用して。
[(コロニー カウントの平均数) × (希釈倍率) (ボリューム メッキ) x] (胃重量)。
-
H. felis感染胃組織ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) による検出
- 標準的な DNA の隔離のプロトコル、または市販のキットを使用してマウスの胃から DNA を抽出します。
- 蛍光定量法による試料 DNA 濃度を決定する (表の資料を参照してください)。
- H. felisウレアーゼ B 遺伝子 (ureB)21325 塩基対 (bp) フラグメントをターゲットの PCR の反作用を設定します。各反応を含める必要があります: 100 ng の dna;前方の 1 mM (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3') および逆引き (5' CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3') プライマー;200 mM dNTPs;Taq のポリメラーゼとバッファーとヌクレアーゼ フリー水の適切な量の 0.5 単位。
注: このオリゴヌクレオチド ペアが認識してピロリとH. felisのureB遺伝子が、PCR 条件下、ないそれらのureBの存在を受けるとき、相同の配列にバインドしています腸肝ヘリコバクター ・ ピロリ菌の遺伝子 - 次の熱プロファイルを使用して PCR 増幅を実行: 30 94 ° C の 35 サイクル 5 分 94 ° C で加熱、続いて s、61 ° C 30 秒と 1 分の 72 ° C、20 ° C の開催前に
- 100 V で 30 分間 2% の agarose のゲルの PCR の製品を実行します。
5 ヘリコバクター ・ ピロリの組織学的分析感染マウス胃セクション
- 胃組織の処理
- 胃組織をホルマリンときれいなペトリ皿の場所から削除します。
- いくつか同じサイズ縦方向のストリップ (各 2-3 mm 厚) にメスで胃の組織を切り取り、泡のパッディングを含むラベルの埋め込みカセットに。
- 80% エタノールで満ちている瓶に埋め込みカセットを置くことによって胃組織を修正します。
注: 胃がすぐに処理または次のステップに進む前にまで 1-2 日間保存されます。 - 自動化された組織のプロセッサは、次の設定でプログラムのプロセス胃:
脱水: 70% エタノール - 1 サイクル、20 分。90% エタノール - 1 サイクル、20 分。100% エタノール - 2 サイクル、20 分 + 40 分 + 1 サイクル 1 サイクル 1 h。
クリア: キシレン-2 サイクル、各 30 分 + 1 サイクル、45 分。
60 ° C - 1.25 h 1 h + 1 サイクル、45 分 + 1 サイクル 1 サイクルで受精: パラフィン ワックス。 - マシンから加工のサンプルを削除し、パラフィン包埋用常温で保存します。
- 胃組織のパラフィン包埋処理
- 金型の基盤を暖める埋め込みユニットのステージにステンレス鋼ベース金型を配置します。
注: 機械を埋め込みは、効率的なパラフィン包埋用 60 ° C で設定する必要があります。 - ワックスが完全に溶けるまで埋め込みユニットの暖かいワックスお風呂/ホット プレート領域にサンプルを含むワックスのカセットを配置します。
注意: ワックス溶解直後後、サンプルを埋め込むことをお勧めします。これにより、組織の硬化が発生しません。 - パラフィン ワックスでステンレス鋼金型の半分を埋めます。暖かい鉗子を使用して、カセットと優しく胃ストリップ金型のベースにパラフィンをプッシュから胃組織のストリップを削除します。慎重に、スライスの両端が上向きに直面しているので、金型のベースに直角に組織ストリップをオリエンテーションします。
注: 次の手順は硬化および埋め込まれたブロック内のパラフィン層の分離を避けるためにできるだけ早く実行する必要があります。胃組織の適切な方向が下流解析のため重要です。 - 場所で試料を修正し、必要であれば組織を再オリエンテーション埋め込みユニットのコールド プレートに型を置きます。
注: 組織が外れとなっていて、パラフィンが固まり始める場所をワックスを溶かすし、金型に組織を再埋め込むホット プレートに成形します。 - 金型の上のラベルな埋め込みカセットの (これはティッシュの処理のために使用された) の半分を置くし、優しく暖かいワックスで埋めます。オーバーフローにパラフィンを許可しません。
- 優しく冷たい皿に金型を置き、冷却すること。
- パラフィンが完全に決まったら、金型から埋め込みのブロックを区切ります。ホット プレート (80 ° c セット) またはスクレーパーを使用してカセットの端をきれいに余分なパラフィン ワックス。断面が実行されるまで、ブロックは室温で保存することができます。
- 金型の基盤を暖める埋め込みユニットのステージにステンレス鋼ベース金型を配置します。
- 組織の断面
- 氷の上のパラフィン埋め込まれたティッシュのブロックを冷やすし、水ふろを 40-45 ° c を超純水でいっぱい
- ミクロトームのホルダーに刃を固定し、逃げ角パラフィン ブロックを挿入する前にブロックの顔とナイフ面間の接触を防ぐために 1-5 ° 間を設定します。
注: は、ブロックは、ブロックの適合を妨げる可能性がありますこの埋め込みから得られる余分なパラフィンのクリアを確認します。 - ブロックでストレート カット用ブレードをオリエンテーションします。軽く 2-3 ブロックの正確な位置を確保するための薄い部分をカットします。
- 約 10-30 mm の厚さによってブロックをトリムします。この手順は、各組織のストリップの最大面積を削減することにより。
- 10 μ m のセクションとトリミングによる孔を含む破棄をカットします。
- 慎重にピンセットを使用してセクションをピックアップし、それらを平坦化のため風呂の水のフロートします。ピンセットを使用して、各セクションを区切ります。
- 水浴と荷電ガラス スライド (材料の表を参照してください) に場所からのセクションを収集します。
- スライド スライド ラックで直立を格納し、37 ° C の定温器の配置一晩乾燥セクション。
- 以降の解析が無期限に室温でのセクションを格納します。
- ヘマトキシリンとエオシン (H & E) は、胃組織の染色
- 3 分間の 100% エタノールで 3 洗浄が続く 5 分それぞれのキシレンの 3 洗浄を使用してスライドを dewax します。新鮮なソリューションは、各段階で使用されるを確認します。
- スライドを 30-60 s の水道水ですすいでください。
- 余分な水分を削除するには、ペーパー タオルの上のスライドの下をやさしくタッピングします。3 分のセクションがソリューションで十分に覆われていることを確認してくださいフィルター ヘマトキシリンで染色します。
- 水が明確な実行されるまで水道の流水下でスライドをすすいでください。
- スライド 8 – 10 s のためのスコットの水道水を浸しなさい。10 以上のソリューションにスライドを公開しないでくださいこれとして s は暗く、激しい汚れになります。セクションの染色は、顕微鏡下で表示できます。この段階で効率的な染色は、' ベビー ブルー」色になります。
注: は、2 g (NaHCO3) 炭酸水素ナトリウムと蒸留水 1 L に硫酸マグネシウム (MgSO4) 20 g を溶解してスコットの水道水を準備します。 - スライドを 30-60 s の水道水ですすいでください。
- 手順 3 で説明されているように余分な水分を削除し、フィルター処理された 1% で染色 3 分水性エオシン。
- 水が明確な実行されるまで水道の流水下でスライドをすすいでください。
注: 光学顕微鏡を使用して評価することができます染色します。染色が暗すぎる場合スライドは指定した時間よりも長くするために 100% エタノールで脱水することができます。暗い染色が必要な場合のスライドと汚されることができるエオシン 1-2 分長く、以降の手順に進む前に。 - 30 の 100% エタノールの 3 洗浄を使用してスライドを脱水、それぞれ s に続いて 2 分のキシレンの 3 洗浄。新鮮なソリューションは、各段階で使用されるを確認します。
- メディアをマウントをスライドをマウントします。優しく下向きのセクションの上にスライドを配置する前にきれいなカバーガラスのセンターでメディアをマウントのドロップを追加します。
注: は、カバー スリップする前にスライドを乾燥しないでください。 - スライドを平らな面に置き、乾いた空気で乾燥させて。スライドは、乾燥時間を加速する発煙のフードも乾燥することができます。
- 胃組織のギムザ染色
- 100% のエタノールの 3 分の 2 洗浄 3 分新鮮なソリューションは各洗浄のために使用されることを確認するために 70% エタノールの最終的な洗浄順を 5 分ごとに、histolene の 2 洗浄を使用してスライドに dewax します。
- スライドを 30-60 s の水道水ですすいでください。
- 蒸留 80% 水 20% ギムザ染色を混ぜてギムザ ソリューションを準備します。1 h のエオジン スライドを染色します。
- 酢酸 2-3 s のための 3-4 滴を含む蒸留水 100 mL にスライドを配置します。
注: ソリューションを使用する前によく混合する必要があります。この段階では、スライドが淡いブルーの色で表示されます。 - 30 の 96% のエタノールでスライドを洗う s。
- Histolene 2 分の 3 の風呂に続いて 2 分のイソプロパノールの 3 お風呂でスライドを洗ってください。洗うたびに新鮮なイソプロパノールと histolene を使用します。
- 前述のとおり Coverslip スライド実装中。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルでは、胃内感染ピロリまたはH. felisマウス マウス モデル (図 1) を達成するために経口技術について説明します。次の安楽死、胃が削除の重量を量った、前庭、体と胃組織 (図 2) の非腺領域で構成される 2 値の半分に分かれています。非腺領域は、すべての解析を実行する前に削除されます。
H. ピロリ菌の生菌数計測を行って動物の成功植民地化を確認して通常-胃のホモジネートを感染し、その後 HBA プレート (図 3) の個々 のコロニーを列挙します。また、 H. felis H. felisのh. ピロリ菌の ureB遺伝子 (図 4) 325 bp の領域を特定、検証されたプライマーを使用すると感染症の確認に PCR を採用します。
埋め込みと下流組織用切片、胃組織が処理されます。H & E 染色技術を使用してヘリコバクターピロリの病理組織学的に評価する-マウスを感染しています。現在の例では、WT c57bl/6 マウスは、炎症、過形成 (拡大粘膜) H. felisと 6 ヶ月後感染腺萎縮などの適当な標識を表示します。細胞浸潤の存在は、サブの粘膜も観察できます。興味深いことに、しかしより深刻な炎症は細胞浸潤 (図 5) の近くにあるリンパ濾胞の追加の存在、同じ時点で KO マウスで観察されます。最後に、 H. felis細菌が感染したマウス胃 (図 6) のセクションをギムザ染色で観察されます。
図 1: 経口技術を実証イメージ。使い捨て 1 mL 注射器と柔軟なカテーテルを使用して、胃内のルート経由でマウスを ≥105細菌接種の CFU を提供します。マウスで methoxyflurane を使用して、食道経由で胃にカテーテルのアクセスを可能にする、首にしっかりしたグリップで開催された麻酔されました。
図 2: マウス脾臓と胃の収穫後感染。マウスの胃には、収穫後安楽死とメスでこすると滅菌 PBS で洗浄により除去その内容が。組織、圧迫され胃幽門部、体と非腺領域で構成される各 2 等しい半分を明らかにするコットン シートのフラット化スケール バー = 10 mm。
図 3: h. ピロリ菌の生菌数は感染マウスの胃です。C57BL/6 背景にマウス接種 107 8 週間ピロリSS1 左右の CFU。(A) 各胃磨砕液の希釈は、HBA プレートと細菌負荷 10 100 個々 のコロニーを列挙することによって評価の半分 (または第三者) にメッキします。皿の左半分は、ピロリ菌の純粋培養を示しています。(B) マウスの胃から汚染細菌の存在の微生物叢 (左) または多数のh. ピロリ菌のコロニー (右)、 h. ピロリ菌CFUs の列挙が複雑に。(C) 胃ホモジネート サンプルの汚染細菌の一般的な例です。スケール バー = 1.7 cmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 4: ureB遺伝子をターゲットとするオリゴヌクレオチドを使用して胃の生検におけるH. felis感染 PCR 検出。特定のオリゴヌクレオチドのペアを認識してH. felisとh. ピロリ菌の ureB遺伝子の相同配列にバインドされました。これらのプライマーはピロリSS1 からゲノム DNA を使用して検証された (2 車線) またはH. felis (3 車線)。脱イオン水は (1 レーン) のネガティブ コントロールとして含まれていた。
図 5: H. felisと 6 ヶ月後感染症で WT と KO マウスから H & E 染色の胃の代表的なイメージのセクションします。パラフィン埋め込まれたティッシュ セクションは H に染まっていた & E. WT マウス BHI スープだけを受信 (コントロール) は通常胃上皮と重要な炎症がないです。対照的に、WT 動物の感染慢性H. felisと炎症の中程度のレベルを表示されます、 H. felis粘膜肥厚したがさらに悪化-KO 動物を感染しています。H. felisからティッシュ セクション-感染した KO マウスは過形成、腺萎縮 (▶) 細胞浸潤 (→) 粘膜リンパ濾胞 (*) の存在を展示します。スケールバー = 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: C57BL/6 WT マウスH. felisと感染 3 ヵ月後から胃のセクションをギムザ染色の代表的なイメージです。パラフィン埋め込まれたティッシュ セクションのギムザ染色.矢印は、胃腺のH. felisの存在を示しています。スケール バー 200 μ m を =。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでは、ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のため生体内でマウス モデルの使用について説明します。プロシージャの重要なステップは、: 1) 実行可能なおよび運動性細菌を含むヘリコバクター ・ ピロリ接種の準備2) 胃内強制経口投与; 経由のマウスへの細菌の適切な数の配信3) コロニー カウントおよび/または pcr 法による細菌感染症の検出・ 4) の病理組織学的評価を有効にするために胃組織の処理感染の胃。トラブルシューティングおよび技術的な考慮事項変更のためのそれ以上の提案を以下に示します。
馬血液を添加した血液寒天培地ベース第 2 を使用してピロリ菌を成長させる方法は、当研究室でよく確立されています。ただし、代替寒天拠点などブルセラ寒天とコロンビア血液寒天培地に使用される22にすることができます。洗剤は無料ですだけ滅菌ガラスを使用して成長培地を準備することを確認することが重要です。さらに、最適な成長を得るためには、ピロリ菌は、残留水分が乾燥するいないと寒天で、日常的に継代する必要があります。ピロリのサブカルチャーに重要だが感染ヘリコバクター ・ ピロリspp.接種を準備しているとき、 H. felis株毎 1-1.5 または 2 日間、それぞれ、細菌の生存を確保するため。すべてのサブカルチャで細菌は、位相差顕微鏡による生存率の運動評価されなければなりません。胃のピロリ菌や他の細菌の23を区別するウレアーゼ法ことができます定期的に採用も、しかし、この試金が実行可能な非実行可能なピロリ菌を検出することを実現するために重要です。次の動物の接種、ヘリコバクター ・ ピロリの懸濁液の生菌数は細菌感染症に使用される数を量的に行われなければなりません。再現性をもって、 H. felisでは、寒天培地15の隔離されたコロニーを形成していないと、位相差顕微鏡を使って細菌数の推定を行います。このメソッドは実行可能な非実行可能な細菌を差別していません、光学密度計測 (600) だけによる細菌数の定量は正確ではないです。(セクション 1.5) 上記のよう、厳密な最適化を行う研究でピロリこのメソッドを使用しない必要があります。
ヘリコバクター ・ ピロリ感染症研究を実行すると、最適なマウスピロリひずみと感染症は、実験の目的に合わせての長さを考慮することが重要です。また、実験に使用される動物が実際にヘリコバクター ・ ピロリであることを定期的に確認するために不可欠だ-属特異 PCR プライマー24使用無料します。Bilis ヘリコバクター ・ ピロリ、ピロリ hepaticus ヘリコバクター ・ muridarumなどの他の腸ピロリ種の存在可能性がありますマウスの疾患感受性を変更し、交絡要因を紹介vivo 25,26を研究します。また、通常細菌のヘリコバクター ・ ピロリ菌と病原性に及ぼす影響を調査するための最初のスクリーニング実験に動物 (すなわち、与えられたスープのみ) の模擬治療対照群を含めることをお勧めします。
後安楽死マウス胃の中にピロリ菌を植民地化は、生菌数計測で測定できます。コロニー カウントに使用される HBA プレートは通常胃内細菌叢から菌種の成長を制限し、それ故に汚染防止のために、変更されたスキロー選択サプリメントに加えてバシトラシンと naladixic 酸で補わなければなりません27. H. felis常にコロニーを形成しないが、代わりに寒天プレート15,28に群がって成長を形成する傾向があります。したがって、PCR と qPCR 常時雇用の存在とH. felis、それぞれ29,30のレベルを決定します。セクション 4.2, H. felisのh. ピロリ菌 325 bp の領域を対象に検証されているプライマーのペアを使用してマウスの胃の中のH. felisで植民地化を確認する簡単かつ迅速な PCR 法を紹介 ureB遺伝子。これらの胃のピロリ菌による感染症とウレアーゼ産生腸肝の間で区別することが可能です上記の PCR 条件を使用して、 Helicobacters.胃ヘリコバクター ・ ピロリ感染症の PCR 検出済みの他の遺伝子を含める、16s rRNA とフラジェリン B (ぜい肉) 遺伝子15,29,30。
最後に、2 つの強力な染色技術を使用した: H & E 染色, 胃後感染症の病理組織学的変化を評価するために・ ギムザ染色、 H. felisの感染を検出します。最適な染色を取得するには、組織が保持、処理、正しい向きに埋め込まれていることを確保することが不可欠です。さらに、新鮮なソリューションを用意して、フィルターだけ汚れはこのプロセス中に使用する必要があります。ティッシュ セクションを無期限に保存し、蛍光抗体法や免疫組織化学を介して胃の病理のより詳細な分析のために利用できます。胃の炎症や病気のいくつかの他の一般的な尺度を含める: 免疫細胞の動員 (抗 CD45 染色)。粘膜肥厚/破壊 (過ヨウ素酸シッフ/アルシアン ブルー染色)。上皮細胞の増殖 (増殖細胞核抗原、PCNA/ブロモデオキシウリジン、BrDU 染色)。または細胞のアポトーシス (TUNEL 染色)。B に対する抗体を用いた免疫組織化学で H & E 染色組織H. felis -感染マウスにみられるリンパ濾胞が確認できます (B220+) と T 細胞 (CD3+) 抗原31。
要約すると、細菌性疾患の動物モデルは、感染生物学の分野で貴重なツールを提供します。胃内強制経口投与のプロトコルおよび胃組織の処理は、ここでマウス感染モデルを含む他の腸病原体に適応させることを提供されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、さん A. ・ デ ・ パオリとさんジョージー Wray マッキャンにテクニカル サポートに感謝したいと思います。著者は、モナッシュ組織プラットフォーム、解剖学と発生生物学、モナッシュ大学の技術支援施設の利用を認めます。研究室は、RLF (APP1079930、APP1107930) に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの資金によってサポートされます。RLF は NHMRC (APP1079904) から上級研究員によってサポートされます。モナッシュ大学院奨学金、KD と MC を両方ともサポートします。KD もサポートされてセンター自然免疫とハドソン研究所医学研究の感染性疾患の MC に医学部、看護、保健、モナシュ大学からの国際大学院奨学金があるとき。医学研究のハドソン研究所での研究は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムによってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
