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Immunology and Infection

Helicobacter संक्रमण और गैस्ट्रिक विकृतियों के माउस मॉडल

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/56985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Centre for Innate Immunity and Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, 2Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University

Summary

चूहों जठरांत्र सूक्ष्मजीवों के कारण संक्रमण और रोगों का अध्ययन करने के लिए vivo मॉडल में एक अमूल्य प्रतिनिधित्व करते हैं । यहां, हम Helicobacter हेलिकोबेक्टरसे संबंधित रोग के माउस मॉडलों में बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और histopathological परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन ।

Abstract

Helicobacter हेलिकोबेक्टर एक गैस्ट्रिक रोगज़नक़ है कि वैश्विक आबादी के आधे में मौजूद है और मनुष्य में रुग्णता और मृत्यु का एक महत्वपूर्ण कारण है । गैस्ट्रिक Helicobacter संक्रमण के कई माउस मॉडल आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है जिससे एच हेलिकोबेक्टर बैक्टीरिया मानव मेजबान और कारण रोग के पेट उपनिवेश. इस के साथ साथ, हम करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन: 1) intragastric gavage के माध्यम से चूहों के में vivo संक्रमण के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार; 2) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और व्यवहार्य गिनती द्वारा, माउस गैस्ट्रिक ऊतकों में बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण स्तर का निर्धारण; और 3) प्रोटोकॉल द्वारा रोग परिवर्तन का आकलन करें । चूहों में Helicobactईआर संक्रमण स्थापित करने के लिए, विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (SPF) जानवरों को पहले निलंबन के साथ inoculated किया जाता है (जिसमें ≥ 105 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां हैं, CFUs) माउस के बस्तियां उपभेदों या तो Helicobacter हेलिकोबेक्टर या अन्य गैस्ट्रिक Helicobacter एसपीपी. जानवरों से, जैसे Helicobacter फेलिस. उपयुक्त समय-अंकों के बाद संक्रमण, पेट में दो समान ऊतक के टुकड़ों में उत्पाद और विच्छेदित sagittally हैं, प्रत्येक कोटर और शरीर क्षेत्र शामिल हैं । इन टुकड़ों में से एक तो या तो व्यवहार्य गिनती या डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया है, जबकि अंय ऊतकवैज्ञानिक प्रसंस्करण के अधीन है । बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और पेट में histopathological परिवर्तन गैस्ट्रिक ऊतक Warthin-तारों से सना हुआ वर्गों में नियमित रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, Giemsa या Haematoxylin और Eosin (एच एंड ई) दाग, के रूप में उपयुक्त. माउस गैस्ट्रिक ऊतक वर्गों पर immunohistochemistry या इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अतिरिक्त प्रतिरक्षा विश्लेषण भी किए जा सकते हैं । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से गैस्ट्रिक विकृतियों के चूहों में आकलन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं मानव-संबंधित एच हेलिकोबेक्टर रोगों में उन जैसी सूजन, ग्रंथि शोष और लसीकावत् कूप गठन सहित. इनोक्युलम तैयारी और intragastric gavage प्रोटोकॉल भी अंय दर्जी मानव रोगजनकों के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि चूहों उपनिवेश , जैसे साल्मोनेला Typhimurium या Citrobacterrodentium ।

Introduction

Helicobacter हेलिकोबेक्टर एक सर्पिल के आकार का, ग्राम नकारात्मक, दुनिया भर में सभी आबादी में मौजूद मानव गैस्ट्रिक रोगज़नक़, विकासशील देशों में संक्रमण की दर के साथ ८०%1के क्रम में होने का अनुमान है । हालांकि अधिकांश एच हेलिकोबेक्टरसंक्रमित व्यक्तियों स्पर्शोन्मुख हैं, कुछ और अधिक गंभीर रोगों का विकास, पेप्टिक अल्सर से गैस्ट्रिक कैंसर2को लेकर । एच हेलिकोबेक्टर-संबंधित कैंसर मोटे तौर पर उपकला कोशिकाओं में घातक परिवर्तन (GECs) द्वारा या पेट में अतिरिक्त नोडल लसीकावत् ऊतकों के गठन के द्वारा विशेषता हैं, गैस्ट्रिक ग्रंथिकर्कटता या म्यूकोसा-जुड़े लसीकावत् में जिसके परिणामस्वरूप ऊतक (माल्ट) लिंफोमा, क्रमशः । एच हेलिकोबेक्टर अत्यधिक के लिए विभिंन डाह कारकों और इस आला में अपने पालन, विकास और चयापचय सुविधा तंत्र की उपस्थिति के कारण पेट के कठोर पारिस्थितिकी आला में जीवित रहने के लिए अनुकूलित है । विशेष रूप से, एच हेलिकोबेक्टर के विषमय उपभेदों ४० kb सीएजी Pathogenicity द्वीप (सीएजीपै) है कि लगभग 30 एक प्रकार के उत्पादन के लिए आवश्यक जीन encodes 4 स्राव प्रणाली (T4SS)3,4 . सीएजी पै-पॉजिटिव एच. हेलिकोबेक्टर उपभेदों मेजबान है, जो गैस्ट्रिक ग्रंथिकर्कटता5के एक आवश्यक अग्रदूत के रूप में फंसाया गया है में पुरानी सूजन के उच्च स्तर की प्रेरण के साथ जुड़े रहे हैं ।

vivo में पशु मॉडल, विशेष रूप से चूहों, एच हेलिकोबेक्टर संक्रमण और रोग परिणाम6पर मेजबान, बैक्टीरियल और पर्यावरणीय कारकों के सापेक्ष योगदान की जांच करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति से अत्यधिक जानकारीपूर्ण गया है । अध्ययनों से पहले प्रदर्शित किया है कि लंबे समय तक एच हेलिकोबेक्टर संक्रमण C57BL/6 पर चूहों की पुरानी gastritis और ग्रंथि शोष के विकास में आनुवंशिक पृष्ठभूमि परिणाम, एच हेलिकोबेक्टर संक्रमण के दोनों बानगी7. इसके अलावा, संबंधित बिल्ली के समान/कुत्ते जीवाणु प्रजातियों के साथ संक्रमण, एच फेलिस, मानव माल्ट लिंफोमा8,9में देखा के रूप में इसी तरह की विकृति और रोग प्रगति के साथ चूहों में माल्ट गठन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । माउस औपनिवेशीकरण अध्ययन में सबसे अधिक इस्तेमाल किया ज. हेलिकोबेक्टर अलग है "सिडनी तनाव 1" (SS1) तनाव10, जो सीएजीपै+ है लेकिन एक गैर कार्यात्मक T4SS (T4SS−)11है । अंय व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उपभेदों एच हेलिकोबेक्टर B128 ७.१३ (सीएजीपै+/T4SS+)12 और X47-2AL (सीएजीपै-/T4SS−)13शामिल हैं । एच फेलिस संक्रमण के लिए, तनाव CS1 ("बिल्ली सर्पिल 1", सीएजीपै-/T4SS−) आम तौर पर14इस्तेमाल किया जाता है ।

साथ ही, हम vivo में संक्रमण के लिए Helicobacter inocula की तैयारी का वर्णन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, चूहों की intragastric gavage के लिए प्रक्रिया, साथ ही histopathological परिवर्तन के अध्ययन के लिए ऊतकों के प्रसंस्करण के लिए तरीके पेट में । विशेष रूप से, इस लेख ऊतकवैज्ञानिक बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण कल्पना और histopathological परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों पर ध्यान दिया जाएगा, माल्ट गठन सहित, संक्रमित चूहों के गैस्ट्रिक म्यूकोसा में. यहां वर्णित विधियों में से कुछ ऐसे एस के रूप में अंय आंत रोगजनकों के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । Typhimurium या ग  rodentium।

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Protocol

1. बैक्टीरियल Inocula की ग्रोथ और तैयारी

  1. गल ग्लिसरॉल स्टॉक्स ऑफ एच हेलिकोबेक्टर या एच. फेलिस15 से-८० डिग्री सेल्सियस और घोड़े रक्त आगर (बांधणी) प्लेटों पर उपसंस्कृति शामिल: रक्त आगार आधार No .2 ( सामग्री की तालिकादेखें); एक संशोधित "Skirrow एंटीबायोटिक चयनात्मक पूरक" (vancomycin से मिलकर, 10 μg/एमएल; polymyxin बी, 25 एनजी/एमएल; trimethoprim, 5 µ जी/एमएल; amphotericin बी, २.५ μg/एमएल); और 5 – 10% (v/v) हार्स ब्लड15,16. बैक्टीरिया २.५ या ३.५ एल anaerobic जार में microaerobic शर्तों के तहत अच्छी तरह से बढ़ने के उपयुक्त गैस पैक ( सामग्री की तालिकादेखें) युक्त, ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: h. हेलिकोबेक्टर उपभेदों इन शर्तों के तहत हो 1 के बाद उपसंस्कृत होना चाहिए-1.5 गर्मी के दिनों के लिए, जबकि एच फेलिसके लिए, गर्मी की जरूरत है कम से कम 2 दिन । उपयुक्त संस्कृति और भंडारण मीडिया विस्तार में वर्णित किया गया है पहले15।
  2. प्रारंभिक-से-मध्य लघुगणकीय चरण संस्कृतियों से माउस संक्रमण के लिए बैक्टीरियल inocula तैयार करें । फसल धीरे से प्लेटें आगर से प्रत्येक प्लेट बाढ़ से 1 – 2 ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) शोरबा की मिलीलीटर । पाश्चर पिपेट के साथ प्लेटों से महाप्राण सस्पेंशन ।
    1. वैकल्पिक रूप से, Helicobacter बैक्टीरिया से inocula तैयार है कि BHI शोरबा में 16 के लिए प्रचार किया गया है-18 एच15। इस मामले में, कम गति केंद्रापसारक द्वारा २,२०० x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया इकट्ठा ।
  3. व्यवहार्यता और चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (100X उद्देश्य) के तहत गीला माउंट तैयारियों का परीक्षण करके जीवाणुओं की गतिशीलता का आकलन करें । एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर BHI शोरबा के एक 10-20 μL छोटी बूंद में बैक्टीरिया के एक looped resuspend द्वारा गीला mounts तैयार करते हैं । एच फेलिस, जो एच हेलिकोबेक्टरकी तुलना में एक बहुत बड़ा जीवाणु है के मामले में, एक haemocytometer का उपयोग करने के लिए सही व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या गिनती । चना-दाग का प्रदर्शन कर संस्कृति शुद्धता की पुष्टि करें ।
    नोट: केवल का उपयोग करें H. हेलिकोबेक्टर inocula यदि बैक्टीरिया के बहुमत एक bacillary या सर्पिल आकार है (आकृति विज्ञान तनाव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं). H. फेलिस inocula मुख्यतः पेचदार के आकार के जीवाणुओं को शामिल करना चाहिए। inocula का उपयोग न करें यदि अधिकांश बैक्टीरिया एक coccoid आकृति विज्ञान है, के रूप में इन रूपों व्यवहार्य नहीं हैं और चूहों में एक संक्रमण स्थापित नहीं होगा.
  4. इनोक्युलम में बैक्टीरिया की संख्या का अनुमान के तहत गिनती द्वारा चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी क्षेत्र प्रति जीवाणुओं की अनुमानित संख्या (100X उद्देश्य) और निम्नलिखित गाइड का उपयोग करके: प्रति फ़ील्ड 1 जीवाणु = लगभग 106 कॉलोनी बनाने इकाइयों ( CFU) च्या Helicobacter/mL; प्रति फ़ील्ड 10 बैक्टीरिया = लगभग 107 CFU/ प्रति फ़ील्ड १०० बैक्टीरिया = लगभग 108 CFU/
    1. एक haemocytometer का उपयोग करते समय, CFU/mL का उपयोग कर निंन सूत्र का परिकलन करें:
      CFU/एमएल = (एक 4 x 4 क्षेत्र में बैक्टीरिया की औसत संख्या) x (कमजोर पड़ने फैक्टर) x (104) ।
  5. इनोक्युलम के बैक्टीरियल सेल घनत्व को समायोजित लगभग 107-108 CFU/एमएल शोरबा में कमजोर पड़ने से, यदि आवश्यक हो ।
    1. अधिक से अधिक बैक्टीरियल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, तैयारी के बाद जितनी जल्दी हो सके intragastric gavage के लिए inocula का उपयोग करें ।
    2. हमेशा gavage प्रक्रिया के बाद inocula की व्यवहार्य गिनती प्रदर्शन करके H. हेलिकोबेक्टर सेल घनत्व और व्यवहार्यता की पुष्टि (नीचे देखें) । यह हमेशा के लिए एच फेलिसके लिए संभव नहीं है, क्योंकि यह आमतौर पर संस्कृति मीडिया पर अलग कॉलोनियों के रूप में नहीं है । inocula में व्यवहार्य Helicobacterकी संख्या ऑप्टिकल घनत्व माप द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता (एक६००) अकेले के रूप में इस विधि व्यवहार्य के बीच भेदभाव नहीं करता है (यानी, bacillary/सर्पिल/पेचदार) और गैर व्यवहार्य ( यानी, coccoid) बैक्टीरिया ।
    3. inocula में व्यवहार्य एच हेलिकोबेक्टर बैक्टीरिया की संख्या का आकलन करने के एक साधन के रूप में ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों का प्रयोग करें, लेकिन इस मामले में, यह पहली बार एक विकास वक्र उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है । इस के लिए, एच हेलिकोबेक्टर संस्कृतियों के एक६०० मूल्यों समय पर नजर रखी है और सीधे व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या के खिलाफ संबंधित, थाली गिनती द्वारा निर्धारित ।
      नोट: इस तरह के विकास वक्र निर्धारण प्रदर्शन के लिए एक सुविधाजनक तरीका है तरल मध्यम में संस्कृति बैक्टीरिया (धारा १.२), मानक फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति एक 10% CO2 मशीन में रखा कुप्पी का उपयोग कर । CFUs की संख्या, संस्कृतियों के aliquots से निर्धारित हर 4 प्राप्त-6 घंटे से अधिक 2-3 दिन, तो इसी एक६०० 17मूल्यों की तुलना में हैं । महत्वपूर्ण बात, विकास curves प्रत्येक एच हेलिकोबेक्टर तनाव के लिए उत्पंन किया जाना चाहिए, के रूप में इन विभिंन दरों पर विकसित हो सकता है और इसके अलावा, नहीं सभी उपभेदों 10% सह2में अच्छी तरह से हो जाना ।

2. Helicobacter के साथ चूहों का Intragastric Gavage

नोट: intragastric gavage के इस विधि अंय जीवाणु प्रजातियों कि आंत उपनिवेश जैसे एस के लिए लागू किया जा सकता है । Typhimurium, ग. rodentium, लिस्टिरिया monocytogenes.

  1. 6 – 8-सप्ताहीय, विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (SPF) और Helicobacter-मुक्त पुरुष या मादा चूहों का प्रयोग करें । h हेलिकोबेक्टर या h. फेलिसके साथ संक्रमण प्रयोगों के लिए एक C57BL/6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले जानवरों का उपयोग करें । वर्तमान अध्ययन में, हम जंगली प्रकार (WT) और आनुवंशिक रूप से संशोधित C57BL/6 चूहों एक महत्वपूर्ण जंमजात प्रतिरक्षा रिसेप्टर की कमी का इस्तेमाल किया (नॉक आउट या KO जानवरों).
    नोट: अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर चूहों भी Helicobacter संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, हालांकि, औपनिवेशीकरण स्तर और रोग गंभीरता मेजबान पृष्ठभूमि के प्रकार से प्रभावित किया जा सकता है18,19.
  2. महाप्राण बैक्टीरियल इनोक्युलम (कदम १.५) डिस्पोजेबल 1 मिलीलीटर सीरिंज में और 23 गेज सुई पर जो प्रयोज्य पॉलीथीन कैथेटर (लंबाई, 6-8 सेमी; आंतरिक व्यास, ०.५८ मिमी) चिपका रहे हैं के साथ आपूर्ति की सुइयों की जगह । प्लास्टिक की फिल्म के छोटे स्ट्रिप्स के आवेदन के द्वारा सुई के लिए कैथेटर का मुंड ( सामग्री की तालिकादेखें) । वैकल्पिक रूप से, बाँझ प्लास्टिक खिला ट्यूब (20 गेज x ३८ मिमी) का उपयोग करके सुई/
  3. शारीरिक रूप से गर्दन और पूंछ के scruff पर एक फर्म पकड़ के साथ चूहों को नियंत्रित ।
    नोट: यह प्रक्रिया संज्ञाहरण के बिना किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से, एक साँस एनेस्थेटिक के उपयोग के साथ, जैसे methoxyflurane या isoflurane15.
  4. घेघा की दिशा में एक caudal दिशा में खुले जबड़े और गाइड के केंद्र में कैथेटर डालें । सबसे या कैथेटर के सभी अब दिखाई दे रहा है और एक प्रतिरोध, पेट के आधार के लिए इसी से घेघा के माध्यम से पेट के लिए उपयोग की आसानी की अनुमति देने के लिए माउस की गर्दन का विस्तार (और श्वासनली से दूर) । एक विशिष्ट aliquot उद्धार, आमतौर पर टीका प्रति १०० μL (चित्रा 1) ।
    नोट: चूहों को इष्टतम औपनिवेशीकरण और रोग विकृति को सुनिश्चित करने के लिए ≥ 105 CFU के साथ gavaged किया जाना चाहिए ।
  5. प्रयोग की अवधि के लिए एक SPF पशु सुविधा में घर चूहों.
    नोट: गंभीर विकृति और ग्रंथिकर्कटता में WT C57BL/6 चूहों केवल लगभग 24 महीने में मनाया जाता है ' के बाद संक्रमण20. हालांकि, इस प्रभाव को कुछ आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं में, या अंय आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ चूहों में त्वरित किया जा सकता है ।
  6. gavage प्रक्रिया के पूरा होने पर, मील और मिश्रा तकनीक के एक संशोधन करने के लिए व्यवहार्य एच हेलिकोबेक्टर चूहों के लिए प्रशासित बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करते हैं । इसके लिए इनोक्युलम का प्रश्नपत्र पतला (10− 1 से 10− 5) में पहले से15तक विस्तार से वर्णित विधि का प्रयोग करते हुए BHI है ।
    नोट: आदेश में एकल कालोनियों के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए, बांधणी प्लेट गर्म किया जाना चाहिए और एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट या ३७ डिग्री सेल्सियस में सूख 10 के लिए ° c मशीन-15 मिनट का उपयोग करने से पहले ।

3. चूहों से ऊतक कटाई उपरांत प्रयोग

  1. या तो कार्बन डाइऑक्साइड सांस लेना या गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा चूहों Euthanize, पशु प्रयोग के लिए प्रासंगिक नैतिकता समिति के अनुसार ।
  2. उदर गुहा खोल और ठीक है, घुमावदार कैंची का उपयोग कर पेट उत्पाद ।
    नोट: सीरा भी हृदय पंचर द्वारा एकत्र किया जा सकता है Helicobacter संक्रमण के लिए प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं की जांच में सहायता । इसके अतिरिक्त, तिल्ली और paragastric लिम्फ नोड्स का संग्रह अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में उपयोगी होते हैं ।
  3. अधिक से अधिक वक्रता के साथ पेट में कटौती और एक ५० मिलीलीटर ट्यूबों में बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में कोमल धोने के द्वारा अवशिष्ट भोजन को दूर ।
  4. बाँझ पंजाबियों में फिर से पेट धोने और फिर बारदाना 6 सेमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजन का उपयोग कर गीला वजन रिकॉर्ड ।
  5. पेट और काटना sagittally को दो बराबर ऊतक के टुकड़ों में समतल करें, प्रत्येक में शामिल हैं: कोटर, शरीर और गैर-ग्रंथियों forestomach क्षेत्र (चित्रा 2) । गैर-ग्रंथियों क्षेत्र निकालें और प्रत्येक पेट के एक आधे से पहले या तो बाँझ BHI के 1 मिलीलीटर (व्यवहार्य गिनती के लिए) या तरल नाइट्रोजन में स्नैप ठंड (डीएनए के लिए/
    नोट: वे संसाधित होने के लिए तैयार हैं जब तक BHI में ऊतक युक्त ट्यूबों बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए. स्नैप जमे हुए पेट के ऊतकों को भी आरएनए या qPCR के लिए प्रोटीन निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (मात्रात्मक पीसीआर) या पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण, क्रमशः.
  6. एक 15 मिलीलीटर 10% formalin युक्त ट्यूब के लिए दूसरे पेट आधा जोड़ें । 10 एस के लिए 10% formalin में ऊतक विसर्जित कर दिया और फिर ट्यूबों के ऊपर की ओर समतल । ऊतकों को 10% formalin समाधान में 24 घंटे की ंयूनतम के लिए फिर से विसर्जित करने से पहले ठीक करने की अनुमति दें ।
    नोट: ऊतकों प्रोटोकॉल के लिए प्रसंस्करण करने से पहले कई हफ्तों के लिए 10% formalin में रह सकते हैं । ऊतक के लंबे समय तक भंडारण, तथापि, अपनी वास्तुकला और/या बहाव विश्लेषण में उप इष्टतम परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप antigenicity प्रभावित हो सकता है ।

4. संक्रमण के बाद पेट में बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण की पुष्टि

  1. पेट में एच हेलिकोबेक्टर की व्यवहार्य गिनती
    1. अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बाँझ बांधणी प्लेट्स (२०० μg/एमएल bacitracin और 10 μg/एमएल naladixic एसिड) से पहले करने के लिए प्रदर्शन कॉलोनी से संक्रमित माउस पेट गणना16.
    2. Homogenize पेट वर्गों या तो मैंयुअल रूप से, autoclavable के micropestles का उपयोग कर, या एक यांत्रिक पृथक्करण साधन का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. डुप्लिकेट सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी (10− 1 से 10− 2) के परिणामस्वरूप गैस्ट्रिक homogenates में बाँझ BHI.
      नोट: कमजोर पड़ने का फैसला किया जाना चाहिए ठेठ बैक्टीरियल एक दिया एच हेलिकोबेक्टर संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया तनाव के लिए प्राप्त भार के आधार पर, साथ ही संक्रमण की अवधि । पतला नमूनों का प्रयोग भी किया जा सकता है ।
    4. विभाजित पूर्व-सूख बांधणी प्लेट्स (ऊपर नोट देखें) तीन या चार खंडों में । मील और मिश्रा तकनीक का एक अनुकूलन का उपयोग करना, 10 जोड़-आगर प्लेट के एक खंड पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 मिलीलीटर और बाँझ प्लास्टिक छोरों15का उपयोग कर प्रसार.
    5. प्लेटें सूखी और फिर उंहें anaerobe गैस जार में एक औंधा स्थिति (ढक्कन की ओर नीचे) में जगह की अनुमति दें । जार में नमी बनाए रखने के लिए, पानी युक्त पेट्री डिश शामिल करें ।
    6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर कॉलोनियों फार्म (आमतौर पर 4-7 दिन) तक मशीन जार ।
    7. 10 और १०० पृथक की गई कालोनियों के बीच समाविष्ट खंड (ओं) की गणना करें ।
      नोट: h. हेलिकोबेक्टर कालोनियों और h. फेलिस विकास प्लेटों पर murine गैस्ट्रिक microbiota के अन्य सदस्यों के उन लोगों से प्रतिष्ठित किया जा सकता मानक यूरीस, catalase और oxidase परीक्षण का उपयोग कर. एच हेलिकोबेक्टर और एच फेलिस सभी तीन परीक्षणों के लिए सकारात्मक हैं ।
    8. निंन सूत्र का उपयोग कर, बैक्टीरियल लोड के रूप में (ऊतक के CFU/
      [(गिना कालोनियों की औसत संख्या) × (कमजोर पड़ने फैक्टर) x (मात्रा मढ़वाया)]/(पेट वजन) ।
  2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा गैस्ट्रिक ऊतकों में एच फेलिस संक्रमण का पता लगाना
    1. मानक डीएनए अलगाव प्रोटोकॉल, या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग माउस पेट से निकालें डीएनए ।
    2. एक fluorometric quantitation तकनीक का उपयोग कर नमूनों की डीएनए एकाग्रता का निर्धारण ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. H फेलिस यूरीस B जीन (ureB)21के ३२५-आधार जोड़े (bp) अंश को टार्गेट करने वाली पीसीआर प्रतिक्रियाओं को सेट करें । प्रत्येक प्रतिक्रिया में शामिल होना चाहिए: १०० जीनोमिक डीएनए के एनजी; 1 mM फॉरवर्ड के प्रत्येक (5 '-एएए एटीसी CAC गाा GAC TGG जीजी-3 ') और रिवर्स (5 '-CTT TTA टीसीसी AAG TGG TGG CAC एसीसी-3 ') प्राइमरों; २०० मिमी dNTPs; Taq पोलीमरेज़ की ०.५ इकाइयाँ और उपयुक्त मात्रा में बफर और nuclease-मुक्त पानी.
      नोट: इस oligonucleotide जोड़ी को पहचान और दोनों एच हेलिकोबेक्टर और एच फेलिस ureB जीन में मुताबिक़ दृश्यों को बांध के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन जब नीचे पीसीआर शर्तों के अधीन, ureB में मौजूद उन नहीं enterohepatic Helicobacter एसपीपी के जीन ।
    4. निंनलिखित थर्मल प्रोफाइल का उपयोग कर पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन: 5 मिनट के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग, 30 एस के लिए ९४ ° c के ३५ चक्र के बाद, ६१ ° c के लिए 30 s और ७२ ° c के लिए 1 मिनट, 20 डिग्री सेल्सियस पर रखने से पहले ।
    5. १०० वी पर 30 मिनट के लिए 2% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद चलाते हैं ।

5. Helicobacter-संक्रमित माउस पेट वर्गों के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण

  1. पेट के ऊतकों के प्रसंस्करण
    1. formalin से पेट के ऊतकों को निकालें और साफ पेट्री व्यंजन में लगाएं ।
    2. कई समान आकार के अनुदैर्ध्य स्ट्रिप्स में एक स्केलपेल के साथ पेट के ऊतकों में कटौती (प्रत्येक 2-3 मिमी मोटी) और लेबल वाली embedding कैसेटों फोम गद्दी युक्त में जगह है ।
    3. एक ८०% इथेनॉल से भरा जार में embedding कैसेट रखकर पेट के ऊतकों को ठीक करें ।
      नोट: पेट तुरंत संसाधित किया जा सकता है या अगले कदम पर आगे बढ़ने के लिए 1-2 दिन पहले तक के लिए संग्रहीत ।
    4. एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर पर पेट की प्रक्रिया, निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ क्रमादेशित:
      निर्जलीकरण: ७०% इथेनॉल-1 चक्र, 20 मिनट; ९०% इथेनॉल-1 चक्र, 20 मिनट; १००% इथेनॉल-2 चक्र, 20 मिनट प्रत्येक + 1 चक्र, ४० मिनट + 1 चक्र, 1 एच ।
      समाशोधन: xylene-2 चक्र, 30 मिनट प्रत्येक + 1 चक्र, ४५ मिनट ।
      गर्भवती: ६० डिग्री सेल्सियस पर आयल वैक्स-1 चक्र, ४५ मिनट + 1 चक्र, 1 एच + 1 चक्र, १.२५ एच ।
    5. तेल embedding के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और स्टोर से संसाधित नमूनों को निकालें ।
  2. आयल संसाधित गैस्ट्रिक ऊतकों की embedding
    1. मोल्ड्स के ठिकानों को गर्म करने के लिए एम्बेडिंग यूनिट के स्टेज पर स्टेनलेस स्टील बेस मोल्ड प्लेस करें ।
      नोट: एंबेडिंग मशीन कुशल आयल embedding के लिए ६० ° c पर सेट किया जाना चाहिए ।
    2. जगह लच्छेदार एक गर्म मोम स्नान में नमूने युक्त कैसेट/एंबेडिंग इकाई के गर्म प्लेट क्षेत्र तक मोम पूरी तरह से घुल ।
      नोट: यह अनुशंसित है कि नमूना मोम घुल के बाद शीघ्र ही एंबेडेड हो । यह सुनिश्चित करता है कि ऊतकों की सख्ती नहीं होती है ।
    3. आयल मोम के साथ स्टेनलेस स्टील मोल्ड के आधे भरें । गर्म संदंश का प्रयोग, कैसेट से पेट के ऊतकों स्ट्रिप्स को हटाने और धीरे से तेल के माध्यम से पेट स्ट्रिप्स मोल्ड के आधार पर धक्का । ध्यान से मालूम ऊतक स्ट्रिप्स मोल्ड के आधार के लिए एक सही कोण पर ताकि उनके कटा हुआ सिरों ऊपर की ओर का सामना कर रहे हैं ।
      नोट: निंनलिखित कदम के रूप में जल्दी से बचने के रूप में संभव के रूप में किया जाना चाहिए और कठोर एंबेडेड ब्लॉकों में आयल परतों की जुदाई । पेट के ऊतकों का उचित अभिविन्यास बहाव के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है ।
    4. जगह में नमूनों को ठीक करने के लिए एंबेडिंग इकाई की ठंडी थाली पर मोल्ड प्लेस और पुनः मालूम ऊतकों यदि आवश्यक हो ।
      नोट: यदि ऊतकों को उखाड़ फेंकना और तेल कठोर करने के लिए शुरू होता है, जगह मोल्डों वापस गर्म थाली पर मोम और फिर से ढालना में एंबेड ऊतक पिघलने के लिए ।
    5. लेबल एंबेडिंग कैसेट के प्लेस आधा (जो ऊतक प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया गया) पर मोल्ड के शीर्ष पर और धीरे गर्म मोम के साथ भरें । आयल को ओवरफ्लो न होने दें ।
    6. धीरे से एक ठंडी थाली के लिए मोल्ड पर जगह और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    7. एक बार आयल पूरी तरह से सेट है, molds से एंबेडेड ब्लॉकों अलग । एक गर्म थाली (८० डिग्री सेल्सियस से ऊपर सेट) या एक खुरचना का उपयोग कैसेट किनारों पर स्वच्छ अतिरिक्त आयल मोम । अनुभाग प्रदर्शन किया जाता है जब तक ब्लॉक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. ऊतकों की धारा
    1. चिल तेल-बर्फ पर एंबेडेड ऊतक ब्लॉक और एक पानी ultrapure पानी से 40-45 डिग्री सेल्सियस से भरा स्नान गर्मी ।
    2. microtome के धारक में ब्लेड सुरक्षित और 1 के बीच मंजूरी कोण सेट-5 ° ब्लॉक चेहरा और चाकू पहलू के बीच संपर्क को रोकने के लिए, आयल ब्लॉक डालने से पहले ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि ब्लॉक एंबेडिंग से प्राप्त अतिरिक्त तेल के स्पष्ट हैं, के रूप में इस खंड के फिट बाधा हो सकती है ।
    3. एक सीधे कट के लिए ब्लेड मालूम ब्लॉक भर में । धीरे 2 कट-3 पतली वर्गों को ब्लॉक की सही स्थिति सुनिश्चित करने के लिए ।
    4. लगभग 10 की एक मोटाई द्वारा ब्लॉक ट्रिम-30 मिमी । यह कदम सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक ऊतक पट्टी के एक अधिक से अधिक सतह क्षेत्र में कटौती की जाएगी ।
    5. 10 µm वर्गों में कटौती और किसी भी है कि ट्रिमिंग की वजह से छेद होते है त्यागें ।
    6. ध्यान से चिमटी का उपयोग कर वर्गों उठाओ और समतल के लिए पानी के स्नान में उन्हें नाव । प्रत्येक अनुभाग को अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें ।
    7. चार्ज ग्लास स्लाइड पर जल स्नान और जगह से वर्गों लीजिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    8. स्लाइड रैक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में जगह में ईमानदार स्लाइड स्टोर । शुष्क वर्गों रातोंरात ।
    9. बाद में विश्लेषण के लिए अनिश्चित काल के कमरे के तापमान पर वर्गों की दुकान ।
  4. Haematoxylin और Eosin (एच एंड ई) पेट के ऊतकों के दाग
    1. Dewax स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए xylene के 3 बहाकर उपयोग, १००% इथेनॉल में 3 बहाकर द्वारा पीछा किया, 3 मिनट के लिए प्रत्येक । सुनिश्चित करें कि ताजा समाधान प्रत्येक चरण में उपयोग किए जाते हैं ।
    2. नल के पानी में कुल्ला स्लाइड 30 के लिए-60 एस ।
    3. धीरे से एक कागज तौलिया पर स्लाइड के नीचे दोहन द्वारा अतिरिक्त पानी निकालें । 3 मिनट के लिए फ़िल्टर्ड Haematoxylin के साथ दाग सुनिश्चित करें कि अनुभाग पर्याप्त समाधान के साथ कवर कर रहे हैं ।
    4. नल पानी चल रहा है जब तक पानी साफ चलाता है के तहत कुल्ला स्लाइड ।
    5. 8 के लिए स्कॉट नल के पानी में डुबकी स्लाइड-10 एस । 10 से अधिक समाधान करने के लिए स्लाइड्स का पर्दाफाश न करें के रूप में यह गहरे और तीव्र दाग में परिणाम होगा । वर्गों के दाग एक खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है । इस स्तर पर कुशल धुंधला एक ' बेबी ' नीला रंग में परिणाम होगा ।
      नोट: सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट के 2 जी भंग (NaHCO3) और आसुत जल के 1 एल में मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4) के 20 ग्राम के द्वारा स्कॉट नल का पानी तैयार करें ।
    6. नल के पानी में कुल्ला स्लाइड 30 के लिए-60 एस ।
    7. चरण 3 में वर्णित के रूप में अतिरिक्त पानी निकालें, और फिर 3 मिनट के लिए फ़िल्टर 1% जलीय Eosin के साथ दाग ।
    8. नल पानी चल रहा है जब तक पानी साफ चलाता है के तहत कुल्ला स्लाइड ।
      नोट: धुंधला एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । अगर धुंधला भी अंधेरा है, स्लाइड निर्दिष्ट समय से अधिक के लिए १००% इथेनॉल में निर्जलित किया जा सकता है । यदि गहरा धुंधला होना आवश्यक है, तो स्लाइड्स 1 – 2 मिनट के लिए Eosin से दाग सकती हैं, बाद के चरणों में आगे बढ़ने से पहले ।
    9. निर्जलीकरण 30 एस प्रत्येक के लिए १००% इथेनॉल के 3 बहाकर का उपयोग कर स्लाइड, 2 मिनट प्रत्येक के लिए xylene के 3 बहाकर द्वारा पीछा किया । सुनिश्चित करें कि ताजा समाधान प्रत्येक चरण में उपयोग किए जाते हैं ।
    10. बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट । धीरे शीर्ष पर नीचे की ओर का सामना करना पड़ वर्गों के साथ स्लाइड रखने से पहले एक साफ coverslip के केंद्र में बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें ।
      नोट: फिसल कवर करने से पहले सूखी स्लाइड्स न करें.
    11. एक सपाट सतह पर स्लाइड प्लेस और शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं । स्लाइड भी सुखाने समय में तेजी लाने के लिए एक धुएं डाकू में सूख जा सकता है ।
  5. Giemsa पेट के ऊतकों के दाग
    1. Dewax 5 मिनट प्रत्येक के लिए histolene के 2 बहाकर का उपयोग कर स्लाइड, 3 मिनट के लिए प्रत्येक और फिर ७०% इथेनॉल में एक अंतिम धो 3 मिनट के लिए १००% इथेनॉल के 2 बहाकर के बाद । ताजा समाधान प्रत्येक धोने के लिए उपयोग किया जाता है सुनिश्चित करें ।
    2. नल के पानी में कुल्ला स्लाइड 30 के लिए-60 एस ।
    3. ८०% आसुत जल के साथ 20% Giemsa दाग मिश्रण से Giemsa समाधान तैयार करें । 1 एच के लिए Giemsa समाधान के साथ स्लाइड दाग ।
    4. एसिटिक एसिड के 2-3 एस के लिए 3-4 बूंदें युक्त आसुत जल के १०० मिलीलीटर में स्लाइड प्लेस ।
      नोट: समाधान का उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए । इस स्तर पर, स्लाइडों को रंग में पीला नीला दिखाई देना चाहिए ।
    5. 30 एस के लिए ९६% इथेनॉल में स्लाइड धो लो ।
    6. 2 मिनट प्रत्येक के लिए isopropanol के 3 स्नान में स्लाइड धो, 2 मिनट प्रत्येक के लिए histolene के 3 स्नान द्वारा पीछा किया । प्रत्येक वॉश के लिए ताज़े isopropanol और histolene का प्रयोग करें ।
    7. बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड Coverslip, जैसा पहले बताया गया है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक मौखिक gavage तकनीक murine माउस मॉडल में एच. हेलिकोबेक्टर या एच फेलिस के साथ intragastric संक्रमण को प्राप्त करने के लिए (चित्रा 1). इच्छामृत्यु के बाद, पेट हटा दिया जाता है और 2 बराबर कोटर, शरीर और गैस्ट्रिक ऊतकों के गैर ग्रंथियों क्षेत्रों (चित्रा 2) शामिल हिस्सों में विभाजित । गैर-ग्रंथियों क्षेत्र किसी भी विश्लेषण प्रदर्शन करने से पहले हटा दिया जाता है ।

पशुओं के सफल औपनिवेशीकरण आम तौर पर एच हेलिकोबेक्टर-संक्रमित गैस्ट्रिक homogenates पर व्यवहार्य गिनती प्रदर्शन से पुष्टि की है, और बाद में बांधणी प्लेटों (चित्रा 3) पर व्यक्तिगत कॉलोनियों की गणना । वैकल्पिक रूप से, पीसीआर एच फेलिस और एच हेलिकोबेक्टर ureB जीन ( चित्रा 4) के एक ३२५ बीपी क्षेत्र में निर्देशित विशिष्ट, सत्यापित प्राइमर का उपयोग कर के साथ संक्रमण की पुष्टि करने के लिए कार्यरत है ।

गैस्ट्रिक ऊतकों, संसाधित एम्बेडेड और बहाव ऊतकवैज्ञानिक अनुप्रयोगों के लिए खोदी जाती हैं । एच एंड ई धुंधला तकनीक का उपयोग Helicobacter-संक्रमित चूहों में histopathology का आकलन करने के लिए किया जाता है । वर्तमान उदाहरण में, WT C57BL/6 चूहों हाइपरप्लासिया (बढ़े म्यूकोसा) और 6 महीने के बाद एच फेलिसके साथ संक्रमण पर ग्रंथि शोष सहित सूजन के उदारवादी लक्षण प्रदर्शित करते हैं । सेलुलर घुसपैठ की उपस्थिति भी उप म्यूकोसा में मनाया जा सकता है । दिलचस्प है, तथापि, और अधिक गंभीर सूजन को KO चूहों में एक ही समय बिंदु पर मनाया जाता है, लसीकावत् रोम के करीब निकटता में स्थित सेलुलर घुसपैठ (चित्रा 5) के अतिरिक्त उपस्थिति के साथ । अंत में, एच फेलिस बैक्टीरिया संक्रमित माउस पेट (चित्रा 6) के Giemsa-सना हुआ वर्गों में मनाया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: मौखिक gavage तकनीक का प्रदर्शन छवि । एक डिस्पोजेबल 1 मिलीलीटर सिरिंज और लचीला कैथेटर intragastric मार्ग के माध्यम से एक माउस के लिए बैक्टीरियल inocula के ≥ 105 CFU वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है । माउस methoxyflurane का उपयोग कर anesthetized था और गर्दन पर एक फर्म पकड़ में आयोजित, घेघा के माध्यम से पेट के लिए कैथेटर की पहुंच के लिए अनुमति दी ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस तिल्ली और पेट की कटाई के बाद संक्रमण । माउस पेट के बाद इच्छामृत्यु और उनकी सामग्री एक स्केलपेल और बाँझ पंजाब में धोने के साथ परिमार्जन द्वारा हटाया काटा गया । ऊतकों तो तौला और एक कपास शीट पर चपटा किया गया 2 बराबर आधा प्रकट करने के लिए, प्रत्येक गैस्ट्रिक कोटर, शरीर और गैर ग्रंथियों क्षेत्रों शामिल; स्केल बार = 10 मिमी ।

Figure 3
चित्रा 3: एच हेलिकोबेक्टर-संक्रमित माउस पेट पर व्यवहार्य मायने रखता है । C57BL/6 पृष्ठभूमि पर चूहों हेलिकोबेक्टर SS1 के 107 CFU के साथ inoculated थे और 8 सप्ताह के लिए छोड़ दिया है । (क) प्रत्येक गैस्ट्रिक homogenate के कमजोर पड़ने पर एक आधा (या तीसरे) एक बांधणी प्लेट और बैक्टीरियल लोड 10-100 व्यक्तिगत कॉलोनियों की गणना द्वारा मूल्यांकन पर चढ़ाया जाता है । प्लेट के बाईं आधा एच हेलिकोबेक्टर बैक्टीरिया की एक शुद्ध संस्कृति से पता चलता है । (ख) माउस गैस्ट्रिक microbiota से दूषित जीवाणुओं की उपस्थिति (बाएँ) या एच हेलिकोबेक्टर कॉलोनियों की बड़ी संख्या (दाएँ) एच. हेलिकोबेक्टर CFUs के गणन को जटिल कर सकती है. (ग) गैस्ट्रिक homogenate नमूनों में बैक्टीरिया को दूषित करने के सामान्य उदाहरण हैं. स्केल बार = १.७ cm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ureB जीन लक्ष्यीकरण oligonucleotides का उपयोग गैस्ट्रिक बायोप्सी में एच फेलिस संक्रमण की पीसीआर का पता लगाने. एक विशिष्ट oligonucleotide बाँध को पहचानना और दोनों एच. फेलिस और एच. हेलिकोबेक्टर ureB जीन में मुताबिक़ दृश्यों को बाँधने के लिए बनाया गया था. इन प्राइमरों एच हेलिकोबेक्टर SS1 (लेन 2) या h. फेलिस (लेन 3) से जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर मान्य किया गया. जल को नकारात्मक नियंत्रण (लेन 1) के रूप में शामिल किया गया ।

Figure 5
चित्रा 5: एच और ई के प्रतिनिधि छवियों-WT और KO चूहों से दाग पेट वर्गों के 6 ' महीने के बाद एच फेलिसके साथ संक्रमण । आयल-एंबेडेड ऊतक वर्गों एच एंड ई. WT के साथ दाग थे (नियंत्रण) अकेले शोरबा प्राप्त चूहों एक सामांय गैस्ट्रिक उपकला और कोई महत्वपूर्ण सूजन था । इसके विपरीत, जीर्ण एच फेलिस संक्रमण के साथ WT जानवरों सूजन और श्लैष्मिक और अधिक मोटा होना जो आगे एच फेलिस-संक्रमित KO जानवरों में बढ़ा दिया गया था के उदारवादी स्तर प्रदर्शित । एच फेलिससे ऊतक वर्गों-संक्रमित KO चूहों श्लैष्मिक लसीकावत् रोम (*), सेलुलर घुसपैठ (→), ग्रंथि शोष (▶) और हाइपरप्लासिया की उपस्थिति का प्रदर्शन किया । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: C57BL/6 WT चूहों से Giemsa-सना हुआ गैस्ट्रिक वर्गों के प्रतिनिधि छवियों 3 ' महीने के बाद एच फेलिसके साथ संक्रमण. आयल-एंबेडेड ऊतक वर्गों Giemsa के साथ दाग थे । तीर गैस्ट्रिक ग्रंथियों में एच फेलिस की उपस्थिति का संकेत है । स्केल बार = २०० माइक्रोन ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल Helicobacter संक्रमण के लिए एक vivo माउस मॉडल के उपयोग का वर्णन है । प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) व्यवहार्य और गतिशील बैक्टीरिया युक्त Helicobacter inocula की तैयारी; 2) intragastric gavage के माध्यम से माउस के लिए बैक्टीरिया की उचित संख्या की डिलिवरी; 3) कॉलोनी गिनती और/या पीसीआर द्वारा बैक्टीरियल संक्रमण का पता लगाने; और 4) गैस्ट्रिक ऊतकों के प्रसंस्करण संक्रमित पेट में histopathology के आकलन को सक्षम करने के लिए । संशोधनों के लिए आगे सुझाव, समस्या निवारण और तकनीकी विचार नीचे चर्चा कर रहे हैं ।

बढ़ने की विधि Helicobacter एसपीपी । रक्त का उपयोग कर आगर आधार नंबर 2 घोड़े रक्त के साथ पूरक अच्छी तरह से हमारी प्रयोगशाला में स्थापित किया गया है. हालांकि, वैकल्पिक आगार कुर्सियां जैसे ब्रूसेला आगर और कोलंबिया ब्लड आगार भी22का इस्तेमाल कर सकती हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि केवल बाँझ कांच के बाहर है कि डिटर्जेंट के लिए विकास माध्यम तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा, इष्टतम वृद्धि प्राप्त करने के लिए, एच हेलिकोबेक्टर बैक्टीरिया नियमित रूप से किया जाना चाहिए प्लेटों कि अवशिष्ट नमी है और सूखी नहीं है आगर पर । संक्रमण के लिए Helicobacter एसपीपी. inocula की तैयारी करते समय, यह बैक्टीरियल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, क्रमशः हर 1-1.5 या 2 दिन, उपसंस्कृति एच हेलिकोबेक्टर और एच फेलिस उपभेदों के लिए महत्वपूर्ण है । हर उपसंस्कृति में, बैक्टीरिया उनकी व्यवहार्यता और चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा गतिशीलता के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए. एक यूरीस परख भी नियमित रूप से गैस्ट्रिक Helicobacter एसपीपी के बीच भेदभाव के लिए नियोजित किया जा सकता है । और अंय बैक्टीरिया23, तथापि, यह एहसास है कि इस परख दोनों व्यवहार्य और गैर व्यवहार्य Helicobacter बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । पशुओं के टीका के बाद, Helicobacter निलंबन पर व्यवहार्य मायने रखता संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या quantitate करने के लिए किया जाना चाहिए । एच फेलिस के रूप में आगर मध्यम15, जीवाणु संख्या का आकलन पर अलग कॉलोनियों फार्म reproducibly नहीं करता है चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है । ठहराव ऑप्टिकल घनत्व माप (एक६००) अकेले बैक्टीरिया की संख्या के रूप में गलत है के रूप में इस विधि व्यवहार्य और गैर व्यवहार्य बैक्टीरिया के बीच भेदभाव नहीं करता है । इस विधि Helicobacter अनुसंधान में कठोर अनुकूलन के बिना इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, जैसा कि ऊपर वर्णित (धारा १.५) ।

जब Helicobacter संक्रमण अध्ययन प्रदर्शन, यह इष्टतम माउस और Helicobacter तनाव पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही संक्रमण की लंबाई, प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप है । यह भी नियमित रूप से पुष्टि है कि प्रयोग के लिए इस्तेमाल जानवरों वास्तव में Helicobacter-मुक्त जीनस-विशिष्ट पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर रहे है आवश्यक है24। अन्य दर्जी Helicobacter प्रजातियों की उपस्थिति, जैसे Helicobacter बीलिस, Helicobacter hepaticus या Helicobacter muridarum, चूहों की बीमारी संवेदनशीलता को बदल सकते हैं और में प्राप्त कारकों का परिचय vivo स्टडीज में25,26. यह भी जानवरों के एक नकली उपचार नियंत्रण समूह (यानी, फेड शोरबा केवल) प्रारंभिक स्क्रीनिंग प्रयोगों में Helicobacter औपनिवेशीकरण और रोगजनन पर सामांय microbiota के प्रभाव की जांच शामिल करने के लिए सलाह दी जाती है ।

इच्छामृत्यु के बाद, एच हेलिकोबेक्टर औपनिवेशीकरण murine पेट में व्यवहार्य गिनती द्वारा मापा जा सकता है । कालोनी गिनती के लिए इस्तेमाल किया बांधणी प्लेट संशोधित Skirrow के चुनिंदा पूरक के अलावा bacitracin और naladixic एसिड के साथ पूरक किया जाना चाहिए, सामान्य गैस्ट्रिक microbiota से बैक्टीरियल प्रजातियों के विकास को प्रतिबंधित करने और इसलिए संक्रमण को रोकने के लिए 27. H. फेलिस हमेशा कालोनियों फार्म नहीं करता है, लेकिन इसके बजाय के लिए आगर प्लेटें15,28पर बजबजा विकास फार्म जाता है । इसलिए, पीसीआर और qPCR सामान्य रूप से एच फेलिस, क्रमशः29,30की उपस्थिति और स्तर निर्धारित करने के लिए कार्यरत हैं । धारा ४.२ में, हम एक सरल और त्वरित पीसीआर विधि murine पेट में एच फेलिस द्वारा औपनिवेशीकरण की पुष्टि करने के लिए शुरू की एक जोड़ी का उपयोग कर, जो फेलिस और एच के ३२५ बीपी क्षेत्र लक्ष्य के लिए मांय किया गया है हेलिकोबेक्टर ureB जीन । ऊपर वर्णित पीसीआर शर्तों का उपयोग कर, यह इन गैस्ट्रिक Helicobacter एसपीपी द्वारा संक्रमण के बीच भेदभाव करने के लिए संभव है. and यूरीस-उत्पादक enterohepatic Helicobacters । गैस्ट्रिक Helicobacter संक्रमण के पीसीआर डिटेक्शन के लिए मान्य किया गया है कि अन्य जीन 16s rRNA और flagellin बी (flaB) जीन15,29,30शामिल हैं ।

अंत में, हम दो शक्तिशाली धुंधला तकनीक के उपयोग का वर्णन किया है: एच और ई धुंधला, पेट के बाद संक्रमण में histopathological परिवर्तन का आकलन; और Giemsa धुंधला, H. फेलिस संक्रमण का पता लगाने के लिए । इष्टतम धुंधला प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि ऊतकों को संरक्षित किया गया है आवश्यक है, संसाधित और सही अभिविन्यास में एंबेडेड । इसके अतिरिक्त, केवल हौसले से तैयार समाधान और फ़िल्टर किए गए दाग इस प्रक्रिया के दौरान उपयोग किया जाना चाहिए । ऊतक वर्गों अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस या immunohistochemistry के माध्यम से गैस्ट्रिक विकृति के अधिक विशिष्ट विश्लेषण के लिए उपयोग । गैस्ट्रिक सूजन और रोग के कुछ अन्य आम उपायों में शामिल हैं: प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती (anti-CD45 धुंधला); श्लैष्मिक रोगन/विनाश (आवधिक अम्ल Schiff/Alcian नीला दाग); उपकला कोशिका प्रसार (proliferating सेल परमाणु प्रतिजन, PCNA/Bromodeoxyuridine, BrDU धुंधला); या सेल्युलर apoptosis (TUNEL धुंधलाना). लसीकावत् के रोम एच और ई-दाग के ऊतकों में मनाया ज. फेलिस-संक्रमित चूहों immunohistochemistry द्वारा पुष्टि की जा सकती है, एंटीबॉडी का उपयोग बी के खिलाफ निर्देशित (B220+) और टी सेल (CD3+) एंटीजन31.

संक्षेप में, बैक्टीरियल रोग के पशु मॉडल संक्रमण जीव विज्ञान के क्षेत्र में मूल्यवान उपकरण प्रदान करते हैं । intragastric gavage और पेट के ऊतकों के प्रसंस्करण के प्रोटोकॉल यहाँ प्रदान की माउस संक्रमण अन्य दर्जी रोगजनकों शामिल मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक सुश्री ए. डी पाओली और सुश्री जोर्जी Wray-मॅक्कन को तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं. लेखक मोनाश प्रोटोकॉल मंच, एनाटॉमी और विकासात्मक जीवविज्ञान विभाग, मोनाश विश्वविद्यालय की सुविधाओं और तकनीकी सहायता के उपयोग को स्वीकार करते हैं । प्रयोगशाला को राष्ट्रीय स्वास्थ्य और आयुर्विज्ञान अनुसंधान परिषद् (NHMRC) से RLF (APP1079930, APP1107930) तक धन का समर्थन प्राप्त है. RLF NHMRC (APP1079904) से एक वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित है । केडी और MC दोनों मोनाश स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित हैं । केडी भी जंमजात प्रतिरक्षा और संक्रामक रोगों, हडसन चिकित्सा अनुसंधान संस्थान के लिए केंद्र द्वारा समर्थित है, जबकि एम सी चिकित्सा, नर्सिंग और स्वास्थ्य विज्ञान, मोनाश विश्वविद्यालय के संकाय से एक अंतरराष्ट्रीय स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति है । हडसन चिकित्सा अनुसंधान संस्थान में अनुसंधान विक्टोरियन सरकार की संचालन अवसंरचना समर्थन कार्यक्रम द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2 Thermo Fischer Scientific CM0271B Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood Australian Ethical Biologicals PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth BD Bioscience 237500 Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs Thermo Fischer Scientific CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured ChemSupply AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol) Merck 100995
Xylene (sulphur free) ChemSupply XT003-20L
Mayer's Haematoxylin Amber Scientific MH-1L Filter before use
Eosin, Aqueous Stain Amber Scientific EOCA-1L Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified Sigma Aldrich WG80-2.5L Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene Grale Scientific 11031/5
DPX mounting medium VWR 1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fischer Scientific Q32850
Oligonucleotides Sigma Aldrich The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8291 Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs Bioline BIO-39028 Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose Bioline BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate Univar (Ajax Fine Chemicals) A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate Chem-Supply MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin Sigma Aldrich V2002-1G Dissolve in deionized water
Polymyxin B Sigma Aldrich P4932-5MU Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC) Sigma Aldrich T7883 Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin Amresco (Astral Scientific) E437-100MG Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis Sigma Aldrich B0125 Dissolve in deionized water
Naladixic acid Sigma Aldrich N8878 Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox) Medical Developments International Not applicable
Paraffin Wax Paraplast Plus, Leica Biosystems 39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars Thermo Fischer Scientific HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes Interpath Services 200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C
23 g precision glide needle BD Bioscience 301805
Parafilm M Bemis, VWR PM996
Portex fine bore polythene tubing Smiths Medical 800/100/200
Plastic feeding catheters Instech  Laboratories FTP20-30
1 mL tuberculin luer slip disposable syringes BD Bioscience 302100
Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes Sigma Aldrich Z317314 Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap) Miltenyi Biotec 30-093-236
Qubit Fluorometer Thermo Fischer Scientific Q33216
Sterile plastic loop LabServ LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System Leica Biosystems Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 Sakura, Alphen aan den Rijn 4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System Sakura, Alphen aan den Rijn 4170
Microtome, Leica RM2235 Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific 4951PLUS4

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References

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D'Costa, K., Chonwerawong, M., Tran, L. S., Ferrero, R. L. Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies. J. Vis. Exp. (140), e56985, doi:10.3791/56985 (2018).

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