Summary
Мышей представляют собой бесценный в vivo модель для изучения инфекции и заболеваний, вызванных желудочно-кишечные микроорганизмы. Здесь мы описываем методы, используемые для изучения бактериальной колонизации и гистопатологические изменения в моделях мыши Helicobacter pylori-связанных заболеваний.
Abstract
Helicobacter pylori это желудка возбудителя, который присутствует в половину мирового населения и является существенной причиной заболеваемости и смертности в организме человека. Несколько моделей мыши желудочной инфекции Helicobacter были разработаны для изучения молекулярных и клеточных механизмов, whereby H. пилори бактерий колонизировать желудок человека хостов и вызывают болезни. Здесь, мы описываем протоколы: 1) подготовить бактериальных суспензий для инфекции в vivo мышей через внутрижелудочного кормления; 2) определяет уровень бактериальной колонизации в мыши желудка тканях, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и жизнеспособной подсчета; и 3) оценки патологических изменений, по гистологии. Установить HelicobactЭр инфекции в мышей, конкретного возбудителя бесплатно (SPF) животных сначала прививанным с суспензий (содержащие ≥105 колонии формирование подразделения, CFUs) мыши колонизировать штаммов либо Helicobacter pylori или другие желудка Helicobacter spp. от животных, таких как Helicobacter felis. В соответствующие моменты времени после инфекции желудков подакцизным и расчлененный sagittally на два равных ткани фрагменты, каждое в составе области гайморовых и тела. Затем один из этих фрагментов используется для жизнеспособных подсчета или экстракции ДНК, в то время как другой подвергается гистологической обработки. Бактериальной колонизации и гистопатологические изменения в желудке может оцениваться регулярно в разделах ткани желудка, окрашенных с Warthin-звездное, Гимзы или гематоксилин и эозином (H & E) пятна, в случае необходимости. Дополнительные иммунологические анализы могут также осуществляться иммуногистохимия или иммунофлюоресценции на разделах желудка ткани мыши. Протоколы, описанные ниже предназначены специально для проведения оценки в мышах патологии желудка, напоминающие те в связанных с человека Helicobacter pylori заболеваний, включая воспаление, атрофия железы и формирования лимфоидных фолликулов. Подготовка посевным материалом и внутрижелудочного затравки протоколы могут быть адаптированы для изучения патогенеза других кишечных патогенов человека, которые колонизировали мышей, например Salmonella Typhimurium или Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori это спираль образная, грамотрицательных, человеческого желудка патогена присутствуют в всех групп населения во всем мире, с заболеваемости в развивающихся странах, по оценкам, составляют порядка 80%1. Хотя большинство Helicobacter pylori-инфицированных протекает бессимптомно, некоторые развивать более тяжелых заболеваний, начиная от пептических язв желудка рак2. H. pylori-связанных рака характеризуются широко злокачественные изменения эпителиальных клеток (GECs) или формирования экстра узловой лимфоидной ткани в желудке, приводит к аденокарцинома желудка или слизистой оболочки, связанных лимфоидных ткани (MALT) лимфомы, соответственно. H. пилори высоко адаптирована к выжить в суровых экологическую нишу желудка из-за наличия различных факторов вирулентности и механизмов содействия его соблюдению, роста и метаболизма в этой нише. В частности вирулентным штаммов H. пилори обладают 40 КБ cag остров патогенности (cagPAI), который кодирует приблизительно 30 генов, необходимых для производства типа 4 секреторной системы (T4SS)3,4 . ЦАГ ПАЙ инфицированных штаммами Helicobacter pylori связаны с индукции более высокий уровень хронического воспаления в узле, который был вовлечен как основных прекурсоров аденокарцинома желудка5.
В естественных условиях Животные модели, особенно мышей, были весьма информативным, позволяя исследователей для изучения относительного вклада принимающих, бактериальных и экологических факторов на H. pylori инфекции и болезни результат6. Ранее исследования показали, что длительное пилорусов заражение мышей C57BL/6 генетический фон результатов в развитии хронического гастрита и железы атрофия, оба клейма Helicobacter pylori инфекции7. Кроме того было показано инфекции с смежных бактериальных видов кошачьих/собак, H. felis, вызывать образование солода в мышах с аналогичными патологии и прогрессирования заболевания как видно человека MALT лимфома8,9. Наиболее часто используемые пилорусов изолировать в мыши колонизации исследования является «Сидней штамм 1» (SS1) напряжение10, который cagПАЙ+ но нефункциональные T4SS (T4SS−)11. Других широко используемых штаммов включают пилорусов B128 7.13 (cagПАЙ+/T4SS+)12 и X47 2AL (cagПАЙ–/T4SS−)13. H. felis инфекций, штамм CS1 («Cat спираль 1», ЦАГПАЙ–/T4SS−) — обычно используется14.
Здесь мы предоставляем протокол, описывающий подготовку Helicobacter инокуляты в vivo инфекции, процедура внутрижелудочного затравки мышей, а также методы для обработки тканей для изучения гистопатологические изменения в желудке. В частности эта статья будет сосредоточена на гистологических методов, используемых для визуализации бактериальной колонизации и оценить гистопатологические изменения, включая формирование солода, в слизистой оболочке желудка зараженных мышей. Некоторые из методов, описанных здесь могут быть адаптированы к изучению других кишки патогены, например S. Typhimurium или C. rodentium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост и подготовка бактериальный инокуляты
- Оттепель запасы глицерина15 Helicobacter pylori или H. felisот-80 ° C и субкультуры на лошади пластины крови агар (HBA) состоит из: кровь агар основания №2 (см. Таблицу материалы); изменение «Скирроу антибиотик селективного дополнение» (состоящий из ванкомицин, 10 мкг/мл; полимиксин, 25 нг/мл; триметоприм, 5 мкг/мл; амфотерицин в, 2,5 мкг/мл); и 5 – 10% (v/v) лошади крови15,16. Бактерии растут хорошо в microaerobic условиях в 2,5 или 3,5 Л анаэробных баночки, содержащий соответствующий газ пакетов (см. Таблицу материалы), в 37 ° C.
Примечание: Штаммов H. пилори , выращиваемые в этих условиях необходимо subcultured после 1 – 1,5 дней инкубации, тогда как для H. felis, обычно требуется по крайней мере 2 дней инкубации. Подходящие культуры и хранения средств массовой информации были описаны подробно ранее15. -
Подготовьте бактериальный инокуляты мыши инфекции от раннего середине логарифмической фазы культур. Урожай бактерий мягко от плиты агара наводнением каждой пластины с 1 – 2 мл бульона инфузии (BHI) сердце мозга. Аспирационная суспензий из плит с пипетки Пастера.
- Кроме того готовить инокуляты от Helicobacter бактерий, которые распространились в BHI бульон для 16 – 18 h15. В этом случае соберите бактерий, низкая скорость центрифугирования в 2200 x g 10 мин при 4 ° C.
- Оценить жизнеспособность и сократительной способности бактерий путем изучения мокрой горе препаратов при фазово-контрастной микроскопии (100 X цель). Подготовьте мокрой монтирует, resuspending loopful бактерий в 10 – 20 мкл капли BHI бульон на стекло микроскопа. В случае H. felis, который гораздо больше бактерий, чем пилорусов, используйте haemocytometer для точного подсчета числа жизнеспособных бактерий. Подтвердите чистоту культуры, выполняя пятно грамма.
Примечание: Используйте только инокуляты Helicobacter pylori , если большинство бактерий имеют форму бактериальной или спиральные (морфология может варьироваться в зависимости от штамма). H. felis инокуляты прежде всего должен содержать спиральной формы бактерий. Не использовать инокуляты, если большинство бактерий у коккоидный морфологии, как эти формы не являются жизнеспособными и не будет устанавливать инфекции у мышей. -
Оценить количество бактерий в посевным материалом, подсчета при фазово-контрастной микроскопии приблизительное количество бактерий на поле (100 X цель) и используя следующее руководство: 1 бактерии на поле = приблизительно 10 единиц (6 ) формирования колонии CFU) из Helicobacter/мл; 10 бактерий на поле = приблизительно 107 кое/мл; 100 бактерий на поле = приблизительно 108 кое/мл, и т.д.
- При использовании haemocytometer, вычислите кое/мл, по следующей формуле:
КОЕ/мл = (среднее количество бактерий в поле 4 x 4) x (коэффициент разрежения) x (104).
- При использовании haemocytometer, вычислите кое/мл, по следующей формуле:
-
При необходимости отрегулируйте плотность бактериальной клетке посевным материалом для приблизительно 107– 108 кое/мл путем разбавления в BHI бульон.
- Для обеспечения максимальной жизнеспособности бактериальных, используйте инокуляты для внутрижелудочного затравки как можно скорее после подготовки.
- Всегда подтверждают пилорусов плотность клеток и жизнеспособности, выполняя жизнеспособных подсчета инокуляты сразу же после кормления процедуры (см. ниже). Это не всегда возможно для H. felis, как обычно не образуют отдельных колоний в культуре средств массовой информации. Количество жизнеспособных Helicobacters в инокуляты не может определяться измерения оптической плотности (600) только как этот метод не делает различий между жизнеспособным (т.е., бациллярная/спираль/винтовой) и нежизнеспособных ( т.е., коккоидный) бактерий.
- Используйте значения оптической плотности как средства оценки числа жизнеспособных H. пилори бактерий в инокуляты, но в данном случае, это сначала необходимо создать кривую роста. Для этого значения600 A H. пилори культур со временем и коррелировать непосредственно против числа жизнеспособных бактерий, определяется путем подсчета пластины.
Примечание: Удобный способ для выполнения таких определений кривая роста является культуры бактерий в жидкой среде (раздел 1.2), используя стандартные плоское дно колбы культуры ткани помещены в инкубатор 10% CO2 . Количество CFUs, определяется от аликвоты культур, полученных каждые 4-6 ч за 2-3 дня, затем по сравнению с соответствующего значения600 17. Важно отметить, что кривые роста должен быть создан для каждого штамма Helicobacter pylori , как они могут растут с разной скоростью, и, Кроме того, не все штаммы хорошо растут в 10% CO2.
2. внутрижелудочного затравки мышей с Helicobacter
Примечание: Этот метод внутрижелудочного затравки могут применяться для других бактериальных видов, которые колонизировали кишки например S. TyphimuriumC. rodentium, листерий.
- 6 – 8-недельных, конкретного возбудителя бесплатно (SPF) и Helicobacter-бесплатно мышей мужского или женского пола. Использование животных с C57BL/6 генетическим фоном для экспериментов инфекции Helicobacter pylori или H. felis. В настоящем исследовании мы использовали одичал тип (WT) и генетически измененных мышей C57BL/6, не хватает ключевой врожденной иммунной рецептор (называемых нокаут- или KO животных).
Примечание: Мышей на других генетических стола может также использоваться для инфекции Helicobacter , однако, уровень колонизации и тяжести заболевания могут быть затронуты тип хоста фон18,19. - Аспирационная бактериальных посевным материалом (шаг 1.5) в 1 мл одноразовые шприцы и заменить предоставленного иглы с 23 датчик иглы, на которые являются несъемной одноразовые полиэтиленовые катетеры (длина, 6 – 8 см, внутренний диаметр, 0,58 мм). Закрепите катетеры для иглы, применение мелкие полоски пластика фильм (см. Таблицу материалы). В качестве альтернативы заменить сборку иглы/катетер с помощью стерильных пластиковых кормления трубы (20 калибра x 38 мм).
- Физически удержать мышей с крепко в загривок шею и хвост.
Примечание: Эта процедура может быть выполнена без анестезии, или альтернативно, с применением ингаляционной анестезии, например Метоксифлуран или изофлюрановая15. - Вставьте катетер в центре открытой челюсти и руководство в хвостовой направлении пищевода. Расширять шею мыши для упрощения доступа к желудка через пищевод (и от трахеи) до наиболее или катетер все больше не видна и ощущается сопротивление, соответствующий базе желудка. Доставить конкретных Алиготе, обычно 100 мкл на вакцинацию (рис. 1).
Примечание: Мышь должна быть gavaged с ≥ 105 кое для обеспечения оптимального патологии колонизации и болезни. - Дом мышей в объекте животных SPF для продолжительности эксперимента.
Примечание: Тяжелой патологии и аденокарциномы в WT C57BL/6 мышей только наблюдается приблизительно 24 месяцев послеоперационные инфекции20. Однако этот эффект может быть ускорен в некоторых генетически модифицированных животных, или мышей с других генетических стола. - После завершения процедуры принудительного кормления, выполнить изменение мили и Мисра методики для определения числа жизнеспособных H. пилори бактерий вводят мышей. Для этого, посевным материалом серийно разводили (от 10−1 до 10−5) в BHI, используя метод, описанный ранее подробно15.
Примечание: Для обеспечения изоляции одного колоний, HBA пластины должны быть утепленные и сушат в биологической безопасности кабинета или 37 ° C инкубатор для 10 – 15 мин до использования.
3. заготовка тканей от мышей после эксперимента
- Усыпить мышей Вдыхание углекислого газа или шейки матки вывих, согласно соответствующих этике для экспериментов на животных.
- Откройте брюшной полости и акцизных желудка с помощью тонкой, изогнутые ножницы.
Примечание: Sera также могут быть собраны путем пункции сердца для оказания помощи в расследовании и систематической реакции на инфекции Helicobacter . Кроме того коллекция селезенки и лимфатических узлов paragastric полезны в изучении адаптивного иммунного ответа. - Разрезать вдоль большей кривизной желудка и удаление остатков пищи, нежной стирки в стерильных фосфат буфер солевой (PBS) в 50 мл трубки.
- Промывание желудка снова в стерильных PBS, а затем запись живого веса, с использованием пластиковых чашек Петри тарированного 6 см.
- Сгладить живот и вскрыть sagittally на два равных ткани фрагменты, каждый состоит из: антрального, тело и не железистой немутогенных регионов (рис. 2). Удаление номера железистой региона и весят один половину каждого желудок перед добавлением либо 1 мл стерильного BHI (для жизнеспособных подсчета) или оснастки, замораживание в жидком азоте (для извлечения ДНК/РНК).
Примечание: Пробирки, содержащие ткани в BHI должны храниться на льду, пока они не готовы для обработки. Оснастки, замороженные желудка тканей также может использоваться для извлечения РНК и белков для ПЦР (Количественная ПЦР) или западных blotting анализа, соответственно. - Добавьте другие желудка от половины до 15 мл, содержащих формалина 10%. Погружать тканей в 10% формалина 10 s и затем придавить на верхней стороне трубы. Разрешить тканей исправить перед повторной погружением в раствор формалина 10% для минимум 24 часа.
Примечание: Ткани могут оставаться в формалина 10% для многих недель до обработки для гистологии. Длительного хранения ткани может однако, повлиять на его архитектура и/или антигенностью, что приводит к югу оптимальные результаты в нижнем анализы.
4. подтверждение бактериальной колонизации в послеоперационные инфекции желудка
-
Жизнеспособные подсчет Helicobacter pylori в желудке
- Дополнение стерильные HBA пластины с дополнительной антибиотики (200 мкг/мл Бацитрацин и naladixic кислота 10 мкг/мл) до выполнения колонии графов из зараженных мыши желудки16.
- Однородный желудка секций либо вручную, с помощью автоклавируемый полипропиленовые micropestles, или с помощью инструмента механическим диссоциации (см. Таблицу материалы).
- Подготовьте повторяющиеся серийных разведений (10−1 до 10−2) в результате желудка гомогенатах в стерильных BHI.
Примечание: Разведений должен решаться на основании типичных бактериальной нагрузки, полученные для данного пилорусов штамм, используемых для инфекции, а также продолжительность инфекции. Может также использоваться неразбавленной пробы. - Предварительно высушенного пластины адаптера (см. примечание выше) делят на три или четыре сегмента. С помощью адаптация метода мили и Мисра, добавить 10 – 100 мл каждого разведения на сегмент плиты агара и распространение с помощью стерильных пластиковых петель15.
- Разрешить пластины для просушки, а затем поместить их в перевернутом положении (крышка стороной вниз) в анаэробной газа банки. Для поддержания влажности в банки, включают чашку Петри, содержащих воду.
- Инкубируйте банки при 37 ° C, до тех пор, пока колонии формируют (обычно 4-7 дней).
- Перечисление, сегмент, содержащий между 10 и 100 изолированной колонии.
Примечание: Пилорусов колоний и H. felis роста на пластины можно отличить от других членов мышиных желудка микробиоты, с использованием стандартных уреазы, каталазы и оксидазы тестов. H. pylori и H. felis положительны для всех трех тестов. - Рассчитать бактериальной нагрузки (CFU/g ткани), с использованием следующей формулы:
[(Среднее количество колоний подсчитано) × (коэффициент разрежения) x (размер покрытием)] / (живот вес).
-
Обнаружение инфекции H. felis в тканях желудка полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- Извлечь ДНК из желудков мыши, используя стандартные протоколы изоляции дна, или коммерчески доступных kit.
- Определение концентрации ДНК образцов с помощью флуориметрический количественный метод (см. Таблицу материалы).
- Настройка ориентации пары 325-base (bp) фрагмент H. felis уреазы B гена (ureB)21реакций PCR. Каждая реакция должна содержать: 100 нг геномной ДНК; 1 мм Форвард (5'-AAA УВД CAC ГАА GAC TGG GG-3') и обратного (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC АКК-3') грунты; дНТФ 200 мм; 0,5 единицы полимеразы Taq и соответствующее количество буфера и нуклеиназы свободной воды.
Примечание: Эта пара олигонуклеотида была разработана признать и выполнить привязку к гомологичных последовательностей в Helicobacter pylori и H. felis ureB генов, но когда они подвергаются воздействию условий PCR ниже, не присутствующие в ureB гены энтерогепатической Helicobacter spp. - Выполнять амплификации PCR, используя следующие теплового профиля: Отопление на 94 ° C за 5 мин, после 35 циклов 94 ° C за 30 s, 61 ° C за 30 s и 72 ° C в течение 1 мин, до проведения при 20 ° C.
- Запуск продуктов ПЦР на 2% агарозном геле на 30 мин в 100 V.
5. гистологические анализы Helicobacter -инфицированных мыши желудка секций
- Обработка тканей живота
- Удаление ткани желудка с формалином и место в чистой Петри.
- Cut ткани желудка с помощью скальпеля на несколько одинакового размера продольные полоски (каждый 2-3 мм толщиной) и место в маркированных внедрения кассеты, содержащие пены обивка.
- Исправьте ткани желудка, поместив внедрения кассеты в сосуд, наполненный 80% этанола.
Примечание: Желудков может быть обработано или хранить до 1 – 2 дней перед переходом к следующему шагу. - Процесс пищеварения на процессоре автоматизированной ткани, запрограммированы с следующими параметрами:
Обезвоживание: 70% этанол - 1 цикл, 20 мин; 90% этанола - 1 цикл, 20 мин; 100% этанола - 2 цикла, 20 мин + 1 цикл, цикл 40 min + 1, 1 ч.
Клиринг: Ксилол-2 цикла, 30 мин + 1 цикл, 45 мин.
Пропитка: Парафин при 60 ° C - 1 цикл, 45 мин + 1 цикла, цикл 1 h + 1, 1.25 h. - Удалите обработанные образцы из машины и хранить при комнатной температуре для встраивания парафина.
- Парафин встраивание обработанные ткани желудка
- Место базовой формы из нержавеющей стали на сцене блоком внедрения основ формы теплой.
Примечание: Встраивание машины должны устанавливаться при 60 ° C для внедрения эффективных парафина. - Место воском кассеты, содержащие образцы в теплый воск Ванна/горячая плита зону вложения группы до тех пор, пока воск полностью растворяется.
Примечание: Рекомендуется, чтобы образец был внедрен вскоре после того, как растворяет воск. Это гарантирует, что упрочнения тканей не происходит. - Заполните половину формы из нержавеющей стали с парафина. Использование теплой щипцы, удалите полоски ткани желудка от кассет и осторожно вставляйте желудка полосы через парафина на базе формы. Тщательно ориентироваться полоски ткани под прямым углом к основанию формы таким образом, чтобы их нарезанный концы сталкиваются вверх.
Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены как можно быстрее избежать затвердевания и разделения слоев парафина в пределах встроенных блоков. Правильной ориентации ткани желудка имеет решающее значение для анализа ниже по течению. - Место формы на холодную тарелку внедрения подразделения исправить образцы на месте и переориентировать тканей, при необходимости.
Примечание: Если ткани становится выбили и парафина начинает затвердевать, место формы обратно на горячей пластине растопить воск и повторно вставлять тканей в формы. - Место половина помечены внедрения кассет (которые были использованы для обработки ткани) на верхней части формы и аккуратно заполнить с теплым воском. Не позволяйте парафин для переполнения.
- Осторожно поместите плесени на холодную тарелку и дайте ему остыть.
- После того, как задано полностью парафина, отдельные внедренные блоки от плесени. Чистого избыток парафина на кассету края с помощью плита (изложенными выше 80 ° C) или скребком. Блоки могут храниться при комнатной температуре до тех пор, пока выполняется секционирование.
- Место базовой формы из нержавеющей стали на сцене блоком внедрения основ формы теплой.
- Секционирование тканей
- Расслабиться блоков парафин врезанных тканей на льду и нагреть на водяной бане, сверхчистый водой до 40 – 45 ° C.
- Закрепите лезвие в держатель микротома и установите задний угол между 1 – 5° для предотвращения контакта между блок лицо и нож аспект, перед вставкой парафиновых блоков.
Примечание: Убедитесь, что блоки ясно избыток парафина, приобретенные от внедрения, как это может помешать fit блока. - Ориентировать лезвие для разрубом через блок. Аккуратно вырежьте 2-3 шлифов обеспечить правильное позиционирование блока.
- Обрезки блоков толщиной примерно 10 – 30 мм. Этот шаг гарантирует, что будет сократить максимальную площадь поверхности каждой полосы ткани.
- Вырежьте 10 мкм секций и отменить любые, которые содержат отверстия, вызванных обрезки.
- Тщательно подобрать разделов с помощью пинцета и плавают их в водяной бане для рихтовки. Используйте щипчики для разделения каждого раздела.
- Собираем разделы на водяной бане и место на заряженных стеклянных скольжениях (см. Таблицу материалы).
- Хранить вертикально в стойку слайдов слайды и место в инкубаторе при 37 ° C. Сухой разделы на ночь.
- Хранить разделы при комнатной температуре на неопределенный срок для последующего анализа.
- Гематоксилин и эозином (H & E) окрашивания тканей живота
- DEWAX слайды с помощью 3 моет ксилол 5 минут каждый, следуют 3 стирок в 100% этаноле, 3 мин. Убедитесь, что на каждом этапе используются свежие решения.
- Слайды промывайте в проточной воде в течение 30-60 сек.
- Удалите излишки воды, осторожно нажав в нижней части слайдов на бумажное полотенце. Пятно с отфильтрованной гематоксилин на 3 мин убедитесь, что достаточно разделов с решением.
- Промойте слайды под проточной водой до тех пор, пока вода течет ясно.
- Окуните слайды Скотта в воде из крана на 8 – 10 s. Не подвергайте слайды, в решение более чем 10 s как это приведет к интенсивным и темные пятна. Окрашивание участков можно рассматривать под микроскопом. Эффективное окрашивания на данном этапе приведет к «baby blue» цвет.
Примечание: Подготовьте Скотта водопроводной воды растворяют в 2 г, натрия гидрокарбоната (NaHCO3) и 20 г сульфата магния (MgSO4) в 1 Л дистиллированной воды. - Слайды промывайте в проточной воде в течение 30-60 сек.
- Удалите лишнюю воду, как описано в шаге 3 и затем пятно с отфильтрованной 1% водного раствора эозина за 3 мин.
- Промойте слайды под проточной водой до тех пор, пока вода течет ясно.
Примечание: Пятнать может оцениваться с использованием световой микроскоп. Если окрашивание слишком темный, слайды можно обезвоженной в 100% этанола дольше указанного времени. Если требуется более темной окраски, слайды смогите быть запятнано с эозином для 1 – 2 мин дольше, до разбирательства последующие шаги. - Обезвоживает слайды с помощью 3 моет 100% этанола для 30 s каждый, а затем 3 моет ксилоле 2 мин. Убедитесь, что на каждом этапе используются свежие решения.
- Смонтируйте слайды с монтажа средних. Добавьте каплю монтажа средних в центре чистой coverslip до нежно размещения слайдов на вершине с разделами вниз.
Примечание: Не сушите слайды до покрытие скольжения. - Место слайды на плоскую поверхность и дать высохнуть. Слайды можно также высушить Зонта ускорить время сушки.
- Гимза окрашивания тканей живота
- DEWAX слайды с помощью 2 смывки histolene за 5 минут, затем 2 моет 100% этанола на 3 мин, а затем окончательный мыть в 70% этанол на 3 мин обеспечить для каждой стирки используются свежие решения.
- Слайды промывайте в проточной воде в течение 30-60 сек.
- Готовят раствор Гимза, смешивая Гимзе 20% 80% дистиллированной водой. Пятно слайды с раствором Гимза за 1 час.
- Место слайды в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 3 – 4 капли уксусной кислоты для 2-3 s.
Примечание: Раствор необходимо перемешать хорошо до использования. На данном этапе слайды должны появиться бледно-голубого цвета. - Вымойте слайды в этанол 96% для 30 s.
- Вымойте слайды в 3 бани изопропанола для 2 мин каждая, следуют 3 бани histolene на 2 мин. Используйте свежие изопропанол и histolene для каждой стирки.
- Coverslip слайды с монтажа средний, как описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает метод пероральная затравка для достижения внутрижелудочного инфекция с Helicobacter pylori или H. felis в мышиных мыши модели (рис. 1). После эвтаназии желудки удалены, взвешиваются и разделен на 2 равные половины, включающий антрального, тело и не железистой регионов желудка тканей (рис. 2). Не железистой региона удаляется перед выполнением каких-либо анализов.
Успешной колонизации животных обычно подтвердил, выполняя жизнеспособных рассчитывает на H. pylori-инфицированных желудка гомогенатах и впоследствии перечисление отдельных колоний на HBA пластины (рис. 3). Кроме того ПЦР используется для проверки инфекции с H. felis с помощью конкретных, проверяемое грунтовки, направленных на 325 bp региона H. felis и H. пилори ureB генов (рис. 4).
Желудка ткани обрабатываются, встраиваемых и секционного течению гистологические приложений. H & E техника окрашивания используется для оценки гистопатология в Helicobacter-инфицированных мышей. В текущем примере WT C57BL/6 мышей отображения умеренные признаки воспаления, в том числе гиперплазия (расширенного слизистой оболочки) и атрофию желез на 6 месяцев послеоперационные инфекции с H. felis. Наличие клеточных инфильтратов может также наблюдаться в суб слизистой. Интересно однако, более тяжелое воспаление наблюдается в KO мышей в той же точке времени, с дополнительной наличие лимфоидных фолликулах, расположенный в непосредственной близости от клеточных инфильтратов (рис. 5). Наконец бактерии H. felis наблюдаются в пятнами Гимза разделах зараженные мыши желудков (рис. 6).
Рисунок 1: изображения, демонстрируя технику пероральная затравка. Одноразовые 1 мл шприц и гибкий катетер используются для доставки ≥105 кое бактериального инокуляты мыши через внутрижелудочного маршрут. Мышь был под наркозом с использованием Метоксифлуран и состоявшейся в крепко на шее, позволяющие доступ катетера через пищевода в желудок.
Рисунок 2: мышь селезенки и желудки послеоперационные инфекции. Мышь желудки были собранного после эвтаназии и их содержимое, удаляется соскоб с помощью скальпеля и стирки в стерильных PBS. Ткани были затем весил и выравнивается на листе хлопка выявить 2 равные половины, каждый состоит из желудка антрального, тело и не железистой регионов; Шкалы бар = 10 мм.
Рисунок 3: Жизнеспособных рассчитывает на H. pylori -инфицированных мыши желудков. Мышей на фоне C57BL/6 были привиты с 107 кое пилорусов SS1 и уехал в 8 недель. (A) разведений каждого желудка огневки покрытием на половину (или третий) HBA пластины и бактериальной нагрузки, оценены перечисление отдельных колоний 10-100. В левой половине панели показывает чистой культуры H. пилори бактерий. (B) наличие загрязняющих бактерий от мыши желудка микробиоты (слева) или большое количество колоний Helicobacter pylori (справа) могут усложнить перечисление CFUs Helicobacter pylori . (C) Общие примеры загрязнения бактерий в образцах желудка огневки. Шкалы бар = 1.7 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: ПЦР обнаружение инфекции H. felis в желудка биопсий, используя олигонуклеотиды, ориентация гена ureB . Пару конкретных олигонуклеотида был призван признать и выполнить привязку к гомологичных последовательностей в H. felis и H. пилори ureB генов. Эти грунты были проверены с использованием геномной ДНК от пилорусов SS1 (пер. 2) или H. felis (пер. 3). Деионизированная вода была включена в качестве отрицательного контроля (полоса 1).
Рисунок 5: Представитель изображения H & E-окрашенных желудка разделы от WT и KO мышей на 6 месяцев послеоперационные инфекции с H. felis. Парафин врезанных тканей разделы были окрашенных с H & E. WT мышей получения BHI бульон только (управления) был нормальный эпителий желудка и нет значительного воспаления. В отличие от WT животных с хронической H. felis инфекции отображается умеренный уровень воспаления и слизистой утолщение, который был еще усугубляется в H. felis-инфицированных животных KO. Разделах ткани от H. felis-инфицированных мышей KO выставлены присутствие слизистой лимфоидных фолликулов (*), клеточных инфильтратов (→), атрофию желез (▶) и гиперплазии. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Представитель изображения участков пятнами Гимза желудка от мышей C57BL/6 WT на 3 месяца после инфекции с H. felis. Парафин врезанных тканей разделы были покрыт пятнами Гимза. Стрелки указывают на наличие H. felis в желудочных желез. Шкалы бар = 200 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает использование модели мыши в естественных условиях для инфекции Helicobacter . Важнейшие шаги процедуры являются: 1) подготовка Helicobacter инокуляты, содержащие жизнеспособные и подвижные бактерий; 2) доставки соответствующего числа бактерий к мыши через внутрижелудочного кормления; 3) обнаружение бактериальной инфекции путем подсчета колонии и/или ПЦР; и 4) обработка желудка тканей для включения оценки гистопатология в инфицированных желудков. Дальнейшие предложения по модификации, устранения неполадок и технических соображений, обсуждаются ниже.
Метод выращивания Helicobacter spp., с помощью крови агар база № 2 с лошади крови была хорошо известна в нашей лаборатории. Однако альтернативные агар баз, таких как бруцеллы агар и агар Columbia крови также может быть использоваться22. Важно гарантировать, что только стерильные посуда, которая свободна от моющих средств используется для подготовки среднего роста. Кроме того для получения оптимального роста, H. пилори бактерий должно регулярно subcultured на плиты агара, которые имеют остаточную влагу и не сухой. При подготовке Helicobacter spp. инокуляты инфекции, важно для субкультуры Helicobacter pylori и H. felis штаммов каждые 1 – 1,5 или 2 дней, соответственно, обеспечить жизнеспособность бактерий. На каждой субкультуры бактерии должна определяться для их жизнеспособности и моторики фазово-контрастной микроскопии. Уреазы пробирного также регулярно используются для различения желудка Helicobacter spp. и другие бактерии23, однако, важно понимать, что этот assay обнаруживает жизнеспособных и нежизнеспособных бактерии Helicobacter . После прививки животных жизнеспособных рассчитывает на Helicobacter подвески должны выполняться чтобы quantitate числа жизнеспособных бактерий для инфекции. Как H. felis можно воспроизвести не образуют изолированной колонии на агаре средних15, оценка бактериальной чисел осуществляется с помощью фазово-контрастной микроскопии. Количественная оценка бактериальной чисел путем измерения оптической плотности (600) только является неточной, поскольку этот метод не различать жизнеспособных и нежизнеспособных бактерий. Этот метод не должен использоваться в исследованиях Helicobacter без строгого оптимизации, как описано выше (раздел 1.5).
При выполнении исследования инфекции Helicobacter , важно рассмотреть оптимальные мыши и штамма Helicobacter , а также продолжительность инфекции, чтобы удовлетворить Цель эксперимента. Важно также регулярно подтверждают, что животных, используемых для экспериментов, действительно Helicobacter-бесплатно, используя род конкретного ПЦР праймеры24. Присутствие других кишечных Helicobacter видов, таких как Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus или Helicobacter muridarum, может изменить восприимчивость к болезням мышей и ввести отягощающих факторов в в vivo исследований25,26. Это также целесообразно включить в первоначальный отбор экспериментов для изучения воздействия обычных микробиоты на Helicobacter колонизации и патогенез макет лечения контрольной группе животных (т.е., кормили только бульон).
После эвтаназии, Helicobacter pylori колонизации в мышиных желудков может быть измерен жизнеспособных подсчета. HBA пластин, используемых для графов колонии должна быть дополнена Бацитрацин и naladixic кислоты в дополнение к изменение Скирроу селективного дополнение, ограничить рост бактерий видов от нормальной микрофлору желудка и таким образом предотвратить загрязнение 27. H. felis не всегда образуют колонии, но вместо этого стремится сформировать кишат роста агар пластины15,28. Таким образом ПЦР и ПЦР обычно используются для определения наличия и уровня H. felis, соответственно29,30. В разделе 4.2, мы ввели простой и быстрый метод ПЦР для подтверждения колонизации H. felis в мышиных желудка с помощью пары праймеров, которые были проверены Целевой 325 bp региона H. felis и пилорусов ureB генов. С помощью ПЦР условий, описанных выше, можно различать инфекции, эти желудка Helicobacter spp. и производству уреазы энтерогепатической Helicobacters. Других генов, которые были проверены для ПЦР обнаружение инфекции желудка Helicobacter включают 16s рРНК и Флагеллин B (вялые мускулы) гены15,29,30.
Наконец, мы описали использование двух мощных пятная методов: H & E, окрашивание, оценить гистопатологические изменения в послеоперационные инфекции желудка; и окрашивание, для выявления инфекции H. felis Гимза. Для получения оптимального окрашивание, важно обеспечить что тканей были сохранены, обработаны и встроенных в правильной ориентации. Кроме того только свежезаваренным подготовлен решения и фильтруют пятна должны использоваться в ходе этого процесса. Разделах ткани можно хранить бессрочно и используются для более конкретного анализа патологии желудка через иммунофлюоресценции или иммуногистохимия. Некоторые другие общие меры воспаление желудка и болезней включают: набор иммунных клеток (анти CD45 окрашивание); слизистых оболочек утолщение/уничтожение (периодическая кислоты Шифф/Альциановый синий окрашивание); Пролиферация эпителиальных клеток (пролиферирующих клеток ядерного антигена, PCNA/Бромдезоксиуридин, BrDU окрашивание); или сотовой апоптоз (TUNEL окрашивание). Лимфоидных фолликулах, наблюдаемые в H & E-окрашенных тканей H. felis -инфицированных мышей может быть подтверждена иммуногистохимии, используя антитела, направленные против B (B220+) и Т-клеток (CD3+) антигены31.
В резюме животных моделей бактериальных болезней обеспечивают ценные инструменты в области биологии инфекции. Протоколы внутрижелудочного кормления и обработки ткани желудка представлена здесь могут быть адаптированы к инфекции моделей мышей с участием других кишечных патогенов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить г-жа A. де Паоли и г-жа Джорджи Рей-McCann для оказания технической помощи. Авторы признают, что использование средств и технической помощи Монаш гистология платформы, кафедра анатомии и биологии развития, Университет Монаш. Лаборатория поддерживает финансирование от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) RLF (APP1079930, APP1107930). RLF поддерживается старший стипендия исследований NHMRC (APP1079904). KD и MC поддерживаются в Монаш выпускник стипендии. KD также поддерживается центром врожденного иммунитета и инфекционные заболевания, Гудзоновский институт медицинских исследований, в то время как MC имеет международной аспирантов стипендии от факультета медицины, медсестер и медицинских наук, Университет Монаш. Исследования в Институте медицинских исследований Хадсон поддерживается викторианской правительство оперативной инфраструктуры поддержки программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
