Summary
Topi rappresentano un modello prezioso in vivo per studiare l'infezione e malattie causate da microrganismi gastrointestinale. Qui, descriviamo i metodi utilizzati per studiare la colonizzazione batterica e cambiamenti istopatologici in modelli murini di Helicobacter pylori-malattia correlata.
Abstract
Helicobacter pylori è un agente patogeno gastrico che è presente a metà della popolazione mondiale ed è una causa significativa della morbosità e della mortalità negli esseri umani. Diversi modelli di mouse dell'infezione gastrica Helicobacter sono stati sviluppati per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari per cui H. pylori batteri colonizzano lo stomaco degli umani e causare la malattia. Qui, descriviamo i protocolli per: 1) preparare sospensioni batteriche per l'infezione in vivo dei topi tramite sonda gastrica intragastrica; 2) determinare i livelli di colonizzazione batterica in tessuti gastrici del mouse, da reazione a catena della polimerasi (PCR) e contando praticabile; e 3) valutare le alterazioni patologiche, dall'istologia. Per stabilire la Helicobactinfezione nei topi, animali (SPF) esenti da patogeni specifici prima vengono inoculati con sospensioni (contenenti ≥ 105 unità formanti colonie, CFUs) di mouse-colonizzazione di ceppi di entrambi i pilori di Helicobacter o altre speci di Helicobacter gastrico da animali, come Helicobacter felis. Presso post-l'infezione tempo-punti appropriati, stomaci sono asportati e dissecati sagittally in due frammenti di tessuto uguale, ciascuno costituito da regioni antrum e corpo. Uno di questi frammenti viene quindi utilizzato per conteggio praticabile o estrazione del DNA, mentre l'altro è sottoposto a elaborazione istologica. Colonizzazione batterica e cambiamenti istopatologici nello stomaco possono essere valutati ordinariamente in sezioni di tessuto gastrico macchiate con macchie Warthin-Stellato, Giemsa o Haematoxylin ed eosina (H & E), come appropriato. Analisi immunologiche supplementari possono essere effettuati anche da immunohistochemistry o immunofluorescenza su sezioni di tessuto gastrico di topo. I protocolli descritti di seguito sono progettati specificamente per consentire la valutazione nei topi di patologie gastriche che assomigliano a quelli in umani relativi pilori del H. malattie, compreso infiammazione, atrofia della ghiandola e formazione follicolo linfoide. La preparazione dell'inoculo e protocolli intragastrico "gavage" possono anche essere adattati per studiare la patogenesi di altri patogeni enterici umani che colonizzano i topi, come Salmonella Typhimurium o Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori è un patogeno gastrico a forma di spirale, gram-negativo, umano presente in tutte le popolazioni in tutto il mondo, con tassi di infezione nei paesi in via di sviluppo stimati nell'ordine di 80%1. Anche se la maggior parte dei pilori del H.-individui infetti sono asintomatici, alcuni sviluppano malattie più gravi, che vanno dall'ulcerazione peptica a cancro gastrico2. H. pylori-tumori associati ampiamente sono caratterizzati da cambiamenti maligni in cellule epiteliali (GECs) o dalla formazione di tessuti linfoidi supplementare-nodale nello stomaco, risultante nell'adenocarcinoma gastrico o mucosa-collegato linfoide linfoma del tessuto (malto), rispettivamente. H. pylori è altamente adattato per sopravvivere nella nicchia ecologica dura dello stomaco dovuto alla presenza di vari fattori di virulenza e meccanismi che agevolino la sua adesione, la crescita e il metabolismo in questa nicchia. In particolare, i ceppi virulenti di H. pylori possiedono il 40 kb cag isola di patogenicità (cagPAI) che codifica circa 30 geni richiesti per la produzione di una tipo 4 secrezione sistema (T4SS)3,4 . CAG PAI-positivi sforzi dei pilori del H. sono associati con l'induzione dei livelli elevati di infiammazione cronica nell'ospite, che è stato implicato come un precursore essenziale di adenocarcinoma gastrico5.
In vivo modelli animali, soprattutto topi, sono state altamente informativi, consentendo ai ricercatori di studiare i contributi relativi di host, fattori ambientali e batterici su infezione da H. pylori e malattia risultato6. Gli studi hanno dimostrato in precedenza che prolungato di H. pylori infezione dei topi sui risultati C57BL/6 background genetico nello sviluppo della gastrite cronica e la ghiandola atrofia, entrambi tratti distintivi di H. pylori infezione7. Inoltre, l'infezione con la specie affini batterica felino/canino, H. felis, ha dimostrato di indurre la formazione di malto in topi con simile patologia e progressione di malattia come visto in umano MALT linfoma8,9. Il più comunemente usato H. pylori isolato negli studi di colonizzazione del mouse è il "Sydney sforzo 1" (SS1) ceppo10, che è cagPAI+ , ma ha un non-funzionale T4SS (T4SS−)11. Altri ceppi ampiamente usati includono H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 e X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Per infezioni da H. felis , il ceppo CS1 ("gatto a spirale 1", cagPAI–/T4SS−) è generalmente usato14.
Qui, forniamo un protocollo che descrive la preparazione di Helicobacter inoculi per l'infezione in vivo , la procedura per sonda gastrica intragastrica di topi, nonché metodi per la lavorazione dei tessuti per lo studio dei cambiamenti istopatologici nello stomaco. In particolare, questo articolo si concentrerà sui metodi istologici utilizzati per visualizzare la colonizzazione batterica e valutare i cambiamenti istopatologici, compreso formazione di malto, nella mucosa gastrica dei topi infettati. Alcuni dei metodi descritti qui può essere adattato allo studio di altri agenti patogeni dell'intestino quali S. Typhimurium o rodentium c..
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Protocol
1. crescita e preparazione di inoculi batterici
- Scongelare gli stock di glicerolo di H. pylori o felis H.15 da-80 ° C e sottocultura su piastre di agar sangue (HBA) cavallo composto da: n. 2 Base di Agar sangue (Vedi Tabella materiali); una versione modificata "Supplemento selettivo antibiotico di Skirrow" (che consiste di vancomycin, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL; trimetoprim, 5 µ g/mL; anfotericina B, 2,5 μg/mL); e 5 – 10% (v/v) cavallo sangue15,16. I batteri crescono bene nelle circostanze microaerobic in 2.5 o 3.5 L anaerobiche vasetti contenenti imballaggi appropriati gas (Vedi Tabella materiali), a 37 ° C.
Nota: Ceppi di H. pylori coltivato in queste condizioni devono essere sottoposta a subcoltura dopo 1 – 1,5 giorni di incubazione, mentre per H. felis, almeno 2 giorni di incubazione è generalmente richiesto. Mezzi di coltura e conservazione idonei sono stati descritti in dettaglio in precedenza15. -
Preparare gli inoculi batterici per infezione del mouse da culture di inizio a metà fase logaritmica. Batteri di raccolto delicatamente da piastre di agar dalle inondazioni ogni piatto con 1 – 2 mL di brodo di cervello cuore infusione (BHI). Aspirare le sospensioni da piastre con pipette Pasteur.
- In alternativa, preparare inoculi da batteri di Helicobacter che sono stati propagati in brodo BHI per 16 – 18 h15. In questo caso, raccogliere i batteri mediante centrifugazione a bassa velocità a 2.200 x g per 10 min a 4 ° C.
- Valutare la vitalità e la motilità dei batteri esaminando bagnato monta le preparazioni sotto microscopia di contrasto di fase (obiettivo 100 X). Preparare supporti bagnati di risospensione un loopful di batteri in una goccia di 10 – 20 μL di BHI brodo su un vetrino per microscopio. Nel caso di H. felis, che è un batterio molto più grande di H. pylori, è possibile utilizzare un emocitometro per contare con precisione il numero di batteri vitali. Confermare cultura purezza eseguendo una colorazione di Gram.
Nota: Utilizzare solo inoculi di H. pylori , se la maggior parte dei batteri hanno una forma bacillare o a spirale (la morfologia può variare a seconda del ceppo). H. felis inoculi principalmente devono contenere batteri a forma elicoidale. Non utilizzare inoculi se la maggior parte dei batteri hanno una morfologia coccoid, come queste forme non sono sostenibili e non istituirà un'infezione nei topi. -
Stimare il numero di batteri nell'inoculo contando sotto microscopia di contrasto di fase il numero approssimativo di batteri per ogni campo (obiettivo 100x) e utilizzando la seguente guida: 1 batterio per campo = circa 106 (di unità formanti colonie CFU) di Helicobacter/ml; 10 batteri per campo = circa 107 CFU/mL; 100 batteri per campo = circa 108 CFU/mL, ecc.
- Quando si utilizza un emocitometro, calcolare CFU/mL utilizzando la seguente formula:
CFU/mL = (numero medio di batteri in un campo di 4 x 4) x (fattore di diluizione) x (104).
- Quando si utilizza un emocitometro, calcolare CFU/mL utilizzando la seguente formula:
-
Se necessario, regolare la densità delle cellule batteriche dell'inoculo a circa 107– 108 CFU/mL di diluizione in brodo BHI.
- Per garantire la massima redditività batterica, è necessario utilizzare inoculi per sonda gastrica intragastrica appena possibile dopo la preparazione.
- Confermare sempre la densità delle cellule di H. pylori e vitalità eseguendo vitali conteggio di inoculi immediatamente dopo la procedura di "gavage" (Vedi sotto). Questo non è sempre possibile per H. felis, come di solito non forma colonie isolate su terreni di coltura. I numeri di vitali Helicobacters in inoculi non possono essere determinati mediante misurazione di densità ottica (un600) da solo come questo metodo non discrimina tra praticabile (cioè, bacillare/spirale/elicoidale) e non vitali ( cioè, coccoid) batteri.
- Utilizzare valori di densità ottica come mezzo per stimare i numeri di vitali H. pylori batteri in inoculi, ma in questo caso, è necessario prima di generare una curva di crescita. Per questo, i valori di600 A delle culture di H. pylori sono monitorati nel tempo e correlati direttamente contro i numeri di batteri vitali, determinati contando piastra.
Nota: Un metodo pratico per l'esecuzione di tali determinazioni di curva di crescita è ai batteri di coltura in terreno liquido (sezione 1.2), utilizzando boccette di coltura del tessuto di fondo piatto standard in un'incubatrice di 10% CO2 . I numeri di CFUs, determinato da aliquote delle colture ottenute ogni 4 – 6 h oltre i 2 – 3 giorni, vengono quindi confrontati ai corrispondenti A valori di600 17. D'importanza, curve di crescita devono essere generate per ogni ceppo di H. pylori , come questi possono crescere a tassi diversi e, inoltre, non tutti i ceppi crescono bene in 10% CO2.
2. intragastrico Gavage dei topi con Helicobacter
Nota: Questo metodo di intragastrico "gavage" può essere applicato ad altre specie batteriche che colonizzano l'intestino per esempio S. Typhimuriumrodentium c., Listeria monocytogenes.
- Utilizzare 6 – 8-settimana-vecchio, specifici esenti da patogeni (SPF) e Helicobacter-gratis topi maschi o femminili. Utilizzare animali con un background genetico C57BL/6 per gli esperimenti di infezione con H. pylori o H. felis. Nello studio presente, abbiamo usato wild-type (WT) e geneticamente topi C57BL/6 privi di un recettore immune innato chiave (definito knock-out o animali KO).
Nota: Topi su altri ambiti di provenienza genetici possono essere utilizzati anche per infezioni da Helicobacter , tuttavia, livelli di colonizzazione e gravità della malattia può essere influenzati dal tipo di host sfondo18,19. - Aspirare l'inoculo batterico (passo 1.5) in siringhe monouso da 1 mL e sostituire gli aghi forniti con 23 aghi di calibro sul quale sono apposte monouso polietilene cateteri (lunghezza, 6 – 8 cm; diametro interno, 0,58 mm). Fissare cateteri per gli aghi con l'applicazione di piccole strisce di plastica film (Vedi Tabella materiali). In alternativa, sostituire il gruppo ago/catetere utilizzando tubi di alimentazione sterile di plastica (x 38 calibro 20 mm).
- Fisicamente trattenere topi con una salda presa presso la collottola del collo e della coda.
Nota: Questa procedura può essere eseguita senza anestesia, o in alternativa, con l'uso di un anestetico per inalazione, quali metossifluorano o isoflurano15. - Inserire il catetere nella centro della mascella aperta e Guida in direzione caudale verso l'esofago. Estendere il collo del mouse per consentire facilità di accesso allo stomaco attraverso l'esofago (e lontano della trachea) fino a quando la maggior parte o tutto del catetere non è più visibile e si avverte una resistenza, corrispondenti alla base dello stomaco. Consegnare un'aliquota specifica, di solito 100 μL per inoculazione (Figura 1).
Nota: Topi devono essere gavaged con ≥ 105 CFU per garantire ottima patologia di malattia e di colonizzazione. - Mouse della camera in una struttura animale di SPF per tutta la durata dell'esperimento.
Nota: Patologia severa e l'adenocarcinoma in topi WT C57BL/6 è osservato solo a circa dopo l'infezione20 24 mesi. Tuttavia, questo effetto può essere accelerato in alcuni animali geneticamente modificati, o in topi con altri ambiti di provenienza genetici. - Al completamento della procedura "gavage", eseguire una modifica della tecnica miglia e Misra per determinare i numeri di vitali H. pylori batteri somministrata ai topi. Per questo, l'inoculo viene diluito serialmente (da 10− 1 a 10− 5) in BHI utilizzando il metodo descritto in dettaglio in precedenza15.
Nota: Al fine di assicurare l'isolamento delle singole colonie, HBA piastre dovrebbero essere riscaldati e asciugati in un'incubatrice di sicurezza biologica armadietto o 37 ° C per 10 – 15 min prima dell'uso.
3. tessuti da topi post-esperimento di raccolta
- Eutanasia topi da inalazione di biossido di carbonio o dislocazione cervicale, secondo il comitato etico competente per la sperimentazione animale.
- Aprire la cavità addominale e asportare lo stomaco usando le forbici fine, curve.
Nota: Sieri possono essere raccolti anche dalla puntura cardiaca per aiutare nelle indagini di risposte sistemiche all'infezione di Helicobacter . Inoltre, la raccolta di milza e linfonodi di paragastric sono utili nello studio della risposta immunitaria adattativa. - Tagliare lo stomaco lungo la maggior curvatura e rimuovere residuo cibo delicato lavaggio in sterile tampone fosfato salino (PBS) in una provetta 50 mL.
- Lavare lo stomaco nuovamente in PBS sterile e quindi registrare il peso bagnato utilizzando plastica tarato cm 6 capsule di Petri.
- Appiattire la pancia e sezionare sagittally in due frammenti di tessuto uguale, comprendenti ciascuno: antrum, corpo e regioni prestomaco non ghiandolare (Figura 2). Rimuovere la regione non ghiandolare e pesare una metà di ciascuno di stomaco prima di aggiungere o 1 mL di BHI sterile (per il conteggio praticabile) o snap congelamento in azoto liquido (per l'estrazione di DNA/RNA).
Nota: Le provette contenenti tessuto in BHI devono essere conservate nel ghiaccio finché non sono pronti per essere elaborati. Stomaco congelato automatici tessuti è utilizzabile anche per estrarre RNA o proteine per qPCR (PCR quantitativa) o analisi macchiantesi occidentali, rispettivamente. - Aggiungere altri stomaco la metà di un tubo da 15 mL contenente formalina al 10%. Immergere i tessuti in formalina al 10% per 10 s e poi appiattire al lato superiore dei tubi. Consentire tessuti correggere prima di ri-immersione in soluzione di formalina al 10% per un minimo di 24h.
Nota: Tessuti possono rimanere in formalina al 10% per molte settimane prima del trattamento per l'istologia. Conservazione prolungata del tessuto potrebbe, tuttavia, influire sulla sua architettura e/o l'antigenicità conseguente risultati non ottimali nelle analisi a valle.
4. conferma della colonizzazione batterica post-nell'infezione stomaco
-
Conteggio vitale dei pilori del H. nello stomaco
- Supplemento sterile HBA piastre con gli antibiotici supplementari (200 μg/mL bacitracina e 10 μg/mL di acido naladixic) prima di eseguire i conteggi di Colonia da mouse infetto stomaci16.
- Omogeneizzare le sezioni di stomaco neanche manualmente, utilizzando autoclavabili in polipropilene micropestles, oppure utilizzando uno strumento di dissociazione meccanica (Vedi Tabella materiali).
- Preparare diluizioni seriali duplicati (10− 1 a 10− 2) degli omogeneati gastrici risultanti in BHI sterile.
Nota: Diluizioni dovrebbero essere deciso basato sui carichi batterici tipici ottenuti per un determinato pilori del H. ceppo utilizzato per infezione, così come la durata dell'infezione. Campioni non diluiti possono anche essere utilizzati. - Dividere asciugati sommariamente piastre HBA (Vedi nota sopra) in tre o quattro segmenti. Utilizzando un adattamento della tecnica miglia e Misra, aggiungere 10 – 100 mL di ciascuna diluizione in un segmento della piastra agar e diffondere utilizzando cicli di plastica sterile15.
- Lasciate le piastre ad asciugare e poi metterli in posizione invertita (lato coperchio verso il basso) in barattoli di gas anaerobio. Per mantenere l'umidità nelle vaschette, includono una piastra Petri contenente acqua.
- Incubi, vasetti a 37 ° C fino a formano colonie (in genere 4 – 7 giorni).
- Enumerare o dei segmenti contenenti tra 10 e 100 colonie isolate.
Nota: Colonie di H. pylori e H. felis crescita sulle piastre possono essere distinti da quelli degli altri membri del microbiota gastrico murino utilizzando test dell'ureasi, catalasi e ossidasi standard. H. pylori e H. felis sono positivi per tutte le tre prove. - Calcolare il batterico carica come (CFU/g di tessuto), utilizzando la seguente formula:
[(Numero medio di colonie contato) × (fattore di diluizione) (volume placcato)] / (peso allo stomaco).
-
Rilevazione dell'infezione di H. felis in tessuti gastrici di Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Estrarre il DNA dagli stomaci del mouse utilizzando protocolli standard di isolamento del DNA, o un kit disponibile in commercio.
- Determinare la concentrazione di DNA dei campioni utilizzando una tecnica di fluorometrica (Vedi Tabella materiali).
- Impostare reazioni di PCR un frammento di 325-accoppiamenti (bp) di H. felis ureasi B gene (ureB)21di targeting. Ogni reazione deve contenere: 100 ng di DNA genomico; 1 mM ogni di andata (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3') e inversa (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3') primer; 200 mM dNTPs; 0,5 unità di Taq polimerasi e la quantità appropriata di buffer e acqua priva di nucleasi.
Nota: Questa coppia di oligonucleotidi è stata progettata per riconoscere e legarsi a sequenze omologhe dei geni sia pilori del H. e H. felis ureB ma quando sottoposti a condizioni di PCR di sotto, non quelli presenti ureB geni di enteroepatica Helicobacter spp. - Eseguire l'amplificazione di PCR utilizzando il seguente profilo termico: riscaldamento a 94 ° C per 5 min, seguita da 35 cicli di 94 ° C per 30 s, 61 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, prima che tiene a 20 ° C.
- Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarosio 2% per 30 min a 100 V.
5. analisi istologiche di Helicobacter -infettati sezioni di stomaco di topo
- Trattamento dei tessuti dello stomaco
- Rimuovere tessuti dello stomaco da formalina e posto nei piatti puliti Petri.
- Tagliare tessuti dello stomaco con un bisturi in strisce longitudinali uguali dimensioni diverse (ogni spessore di 2 – 3 mm) e posto in cassette incasso etichettati contenenti imbottitura in schiuma.
- Difficoltà tessuti stomaco inserendo l'incorporamento cassette in un vaso riempito con 80% di etanolo.
Nota: Lo stomaco può essere elaborato immediatamente o memorizzato fino a 1 – 2 giorni prima di procedere al passaggio successivo. - Stomaci di processo su un processatore automatico, programmato con le seguenti impostazioni:
Disidratazione: etanolo al 70% - 1 ciclo, 20 min; 90% etanolo - 1 ciclo, 20 min; 100% etanolo - 2 cicli, ogni 20min + 1 ciclo, ciclo di 40 min + 1, 1 h.
Compensazione: xilene – 2 cicli, 30 min ogni + 1 ciclo, 45 min.
Impregnazione: cera di paraffina a 60 ° C - 1 ciclo, 45 min + 1 ciclo, ciclo di 1 h + 1 h 1,25. - Rimuovere i campioni trattati dalla macchina e conservare a temperatura ambiente per inclusione in paraffina.
- Inclusione in paraffina dei tessuti gastrici trasformati
- Posizionare gli stampi base in acciaio inox sul palco dell'unità che utilizza per riscaldare le basi degli stampi.
Nota: L'incorporamento di macchina deve essere impostato a 60 ° C per inclusione in paraffina efficiente. - Posto cerato cassette contenenti i campioni in un'area di piastra calda vasca cera calda dell'incorporamento unità fino a quando la cera si scioglie completamente.
Nota: È consigliabile che il campione verranno incorporate poco dopo la cera si scioglie. Questo assicura che non si verifica indurimento dei tessuti. - Riempire metà degli stampi in acciaio inox con cera di paraffina. Usando il forcipe caldo, rimuovere strisce di tessuto dello stomaco le cassette e delicatamente spinge che lo stomaco strisce attraverso la paraffina alla base degli stampi. Orientare attentamente tessuto strisce ad angolo retto alla base degli stampi in modo che loro estremità tagliata siano rivolti verso l'alto.
Nota: La procedura seguente deve essere eseguita più rapidamente possibile per evitare l'indurimento e la separazione degli strati all'interno incorporato blocchi paraffina. Il corretto orientamento dei tessuti dello stomaco è critico per analisi successive. - Posizionare gli stampi sul piatto freddo dell'unità incorporamento per fissare i campioni e ri-orientare tessuti se necessario.
Nota: Se i tessuti diventano sloggiati e la paraffina comincia a indurirsi, mettere gli stampi indietro sulla piastra calda per fondere la cera e ri-incorporare tessuti in stampi. - Mettere la metà delle cassette incasso etichettate (che sono state utilizzate per la lavorazione dei tessuti) fino alla sommità degli stampi e riempire delicatamente con cera calda. Non consentire paraffina di overflow.
- Delicatamente posto stampi su un piatto freddo e lasciare per raffreddare.
- Una volta che la paraffina è completamente impostato, è possibile separare i blocchi incorporati dalle muffe. Cera di paraffina pulito in eccesso sui bordi del vassoio utilizzando un piatto caldo (impostare oltre 80 ° C) o un raschietto. Blocchi possono essere conservati a temperatura ambiente fino a sezionamento viene eseguita.
- Posizionare gli stampi base in acciaio inox sul palco dell'unità che utilizza per riscaldare le basi degli stampi.
- La divisione dei tessuti
- Chill blocchi di tessuto paraffina-incastonato sul ghiaccio e riscaldare a bagnomaria con acqua ultrapura a 40 – 45 ° C.
- Fissare la lama nel supporto del microtomo e impostare l'angolo di spoglia tra 1 – 5° per evitare il contatto tra il facet viso e coltello di blocco, prima di inserire blocchi di paraffina.
Nota: Assicurarsi di blocchi sono chiare di paraffina in eccesso acquisito dall'incorporamento, come questo può ostacolare la vestibilità del blocco. - Orientare la lama per un taglio dritto attraverso il blocco. Delicatamente tagliare 2 – 3 sezioni sottili per garantire il corretto posizionamento del blocco.
- Tagliare blocchi di uno spessore di circa 10 – 30 mm. Questo passaggio garantisce che sarà tagliata una superficie massima di ciascuna striscia di tessuto.
- Tagliare 10 µm sezioni e scartare qualsiasi che contengono fori causati da taglio.
- Attentamente pick up sezioni usando la pinzetta e renderli mobili nel bagno d'acqua per l'appiattimento. Utilizzare una pinzetta per separare ogni sezione.
- Raccogliere le sezioni dal bagno di acqua e posto su vetrini carica (Vedi Tabella materiali).
- Conservare in posizione verticale in un portavetrini diapositive e posto in un incubatore a 37 ° C. Sezioni a secco durante la notte.
- Memorizzare sezioni a temperatura ambiente a tempo indeterminato per analisi successive.
- Haematoxylin ed eosina (H & E) colorazione dei tessuti dello stomaco
- Sparaffinatura diapositive utilizzando 3 lavaggi di xilene per 5 minuti ciascuno, seguita da 3 lavaggi in etanolo al 100%, per 3 minuti ciascuno. Garantire soluzioni fresche vengono utilizzati in ogni fase.
- Sciacquare i vetrini in acqua corrente per 30 – 60 s.
- Rimuovere l'acqua in eccesso battendo delicatamente la parte inferiore delle diapositive su un tovagliolo di carta. Macchia con Haematoxylin filtrata per 3 min. Assicurarsi che le sezioni sono sufficientemente coperti con la soluzione.
- Sciacquare i vetrini sotto acqua corrente fino a quando non esce pulita.
- Immergere i vetrini in acqua di rubinetto di Scott per 8 – 10 s. Non esporre diapositive alla soluzione più di 10 s come questo si tradurrà in macchie più scure e intense. Colorazione di sezioni possono essere visti al microscopio. La macchiatura efficiente in questa fase si tradurrà in un colore 'azzurro'.
Nota: Preparare l'acqua del rubinetto di Scott sciogliendo 2 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3) e 20 g di solfato di magnesio (MgSO4) in 1 L di acqua distillata. - Sciacquare i vetrini in acqua corrente per 30 – 60 s.
- Rimuovere l'acqua in eccesso, come descritto nel passaggio 3 e quindi macchiare con filtrata 1% acquosa eosina per 3 min.
- Sciacquare i vetrini sotto acqua corrente fino a quando non esce pulita.
Nota: La macchiatura può essere valutata utilizzando un microscopio ottico. Se la colorazione è troppo scuro, diapositive possono essere disidratati in etanolo al 100% per più del tempo specificato. Se è necessaria la colorazione più scura, diapositive possono essere colorati con eosina per 1 – 2 min più a lungo, prima di procedere ai passaggi successivi. - Disidratare diapositive utilizzando 3 lavaggi di etanolo al 100% per 30 s ciascuno, seguita da 3 lavaggi di xilene per 2 minuti ciascuno. Garantire soluzioni fresche vengono utilizzati in ogni fase.
- Montare diapositive con mezzo di montaggio. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio al centro di un vetrino coprioggetto pulito prima di mettere delicatamente scivolo sulla parte superiore con le sezioni rivolte verso il basso.
Nota: Non asciugare diapositive prima copertina scivolando. - Posizionare le diapositive su una superficie piana e lasciare asciugare all'aria. Diapositive possono anche essere essiccati in una cappa per accelerare il tempo di asciugatura.
- Colorazione di Giemsa dei tessuti dello stomaco
- Sparaffinatura diapositive utilizzando 2 lavaggi di histolene per 5 minuti ciascuno, seguito da 2 lavaggi di etanolo al 100% per 3 minuti ciascuno e quindi un lavaggio finale in etanolo al 70% per un minimo di 3 assicura soluzioni fresche sono usate per ogni lavaggio.
- Sciacquare i vetrini in acqua corrente per 30 – 60 s.
- Preparare soluzione Giemsa con colorazione di Giemsa 20% con acqua distillata l'80%. Colorare i vetrini con la soluzione di Giemsa per 1 h.
- Mettere i vetrini in 100 mL di acqua distillata contenente 3 – 4 gocce di acido acetico per 2 – 3 s.
Nota: La soluzione deve essere mescolato bene prima dell'uso. In questa fase, diapositive dovrebbero apparire di colore blu pallido. - Lavare i vetrini in etanolo al 96% per 30 s.
- Lavare i vetrini in 3 bagni di isopropanolo per 2 min ciascuno, seguita da 3 bagni di histolene per 2 minuti ciascuno. Utilizzare fresco isopropanolo e histolene per ogni lavaggio.
- Vetrino coprioggetti diapositive con mezzo di montaggio, come descritto in precedenza.
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Representative Results
Questo protocollo descrive una tecnica di alimentazione mediante sonda gastrica orale per raggiungere intragastrica infezione da H. pylori o H. felis in modelli murini murino (Figura 1). A seguito di eutanasia, stomaci vengono rimossi, pesati e diviso in 2 metà uguali comprendenti antro, corpo e regioni non ghiandolare dei tessuti gastrici (Figura 2). La regione non ghiandolare viene rimosso prima di eseguire qualsiasi analisi.
Colonizzazione di successo degli animali è in genere confermata effettuando praticabile contando su H. pylori-infettati omogeneati gastrici e successivamente l'enumerazione singole colonie su piastre di HBA (Figura 3). In alternativa, PCR è impiegato per verificare l'infezione con H. felis utilizzando primers specifici, convalidato, direzionati a una regione di bp 325 del H. felis e geni di H. pylori ureB (Figura 4).
Tessuti gastrici vengono elaborati, embedded e sezionati per applicazioni istologiche a valle. La H & E tecnica di colorazione è usata per valutare l'istopatologia in Helicobacter-topi infettati. Nell'esempio corrente, topi WT C57BL/6 visualizzano moderati segni di infiammazione, compreso l'iperplasia (ingrossamento mucosa) ed atrofia della ghiandola a dopo l'infezione 6 mesi con H. felis. La presenza di infiltrati cellulari si possa osservare anche nel sotto-mucosa. È interessante notare, tuttavia, più grave infiammazione viene osservato nei topi KO allo stesso punto di tempo, con l'ulteriore presenza di follicoli linfoidi, situato in prossimità di infiltrati cellulari (Figura 5). Infine, H. felis batteri sono osservati nelle sezioni Giemsa-macchiate di stomaci infetti del mouse (Figura 6).
Figura 1: immagine che dimostra la tecnica sonda gastrica orale. Una siringa monouso da 1 mL e un catetere flessibile sono usati per fornire ≥ 105 CFU di inoculi batterici a un mouse per via intragastrica. Il mouse è stato anestetizzato usando metossifluorano e tenuto in una salda presa al collo, consentendo un accesso del catetere allo stomaco tramite l'esofago.
Figura 2: raccolta delle milze del mouse e stomaci post-infezione. Mouse stomaci erano post-eutanasia raccolto e il loro contenuto rimosso raschiando con un bisturi e lavaggio in PBS sterile. I tessuti sono sono poi pesati e appiattiti su un foglio di cotone per rivelare 2 uguale a metà, comprendenti ciascuno il antrum gastrico, corpo e regioni non ghiandolare; Barra della scala = 10 mm.
Figura 3: Conteggi possibili su H. pylori -infettato gli stomaci del mouse. Topi sullo sfondo C57BL/6 sono stati inoculati con 107 CFU di H. pylori SS1 e sinistra per 8 settimane. Diluizioni di (A) di ogni omogeneato gastrico sono piastrate su una metà (o terzo) di una piastra HBA e carichi batterici valutati enumerando 10-100 diverse colonie. La metà sinistra della piastra Mostra una coltura pura di H. pylori batteri. (B) la presenza di batteri contaminanti dal mouse gastrico microbiota (a sinistra) o il gran numero di colonie di H. pylori (a destra) può complicare l'enumerazione di H. pylori CFUs. (C) esempi comuni di batteri contaminanti in omogeneato gastrico campioni. Barra della scala = 1,7 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rilevazione di PCR dell'infezione di H. felis in biopsie gastriche utilizzando oligonucleotidi gene ureB di targeting. Una coppia di oligonucleotide specifico è stata progettata per riconoscere e legarsi a sequenze omologhe nei geni H. felis e di H. pylori ureB . Questi iniettori sono stati convalidati usando il DNA genomic da H. pylori SS1 (lane 2) o H. felis (corsia 3). Acqua deionizzata era inclusa come controllo negativo (corsia 1).
Figura 5: Immagini rappresentative di H & colorati stomaco sezioni da topi WT e KO a dopo l'infezione 6 mesi con H. felis. Sezioni di tessuto paraffina-incastonato erano macchiate con H & topi WT E. ricezione di brodo BHI da solo (controllo) avevano un epitelio gastrico normale e nessuna infiammazione significativa. Al contrario, gli animali WT con cronica H. felis infezione visualizzato moderati livelli di infiammazione e ispessimento della mucosa, che è stata ulteriormente aggravata in H. felis-KO animali infetti. Sezioni di tessuto H. felis-infetti KO topi hanno esibito la presenza di follicoli linfoidi mucosa (*), cellulare si infiltra in (→), atrofia della ghiandola (▶) e l'iperplasia. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini rappresentative delle sezioni gastriche Giemsa-macchiate da topi C57BL/6 WT a dopo l'infezione 3 mesi con H. felis. Sezioni di tessuto paraffina-incastonato erano macchiate con Giemsa. Le frecce indicano la presenza di H. felis in ghiandole gastriche. Barra della scala = 200 μm.
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Discussion
Questo protocollo descrive l'uso di un modello di topo in vivo per l'infezione di Helicobacter . I punti critici della procedura sono la: 1) preparazione di Helicobacter inoculi contenenti batteri vitali e mobili; 2) consegna dei numeri appropriati di batteri al mouse tramite sonda gastrica intragastrica; 3) rilevamento delle infezioni batteriche da Colonia contando e/o PCR; e 4) elaborazione dei tessuti gastrici per consentire la valutazione della istopatologia in infettato gli stomaci. Ulteriori suggerimenti per le modifiche, considerazioni sulla risoluzione dei problemi e tecniche sono discussi di seguito.
Il metodo di coltivazione Helicobacter spp utilizzando Blood Agar Base n ° 2 completati con sangue di cavallo è stato affermato nel nostro laboratorio. Tuttavia, agar alternativo basi come Brucella agar e agar sangue Columbia può anche essere usato22. È importante garantire che solo sterile cristalleria che è libero di detersivo viene utilizzato per preparare il mezzo di crescita. Inoltre, per ottenere una crescita ottimale, H. pylori batteri dovrebbero essere ordinariamente subcoltura su piastre di agar che hanno umidità residua e non sono asciutti. Durante la preparazione Helicobacter spp. inoculi per infezione, è vitale alla subcoltura dei pilori del H. e H. felis ceppi ogni 1 – 1,5 o 2 giorni, rispettivamente, per garantire redditività batterica. Presso ogni sottocultura, batteri dovrebbero essere valutati per la loro vitalità e la motilità di microscopia di contrasto di fase. Un test dell'ureasi può essere impiegato anche ordinariamente di discriminare tra gastrica Helicobacter spp. e altri batteri23, tuttavia, è importante rendersi conto che questo test rileva batteri di Helicobacter sia vitali e non vitali. A seguito di inoculazione degli animali, conteggi possibili su Helicobacter sospensioni devono essere eseguiti per quantificare il numero di batteri vitali usati per l'infezione. Come H. felis non riproducibile formano colonie isolate su agar media15, stima dei numeri batterici viene eseguita utilizzando la microscopia di contrasto di fase. Quantificazione dei numeri batterici mediante misurazione di densità ottica (un600) da solo è impreciso come questo metodo non discrimina tra batteri vitali e non vitali. Questo metodo non deve essere utilizzato nella ricerca di Helicobacter senza ottimizzazione rigorosa, come descritto in precedenza (sezione 1.5).
Quando si esegue studi di infezione di Helicobacter , è fondamentale considerare il mouse ottimo e ceppo di Helicobacter , nonché la durata dell'infezione, per soddisfare lo scopo dell'esperimento. È anche essenziale per confermare regolarmente che gli animali utilizzati per la sperimentazione sono infatti Helicobacter-gratuitamente utilizzando genere-specific PCR primer24. La presenza di altre specie di Helicobacter enterici, quali Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus o Helicobacter, può alterare la suscettibilità di malattia dei topi e introdurre fattori di confondimento in in vivo gli studi25,26. Si consiglia inoltre di includere un gruppo di controllo di finto trattamento di animali (cioè, nutrito brodo solo) in esperimenti di screening iniziale per studiare gli effetti del normale microbiota sulla colonizzazione di Helicobacter e patogenesi.
Post-eutanasia, colonizzazione di H. pylori in stomaci murini può essere misurata contando praticabile. Lastre HBA utilizzate per Colonia conteggi dovrebbero essere completati con acido bacitracina e naladixic oltre al supplemento selettivo di Skirrow modificate, per limitare la crescita di specie batteriche dal microbiota gastrico normale e quindi prevenire la contaminazione 27. H. felis non sempre formano colonie, ma invece tende a formare brulica crescita su agar piastre15,28. Di conseguenza, la PCR e qPCR sono normalmente impiegate per determinare la presenza e i livelli di H. felis, rispettivamente il29,30. Nella sezione 4.2, abbiamo introdotto un metodo PCR di semplice e veloce per confermare la colonizzazione da H. felis nello stomaco murino utilizzando una coppia di primers, che sono state convalidate per indirizzare una regione bp 325 H. felis e pilori del H. ureB geni. Utilizzando le condizioni PCR descritte sopra, è possibile discriminare tra infezione da questi gastrica Helicobacter spp. ed enteroepatica ureasi-produzione Helicobacters. Altri geni che sono stati convalidati per rilevazione di PCR dell'infezione gastrica Helicobacter comprendono il 16s rRNA e flagellina B (ciccia) geni15,29,30.
Infine, abbiamo descritto l'uso di due potenti tecniche di colorazione: H & E che macchia, per valutare i cambiamenti istopatologici post-nell'infezione stomaco; e Giemsa colorazione, per rilevare l'infezione H. felis . Per ottenere la marcatura ottimale, è essenziale garantire che tessuti sono state conservate, elaborate e incorporate con l'orientamento corretto. Inoltre, solo soluzioni preparate di fresco e filtrata macchie devono essere usate durante questo processo. Sezioni di tessuto possono essere conservate a tempo indeterminato e utilizzate per un'analisi più specifica della patologia gastrica mediante immunofluorescenza o immunoistochimica. Alcune altre misure comuni di infiammazione gastrica e malattia includono: reclutamento delle cellule immuni (anti-CD45 colorazione); ispessimento mucosa/distruzione (acido periodico Schiff/Alcian blu colorazione); proliferazione delle cellule epiteliali (l'antigene nucleare delle cellule, PCNA/bromodeossiuridina, BrDU colorazione); o apoptosi (TUNEL colorazione). I follicoli linfoidi osservati nel H & colorati tessuti dei topi di H. felis -infettata possono essere confermati mediante immunoistochimica, usando gli anticorpi diretti contro B (B220+) e delle cellule T (CD3+) antigeni31.
In sintesi, modelli animali di malattia batterica forniscono strumenti utili nel campo della biologia di infezione. I protocolli della sonda gastrica intragastrica e trattamento dei tessuti stomaco forniti qui possono essere adattati a modelli murini di infezione che coinvolge altri patogeni enterici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare la sig. ra r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann per assistenza tecnica. Gli autori riconoscono l'uso dei servizi e l'assistenza tecnica della piattaforma di istologia di Monash, dipartimento di anatomia e biologia inerente allo sviluppo, Monash University. Il laboratorio è sostenuto da finanziamenti del National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) per RLF (APP1079930, APP1107930). RLF è supportato da un Senior Research Fellowship da NHMRC (APP1079904). KD e MC sono entrambi supportati da Monash laurea Borse di studio. KD è supportato anche dal centro per l'immunità innata e contagiosa malattie, Hudson Institute of Medical Research, mentre MC ha una borsa di studio post-laurea internazionale dalla facoltà di medicina, infermieristica e scienze di salute, Università di Monash. Ricerca presso l'Hudson Institute of Medical Research è supportata dal programma di supporto dell'infrastruttura operativa del governo vittoriano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
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