Summary
小鼠是研究胃肠道微生物感染和疾病的一种宝贵的体内模型。本文介绍了研究幽门螺杆菌相关疾病小鼠模型细菌定植和组织病理学变化的方法。
Abstract
幽门螺杆菌是存在于全球半数人口中的一种胃病原体, 是人类发病率和死亡率的一个重要原因。开发了几种小鼠胃幽门螺杆菌感染模型, 研究了幽门螺旋菌在人体宿主胃中的分子和细胞机制, 并引起疾病。在这里, 我们描述的协议: 1) 通过胃内灌胃制备小鼠体内感染的细菌悬浮液;2) 通过聚合酶链反应 (PCR) 和可行计数确定小鼠胃组织细菌定植水平;3) 通过组织学评估病理变化。为了建立小鼠Helicobacter 感染, 特定的无病原体 (SPF) 动物首先接种悬浮液 (包含≥105菌落形成单位, CFUs) 的小鼠殖民菌株的幽门螺杆菌或幽门螺杆菌等动物的其他胃幽门螺杆菌河猫。在适当的时间点后感染, 胃被切除和解剖弧矢成两个相等的组织片段, 每个组成的窦和身体区域。其中一个片段, 然后用于可行计数或 DNA 提取, 而另一种是受到组织学处理。在胃组织切片染色与沃辛瘤-星光, 姬姆萨或 Haematoxylin 和伊红 (H & E) 污渍的情况下, 可能定期评估胃肠细菌的殖民化和组织学变化。其他免疫学分析也可以通过免疫组化或免疫荧光法对小鼠胃组织切片进行。下面所述的协议是专门设计的, 能够对类似于人体相关的幽门螺杆菌疾病的小鼠进行评估, 包括炎症、腺体萎缩和淋巴毛囊形成。接种剂的制备和胃内灌胃协议也可用于研究其他肠道人类病原体, 如鼠伤寒沙门氏菌或柠檬酸 rodentium的殖民化老鼠的发病机制。
Introduction
幽门螺杆菌是一种螺旋状, 革兰阴性, 人胃病原体存在于世界各地的所有人群中, 发展中国家的感染率估计为 80%1。虽然大多数幽门螺杆菌感染的个体是无症状的, 一些发展更严重的疾病, 从消化性溃疡到胃癌2。幽门螺杆菌相关的癌症广泛的特点要么是恶性变化的上皮细胞 (风险) 或形成的额外淋巴结淋巴组织在胃, 导致胃腺癌或粘膜相关的淋巴组织 (麦芽) 淋巴瘤, 分别。幽门螺杆菌是高度适应的生存在恶劣的生态利基的胃由于存在各种致病因素和机制, 促进其在这个利基的坚持, 生长和新陈代谢。特别是,幽门螺杆菌的毒株具有 40 kb cag致病性岛 (cag), 用于编码生产4型分泌系统所需的大约30个基因 (T4SS)3,4.cag排阳性幽门螺杆菌菌株与宿主中更高水平的慢性炎症有关, 这已被牵连为胃腺癌5的重要前兆。
在体内动物模型, 特别是小鼠, 通过允许研究人员调查宿主、细菌和环境因素对幽门螺杆菌感染和疾病结果6的相对贡献, 获得了高度的信息。研究表明, 长时间幽门螺杆菌感染的小鼠在 C57BL/6 的遗传背景下, 导致慢性胃炎和腺萎缩的发展, 这两个特点是幽门螺杆菌感染7。此外, 感染与相关的猫/犬细菌种类,河猫, 已被证明诱导麦芽形成在类似的病理和疾病进展的小鼠在人类麦芽淋巴瘤8,9。在小鼠殖民学研究中最常用的幽门螺杆菌是 "悉尼菌株 1" (SS1) 菌株10, 这是cagPAI+但有一个非功能性 T4SS (T4SS−)11。其他广泛使用的菌株包括幽门螺杆菌B128 7.13 (cag排+/T4SS+)12和 X47-2AL (cag-/T4SS−)13。对于H. 河猫感染, 应变 CS1 ("Cat 螺旋 1", cagT4SS−) 通常使用14.
在这里, 我们提供了一个协议, 描述了在体内感染的幽门螺菌剂的制备, 小鼠胃内灌胃的程序, 以及组织的处理方法病理学改变的研究在胃里。特别是, 本文将重点介绍用于形象化细菌殖民化的组织学方法, 并评估感染小鼠胃黏膜中的组织学变化, 包括麦芽的形成。这里描述的一些方法可以适应其他肠道病原体的研究, 如S.鼠伤寒或rodentium。
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Protocol
1. 细菌菌剂的生长与制备
- 将幽门螺杆菌或h. 河猫15的甘油从-80 摄氏度解冻, 并在马血琼脂 (HBA) 板上进行亚型, 包括: 血琼脂碱 2 (见材料表);一种改良的 "Skirrow 抗生素选择性补充剂" (包括万古霉素, 10 微克/毫升; 多粘菌 b, 25 ng/毫升; 甲氧苄啶, 5 µg/毫升; 两性不变性 b, 2.5 微克/毫升);和 5–10% (v/v) 马血15,16。细菌在微好氧条件下生长良好, 在2.5 或 3.5 L 厌氧罐中含有适当的气体包 (见材料表), 在37摄氏度。
注意: 在这些条件下生长的幽门螺杆菌在1–1.5 天孵育后必须传代, 而对于河猫, 通常需要至少2天的孵育。前15详细描述了合适的培养基和存储介质。 -
准备细菌菌剂早期到中期的对数阶段培养的小鼠感染。通过将每块盘子浸在脑心输液 (BHI) 汤中, 轻轻地从琼脂板中收获细菌。用巴斯德移液器从盘子中吸出悬浮液。
- 或者, 在 16–18 h15中, 从 BHI 汤中传播的幽门螺杆菌中制备菌剂。在这种情况下, 以 2200 x g的低速离心收集细菌, 10 分钟, 在4摄氏度。
- 通过在相比较显微镜下检查湿式安装制剂 (100X 物镜), 评估细菌的生存能力和运动性。在玻璃显微镜幻灯片上重悬取10–20微升液滴中的细菌, 准备湿坐骑。在河猫的情况下, 这是一个比幽门螺杆菌大得多的细菌, 使用血细胞计数器准确地计算存活细菌的数量。通过执行革兰氏染色确认培养纯度。
注意: 仅使用H. 幽门螺杆菌菌剂如果大多数细菌有杆菌或螺旋状 (形态学可以根据应变变化)。河猫菌剂应主要包含螺旋状细菌.如果大多数细菌都有球形形态学, 不要使用菌剂, 因为这些形态是不可行的, 不会在小鼠身上形成感染。 -
通过在相比较显微镜下计数来估计接种菌的数量每场细菌的近似数量 (100X 目标) 和使用以下指南: 1 细菌每场 = 约 106菌落形成单位 ()幽门螺杆菌/毫升;每场10细菌 = 约 107菌落/毫升;每场100细菌 = 约 108菌落/毫升,等等.
- 使用血细胞计数器时, 使用以下公式计算 CFU/mL:
4 x 4 字段中细菌的平均数量 x (稀释因子) x (104)。
- 使用血细胞计数器时, 使用以下公式计算 CFU/mL:
-
如有必要, 通过稀释 BHI 肉汤, 将接种菌的细菌细胞密度调整到约 107–108 CFU/毫升。
- 为确保最大的细菌活性, 在制备后尽快使用菌剂胃内灌胃。
- 在灌胃程序后立即进行菌剂的存活计数, 以确认幽门螺杆菌细胞密度和存活能力 (见下文)。这并不总是可能的河猫, 因为它通常不会形成孤立的殖民地在文化媒体。菌剂中可行的幽门螺杆菌的数量不能通过光密度测量 (600) 来确定, 因为这种方法不区分可行 (即细菌/螺旋/螺旋线) 和非可行 (即球形) 细菌。
- 使用光学密度值作为估计菌剂中可行的幽门螺杆菌的数量的方法, 但在这种情况下, 首先需要生成生长曲线。为此,600的幽门螺杆菌培养值随着时间的推移而被监测, 并直接与存活的细菌数量相关, 由板块计数确定。
注意: 一个方便的方法来执行这种生长曲线确定是培养细菌在液体培养基 (第1.2 节), 使用标准平底组织培养烧瓶放置在10% 共2孵化器。CFUs 的数量, 从等份的文化中获得的每 4–6 h 超过了在所有的天, 然后比较到相应的600值17。重要的是, 必须为每一个幽门螺杆菌菌株生成生长曲线, 因为它们可能以不同的速率生长, 而且并非所有菌株在 10% CO2中生长良好。
2.幽门螺杆菌胃内灌胃的实验研究
注意: 这种胃内灌胃的方法可以应用于其他细菌物种,如肠道.伤寒, C. rodentium,李斯特菌。
- 使用 6–8-周龄, 特定的无病原体 (SPF) 和无幽门螺杆菌或雌性小鼠。使用具有 C57BL/6 遗传背景的动物进行幽门螺杆菌或河猫的感染实验。在本研究中, 我们使用野生型 (WT) 和转基因 C57BL/6 小鼠缺乏一个关键的先天免疫受体 (被称为敲出或 KO 动物)。
注意: 其他遗传背景上的小鼠也可以用于幽门螺杆菌感染, 但是, 殖民化水平和疾病严重性可能受到宿主背景18,19的类型的影响。 - 将细菌接种剂 (步骤 1.5) 吸入一次性的1毫升注射器中, 并用23针将所提供的针头替换成贴有一次性聚乙烯导管 (长度、6–8厘米; 内径 0.58 mm)。应用小条塑料薄膜将导管固定在针头上 (见材料表)。或者, 使用无菌塑料喂料管 (20 个规格 x 38 mm) 更换针头/导管组件。
- 在颈部和尾巴的颈背上牢牢地控制老鼠的身体。
注意: 此程序可在不麻醉的情况下进行, 也可以使用吸入麻醉剂 (如 methoxyflurane 或异氟醚15) 进行。 - 将导管插入开口颚的中心, 并向食管的尾部方向引导。延长鼠标的颈部, 允许通过食道 (远离气管) 进入胃部, 直到导管的大部分或全部不再可见, 并感觉到与胃底部对应的阻力。提供特定的等分, 通常每接种100微升 (图 1)。
注意: 小鼠应与≥ 105孕期, 以确保最佳的殖民化和疾病病理学。 - 在实验期间, 在 SPF 动物设施中的小鼠。
注意: 严重病理和腺癌在 WT C57BL/6 小鼠仅观察在大约24月后感染20。然而, 在某些转基因动物或其他基因背景的小鼠中, 这种效应可能会加速。 - 完成灌胃程序后, 对里程和 Misra 技术进行修改, 以确定用于小鼠的可行的H. 幽门螺杆菌细菌数量。为此, 在 BHI 使用详细描述的方法之前15, 接种剂从 10−1到 10−5的顺序稀释。
注意: 为了确保单个菌落的隔离, 在使用前, HBA 板应在生物安全柜或37摄氏度孵化器中加热和干燥, 10–15分钟。
3. 实验后的小鼠收获组织
- 根据动物实验的相关道德委员会的资料, 安乐死老鼠被二氧化碳吸入或颈椎脱位。
- 用细弯曲的剪刀打开腹腔和胃部。
注: 血清也可通过心脏穿刺收集, 以协助调查幽门螺杆菌感染的系统性反应。此外, 脾和 paragastric 淋巴结的收集在研究适应性免疫反应方面是有用的。 - 用50毫升试管中的无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 温和洗涤, 将胃沿较大曲率切开并去除残余食物。
- 在无菌 PBS 中再次洗胃, 然后使用解压 6 cm 塑料培养皿记录湿重。
- 将胃部扁平并解剖弧矢成两个相等的组织片段, 每个片断包括: 窦、体和非腺前胃弛缓区域 (图 2)。除去非腺区域, 并在增加1毫升无菌 BHI (用于存活计数) 或液氮中的吸附冻结 (用于 DNA/RNA 提取) 之前, 将每个胃部的一半称重。
注: BHI 中含有组织的管子必须储存在冰上, 直到它们准备好处理。Snap 冷冻胃组织也可用于提取 RNA 或蛋白质的定量 PCR (定量分析) 或西方印迹分析, 分别。 - 将另一胃半到15毫升管包含10% 福尔马林。将组织浸泡在10% 福尔马林的十年代, 然后平展到管的顶部。允许组织修复, 然后再浸泡在10% 福尔马林溶液中至少24小时。
注: 组织可在处理组织学前的数周内保持10% 福尔马林。然而, 长时间的组织储存可能会影响其结构和/或抗原性, 从而导致下游分析中的次优结果。
4. 确认胃后感染后细菌的定植
-
胃中幽门螺杆菌的存活计数
- 补充无菌 HBA 板与额外的抗生素 (200 微克/毫升杆菌肽和10微克/毫升 naladixic 酸) 之前执行菌落计数从受感染的鼠标胃16。
- 用可高压灭菌的聚丙烯 micropestles 或使用机械分离仪 (见材料表) 手动匀质胃节。
- 在无菌 BHI 中制备重复的串联稀释 (10−1至 10−2) 的结果胃匀浆。
注: 稀释应根据所获得的典型细菌荷载来确定, 用于感染的幽门螺杆菌菌株, 以及感染的持续时间。也可以使用未稀释的样品。 - 将预干燥的 HBA 板 (见上文注释) 划分为三或四段。使用里程和 Misra 技术的适应, 添加10–100毫升的每个稀释到琼脂板的一段和传播使用无菌塑料循环15。
- 使板材干燥, 然后将它们放置在厌氧菌气瓶中的倒置位置 (盖子侧下)。为了保持罐中的湿度, 包括含有水的培养皿。
- 孵育罐在37摄氏度, 直到殖民地形式 (通常4–7天)。
- 枚举包含10到100个独立殖民地之间的线段。
注:幽门螺杆菌菌落和河猫生长在板上可以区别于其他成员的小鼠胃菌群使用标准脲酶, 过氧化氢酶和氧化酶测试。幽门螺杆菌和河猫对所有三项试验都是阳性的。 - 使用以下公式计算细菌负载 (组织的 CFU/g):
[(平均数量的菌落计数) x (稀释因子) x-(卷镀)]/(胃重量)。
-
聚合酶链反应 (PCR) 检测胃组织中河猫感染
- 使用标准 dna 隔离协议或商业可用试剂盒从鼠标胃中提取 DNA。
- 使用荧光定量技术测定样品的 DNA 浓度 (见材料表)。
- 针对H. 河猫脲酶 B 基因 (多亚单位)21的325基对 (bp) 片段设置 PCR 反应。每个反应应包含: 100 ng 基因组 DNA;1毫米每向前 (5 '-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3 ') 和反向 (5 '-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3 ') 引物;200毫米 dNTPs;0.5 个 Taq 聚合酶的单位和适当数量的缓冲液和无酶核酸水。
注意: 这种寡核苷酸对被设计用于识别和绑定到两个幽门螺杆菌和河猫多亚单位基因中的同源序列, 但当受到以下 PCR 条件时, 而不是在多亚单位中存在肝肠幽门螺杆菌基因。 - 使用以下热剖面进行 PCR 扩增: 在94摄氏度下加热5分钟, 随后35次循环94摄氏度, 三十年代, 61 摄氏度三十年代和72摄氏度1分钟, 然后在20摄氏度下保持。
- 在 100 v 的2% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产品30分钟。
5.幽门螺杆菌感染小鼠胃切片的组织学分析
- 胃组织的处理
- 从福尔马林中取出胃组织, 放在干净的培养皿中。
- 用手术刀将胃组织切成几个等大小的纵条 (每毫米厚), 放置在贴有泡沫衬垫的带标签的嵌入盒中。
- 在装满80% 乙醇的罐子中放置嵌入盒, 修复胃组织。
注意: 在继续下一步之前, 可以立即处理胃, 或将其储存起来, 直至数天。 - 在自动组织处理器上处理胃, 使用以下设置进行编程:
脱水: 70% 乙醇-1 循环, 20 分钟;90% 乙醇-1 循环, 20 分钟;100% 乙醇-2 次循环, 20 分钟每个 + 1 循环, 40 分钟 + 1 循环, 1 h。
清除: 二甲苯–2次循环, 30 分钟每 + 1 循环, 45 分钟。
浸渍: 石蜡在60摄氏度-1 周期, 45 分钟 + 1 周期, 1 小时 + 1 周期, 1.25 h。 - 从机器上取出加工过的样品, 并在室温下贮存石蜡包埋。
- 加工胃组织的石蜡包埋
- 将不锈钢底座模具放置在嵌入单元的舞台上, 以温暖模具的底座。
注: 嵌入机器应设置为60摄氏度, 有效石蜡嵌入。 - 将含样品的蜡质盒放入嵌入单元的热蜡槽/加热板区域, 直至蜡完全溶解。
注: 建议在蜡溶解后不久嵌入样品。这可确保组织的硬化不会发生。 - 用石蜡填充不锈钢模具的一半。使用温暖的镊子, 从磁带中取出胃组织条, 并轻轻地将胃条穿过石蜡到模具的底部。仔细地将组织条在正确的角度定位到模具的底部, 使其切端朝上。
注意: 应尽快执行以下步骤, 以避免在嵌入块内的石蜡层硬化和分离。胃组织的正确定位对下游分析至关重要。 - 将模具放置在嵌入单元的冷板上, 以固定试样并在必要时对组织进行重新定位。
注意: 如果组织变得脱落, 石蜡开始硬化, 将模具放回热板上熔化蜡, 并在模具中重新嵌入组织。 - 将被标记的嵌入盒 (用于组织加工) 的一半放置在模具顶部, 然后轻轻地用热蜡填充。不允许石蜡溢出。
- 轻轻地将模具放在冷板上, 让冷却。
- 一旦石蜡完全设置, 将嵌入的块与模具分开。使用热板 (设置在80摄氏度以上) 或刮刀清洁盒边缘上的多余石蜡。块可以存储在室温下, 直到执行切片。
- 将不锈钢底座模具放置在嵌入单元的舞台上, 以温暖模具的底座。
- 组织切片
- 在冰上冷却石蜡嵌入的组织块, 并加热水浴充满超纯水到40–45°c。
- 将刀片固定在切片机的支架上, 并设置1–5°之间的间隙角度, 以防止在插入石蜡块之前块面和刀面之间的接触。
注意: 确保方块清除了从嵌入中获得的过量石蜡, 因为这可能会妨碍块的配合。 - 将刀片定向到整个方块的直线切割。轻轻地切下的部分, 以确保正确定位的块。
- 修剪块的厚度约10–30毫米。这一步骤确保每个组织条的最大表面积将被切割。
- 剪切10µm 部分, 并丢弃任何包含由修剪引起的孔。
- 小心地拿起使用镊子的部分, 漂浮在水浴中平展。使用镊子分隔每个部分。
- 从水浴中收集部分, 并放置在带电的玻璃滑梯上 (见材料表)。
- 将幻灯片直立放置在一个滑动架上, 并在37摄氏度的孵化器中存放。干燥的部分过夜。
- 在室温下无限期储存部分, 以便进行后续分析。
- Haematoxylin 和伊红 (H & E) 胃组织染色
- 脱蜡幻灯片使用3洗涤二甲苯5分钟, 其次3洗涤100% 乙醇, 每3分钟。确保每个阶段都使用新的解决方案。
- 在自来水中为30–60冲洗滑梯。
- 在纸巾上轻轻敲击幻灯片底部, 去除多余的水分。用过滤 Haematoxylin 染色3分钟确保该解决方案充分覆盖部分。
- 冲洗滑梯在自来水运行, 直到水运行清楚。
- 在斯科特的自来水中 8–10 s 的蘸玻片。不要公开幻灯片到解决方案超过十年代, 因为这将导致深色和强烈的污渍。可以在显微镜下查看切片染色。在这个阶段有效的染色将导致一个 ' 婴孩蓝色 ' 的颜色。
注: 准备斯科特的自来水通过溶解2克碳酸氢钠 (NaHCO3) 和20克硫酸镁 (MgSO4) 在 1 L 的蒸馏水。 - 在自来水中为30–60冲洗滑梯。
- 如步骤3所述去除多余的水分, 然后用过滤过的1% 水伊红染色3分钟。
- 冲洗滑梯在自来水运行, 直到水运行清楚。
注意: 使用光学显微镜可以评估染色。如果染色太暗, 可以在100% 乙醇中脱水, 比指定时间长。如果需要深色染色, 在继续执行后续步骤之前, 幻灯片可以在伊红的长度上染色。 - 脱水幻灯片使用3洗涤100% 乙醇在三十年代每个, 其次3洗涤二甲苯2分钟。确保每个阶段都使用新的解决方案。
- 使用安装介质安装幻灯片。在清洁盖玻片的中心添加一滴安装介质, 然后轻轻地将滑块放在顶部, 并将部分朝下。
注意: 请勿在滑动前擦干滑块。 - 将幻灯片放在平坦的表面上, 并允许空气干燥。也可以在烟雾罩中干燥滑块, 以加快干燥时间。
- 胃组织的姬姆萨染色
- 脱蜡幻灯片使用2洗涤 histolene 5 分钟, 其次2洗涤100% 乙醇每3分钟, 然后最后洗涤70% 乙醇3分钟. 确保每个洗涤使用新鲜的解决方案。
- 在自来水中为30–60冲洗滑梯。
- 将20% 姬姆萨染色剂与80% 蒸馏水混合, 制备姬姆萨溶液。姬姆萨溶液的染色玻片 1 h。
- 将滑块放在100毫升含有3–4滴醋酸的蒸馏水中。
注意: 在使用之前, 解决方案必须混合良好。在这个阶段, 幻灯片应该出现浅蓝色的颜色。 - 三十年代在96% 乙醇中冲洗幻灯片。
- 在3个异丙醇的浴中洗涤幻灯片每2分钟, 其次是3浴 histolene 2 分钟。每次洗涤使用新鲜异丙醇和 histolene。
- 带安装介质的盖玻片玻片, 如前文所述。
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Representative Results
本协议描述的口服灌胃技术, 以实现胃内感染与幽门螺杆菌或河猫在小鼠模型 (图 1)。安乐死后, 胃被移除, 称重并分为2个相等的一半, 包括胃组织的窦、体和非腺区域 (图 2)。在进行任何分析之前删除非腺区域。
通过对幽门螺杆菌感染的胃匀浆进行可行计数, 并随后在 HBA 板上枚举单个菌落 (图 3), 通常证实了动物的成功殖民化。另外, PCR 用于验证河猫使用特定的, 经验证的引物在h. 河猫和幽门螺杆菌多亚单位基因的 325 bp 区域的感染 (图 4)。
胃组织被处理, 嵌入和切片为下游组织学应用。采用 H & E 染色技术对幽门螺杆菌感染的小鼠进行组织病理学评价。在目前的例子中, WT C57BL/6 小鼠显示炎症的温和迹象, 包括增生 (扩大粘膜) 和腺体萎缩在6月后感染与河猫。细胞浸润的存在也可以观察到在子粘膜。有趣的是, 然而, 更严重的炎症是观察在小鼠在同一时间点, 与其他存在的淋巴滤泡位于接近细胞浸润 (图 5)。最后,河猫细菌在受感染的小鼠胃姬姆萨染色的部分观察到 (图 6)。
图 1: 演示口头灌胃技术的图像.一次性的1毫升注射器和挠性导管用于通过胃内途径将≥105的细菌菌剂提供给鼠标。鼠标被麻醉使用 methoxyflurane 和持有在一个坚定的抓地力在颈部, 允许进入导管到胃通过食道。
图 2: 小鼠脾和胃后感染的采集.在安乐死后, 通过用手术刀刮擦和在无菌 PBS 中洗涤, 将老鼠肚子收割。然后在棉片上对组织进行称重和扁平化, 以显示2个相等的半部分, 每个都包括胃窦、身体和非腺区域;刻度条 = 10 mm。
图 3:幽门螺杆菌感染的小鼠胃的存活计数。C57BL/6 背景下的小鼠接种 107株幽门螺杆菌SS1, 左8周。(A) 每种胃匀浆的稀释度都被镀到 HBA 板的一半 (或第三个), 并通过枚举10-100 个单独的菌落来评估细菌负荷。该板块的左半部分显示了幽门螺杆菌细菌的纯文化。(B) 小鼠胃菌群 (左) 或大量幽门螺杆菌菌落 (右) 存在污染细菌, 可能使幽门螺杆菌CFUs 的计数复杂化。(C) 在胃匀浆样品中污染细菌的常见例子。比例尺 = 1.7 厘米.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 用寡核苷酸靶向多亚单位基因对胃活检中河猫感染的 PCR 检测。在河猫和幽门螺杆菌多亚单位基因中, 特异的寡核苷酸对可识别并结合同源序列。这些引物使用基因组 DNA 从幽门螺杆菌SS1 (2 巷) 或河猫(3 巷) 进行验证。去离子水作为负控制包括 (车道 1)。
图 5: 在6月后感染河猫的情况下, 来自 WT 和 KO 小鼠的 h & e-染色胃段的代表性图像.石蜡包埋组织切片染色与 H & E. 单纯接受 BHI 汤的小鼠 (对照) 胃上皮正常, 无明显炎症。相比之下, 患有慢性河猫感染的 WT 动物的炎症和粘膜增稠程度均显示温和, 在河猫感染的 KO 动物中进一步加重。河猫感染的小鼠组织切片表现为粘膜淋巴滤泡 (*)、细胞浸润 (→)、腺萎缩 (▶) 和增生。刻度条 = 100 微米。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 6:河猫3 月后感染的 C57BL/6 小鼠姬姆萨染色胃段的代表性图像.石蜡包埋组织切片染色姬姆萨。箭头指示河猫在胃腺中的存在。刻度条 = 200 微米。
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Discussion
本协议描述了对幽门螺杆菌感染的体内小鼠模型的使用。该程序的关键步骤是: 1) 制备含有活性和能动细菌的幽门菌剂;2) 通过胃内灌胃向鼠标提供适当数量的细菌;3) 通过菌落计数和/或 PCR 检测细菌感染;和 4) 胃组织的处理, 以便评估受感染的胃的病理组织学。下面将讨论有关修改、故障排除和技术考虑的进一步建议。
在我们的实验室中, 使用血琼脂基2号补充了马血, 以增加幽门螺杆菌的生长方法。然而, 其他琼脂碱, 如布鲁氏菌琼脂和哥伦比亚血琼脂也可以使用22。必须确保只有无洗涤剂的无菌玻璃器皿用于制备生长培养基。此外, 为了获得最佳生长,幽门螺杆菌细菌应定期传代在有残余水分和不干燥的琼脂板上。在制备幽门螺杆菌菌剂感染时, 每1–1.5 或2天, 分别对亚型幽门螺旋菌和河猫株具有重要意义, 以确保细菌活性。在每个亚文化, 细菌应评估其生存能力和运动的相对比显微镜。尿素酶测定法也可以被常规地用于区分胃幽门螺杆菌和其他细菌23, 但是, 重要的是要认识到, 这种检测检测可行和非可行的幽门螺杆菌。在接种动物后, 必须对幽门螺杆菌的存活计数定量用于感染的存活细菌数量。河猫不可重复在琼脂培养基15上形成孤立菌落, 使用相造影显微镜对细菌数量进行估计。仅通过光密度测量 (600) 对细菌数量进行量化是不准确的, 因为这种方法不区分可行的和非可行的细菌。如上文所述, 不应在没有严格优化的情况下在幽门螺杆菌研究中使用此方法 (第1.5 节)。
在进行幽门螺杆菌感染研究时, 考虑最佳的小鼠和幽门螺杆菌的菌株, 以及感染的长度, 以适应实验的目的是至关重要的。还必须定期确认用于实验的动物实际上是无幽门的, 使用属特异性 PCR 引物24。其他肠道幽门螺杆菌(如幽门螺杆菌碧利斯、幽门螺杆菌基或幽门螺杆菌衣原体)的存在可能改变小鼠的疾病易感性, 并将混杂因素引入体内研究25,26。在最初的筛选实验中包括动物模拟治疗控制组 (即仅限喂食汤), 以调查正常菌群对幽门螺杆菌的殖民化和发病机制的影响。
安乐死后,幽门螺杆菌在小鼠胃中的殖民化可以通过可行计数来衡量。用于菌落计数的 HBA 板除了修改后的 Skirrow 选择性补充外, 还应辅以杆菌肽和 naladixic 酸, 以限制正常胃菌群中细菌种类的生长, 从而防止污染27.河猫并不总是形成菌落, 而是倾向于形成在琼脂板15,28的蜂拥生长。因此, PCR 和 qPCR 通常用于确定河猫的存在和水平, 分别为29、30。在第4.2 节中, 我们介绍了一种简单快速的 PCR 方法, 通过一对引物证实了河猫在小鼠胃中的殖民化, 并对其进行了验证, 以确定 325 bp 地区的河猫和幽门螺杆菌多亚单位基因。使用上述 PCR 条件, 可以区分这些胃幽门螺杆菌感染和脲酶产生的肝肠Helicobacters.已验证的其他基因 PCR 检测胃幽门螺杆菌感染包括 16s rRNA 和鞭毛蛋白 B (松弛) 基因15,29,30。
最后, 我们描述了使用两种功能强大的染色技术: H & E 染色, 评估胃后感染的病理组织学变化;姬姆萨染色, 检测河猫感染。为了获得最佳染色, 必须确保组织保持、加工和嵌入正确的方向。此外, 在这个过程中, 必须使用新鲜制备的溶液和过滤污渍。组织切片可以无限期储存, 并通过免疫荧光或免疫组化对胃病理学进行更具体的分析。一些其他常见的胃炎症和疾病的措施包括: 免疫细胞招募 (anti-CD45 染色);粘膜增稠/破坏 (周期性酸席夫/阿辛蓝染色);上皮细胞增殖 (增殖细胞核抗原、PCNA/染色、BrDU 染色);或细胞凋亡 (TUNEL 染色)。在河猫感染小鼠的 h & e-染色组织中观察到的淋巴滤泡可以通过免疫组化证实, 使用针对 B (B220+) 和 T 细胞 (CD3+) 抗原31的抗体。
总之, 细菌疾病的动物模型在感染生物学领域提供了宝贵的工具。在这里提供的胃内灌胃和胃组织的处理的协议可能适用于涉及其他肠道病原体的小鼠感染模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
提交人谨感谢保利女士和乔治雷-麦肯女士提供技术援助。作者承认, 莫纳什大学解剖学和发育生物学系的莫纳什组织学平台的设施和技术援助的使用。该实验室由国家卫生和医学研究理事会 (澳洲) 向 RLF (APP1079930、APP1107930) 提供资金支持。RLF 由澳洲 (APP1079904) 的高级研究奖学金支持。KD 和 MC 都得到了莫纳什研究生奖学金的支持。KD 还得到了美国哈得逊医学研究所的先天免疫和传染性疾病中心的支持, 而 MC 拥有莫纳什大学医学、护理和健康科学学院的国际研究生奖学金。在哈得逊医学研究所的研究得到了维多利亚政府的运营基础设施支持计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
