Summary
Mus repræsenterer en uvurderlig i vivo model til at studere infektion og sygdomme forårsaget af gastrointestinale mikroorganismer. Her, vi beskriver de metoder, der anvendes til at studere bakteriel kolonisering og histopatologiske forandringer i musemodeller af Helicobacter pylori-relateret sygdom.
Abstract
Helicobacter pylori er en gastrisk patogen, der er til stede i halvdelen af verdens befolkning og er en væsentlig årsag til morbiditet og mortalitet hos mennesker. Flere musemodeller af gastrisk Helicobacter infektion har udviklet for at studere molekylære og cellulære mekanismer hvorved H. pylori bakterier kolonisere maven i menneskelige værter og forårsage sygdom. Heri, vi beskriver protokollerne til: 1) forberede bakteriel suspensioner i vivo infektion af mus via gastrisk sonde; 2) bestemme bakteriel kolonisering niveauer i mus gastrisk væv, ved polymerase kædereaktion (PCR) og levedygtige optælling; og 3) vurdere patologiske ændringer af histologi. For at etablere Helicobactøh infektion i mus, specifikt patogenfri (SPF) dyr podes først med suspensioner (indeholdende ≥105 kolonidannende enheder, CFUs) af mus-koloniserer stammer af enten Helicobacter pylori eller andre gastrisk Helicobacter spp. fra dyr, som f.eks Helicobacter felis. På passende tidspunkter efter infektionen, er maver skåret ud og dissekeret sagittally i to lige store væv fragmenter, hver bestående af regionerne antrum og krop. En af disse fragmenter er derefter bruges til enten levedygtigt optælling eller DNA-ekstraktion, mens den anden er udsat for histologiske behandling. Bakteriel kolonisering og histopatologiske forandringer i maven kan vurderes rutinemæssigt i gastrisk væv sektioner farves med Warthin-stjernehimmel, Giemsa eller Haematoxylin og Eosin (H & E) pletter, som passende. Yderligere immunologiske analyser kan også varetages af Immunhistokemi eller immunfluorescens på musen gastrisk væv sektioner. De protokoller er beskrevet nedenfor er specielt designet til at muliggøre vurdering i mus af gastrisk patologier ligner dem i menneskelige-relaterede H. pylori sygdomme, herunder betændelse, kirtel atrofi og lymfoide follikel dannelse. Inokulum forberedelse og gastrisk sonde protokoller kan også tilpasses studere patogenesen af andre enteriske menneskelige patogener, at koloniser mus, såsom Salmonella Typhimurium eller Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori er en spiralformet, gramnegative, menneskelige gastrisk patogen til stede i alle befolkninger i hele verden med smittede i udviklingslandene skønnes for at være i størrelsesordenen 80%1. Selv om de fleste H. pylori-smittede personer er asymptomatiske, nogle udvikle mere alvorlige sygdomme, lige fra peptisk ulceration til gastrisk kræft2. H. pylori-associeret kræftformer er bredt karakteriseret ved maligne forandringer i epitelceller (GECs) eller ved dannelse af ekstra nodal lymfoide væv i maven, resulterende i gastrisk adenokarcinom eller slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) lymfom, henholdsvis. H. pylori er stærkt tilpasset til at overleve i den barske økologiske niche af maven på grund af tilstedeværelsen af forskellige virulens faktorer og mekanismer lette dens overholdelse, vækst og stofskifte i denne niche. Især besidder virulente stammer af H. pylori 40 kb cag patogenicitet ø (cagPAI) der koder ca 30 gener kræves til produktionen af en Type 4 sekretion system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positive H. pylori stammer er forbundet med induktion af højere niveauer af kronisk betændelse i den vært, som har været impliceret som en vigtig forløber for gastrisk adenokarcinom5.
In vivo dyremodeller, især mus, har været yderst informativ ved at lade forskere at undersøge de relative bidrag af værten, bakteriel og miljømæssige faktorer på H. pylori -infektion og sygdom resultat6. Undersøgelser har tidligere vist, at langvarig H. pylori infektion af mus på C57BL/6 genetiske baggrund resulterer i udvikling af kronisk gastritis og kirtel atrofi, begge kendetegnende for H. pylori infektion7. Derudover har infektion med den relaterede katte/hunde bakteriearter, H. felis, vist sig at fremkalde MALT dannelse i mus med lignende patologi og sygdomsprogression, som set i menneskelige MALT lymfom8,9. De mest almindeligt anvendte H. pylori isolat i mus kolonisering undersøgelser er "Sydney stamme 1" (SS1) stamme10, som er cagPAI+ , men har en ikke-funktionel T4SS (T4SS−)11. Andre udbredte stammer omfatter H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 og X47-2AL (cagPAI-/T4SS−)13. For H. felis infektioner, stamme CS1 ("kat Spiral 1" cagPAI-/T4SS−) er generelt brugt14.
Heri, giver vi en protokol, der beskriver forberedelse af Helicobacter inocula for i vivo infektion, proceduren for gastrisk sonde af mus, samt metoder til behandling af væv til undersøgelse af histopatologiske forandringer i maven. Især vil denne artikel fokusere på de histologiske metoder bruges til at visualisere bakteriel kolonisering og vurdere histopatologiske forandringer, herunder MALT dannelse, i maveslimhinden af inficerede mus. Nogle af de metoder, der beskrives her kan tilpasses til studiet af andre gut patogener som S. Typhimurium eller C. rodentium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vækst og forberedelse af bakteriel Inocula
- Tø glycerol bestandene af H. pylori eller H. felis15 fra-80 ° C og subkultur på hest blod agar (HBA) plader bestående af: blod Agar Base No.2 (Se Tabel af materialer); en modificeret "Skirrows antibiotika selektiv supplement" (bestående af vancomycin, 10 μg/mL, polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µg/mL, amphotericin B, 2,5 μg/mL); og 5-10% (v/v) hest blod15,16. Bakterier vokse godt på microaerobic betingelser i 2,5 eller 3,5 L anaerob krukker indeholder de passende gas pakninger (Se Tabel af materialer), ved 37 ° C.
Bemærk: H. pylori stammer dyrkes under disse betingelser skal podes efter 1 – 1,5 dages inkubation, H. felis, mindst 2 dages inkubation er generelt kræves. Egnet kultur og opbevaring medier er blevet beskrevet i detaljer tidligere15. -
Forberede mus infektion fra tidlige-til-midten af logaritmiske fase kulturer bakterielle inocula. Høst bakterier forsigtigt fra agar plader af oversvømmelser hver plade med 1-2 mL af hjernen hjerte infusion (BHI) bouillon. Opsug suspensioner fra plader med Pasteur pipetter.
- Alternativt, forberede inocula fra Helicobacter bakterier, som er blevet opformeret i BHI bouillon for 16 – 18 h15. I dette tilfælde, indsamle bakterier ved lav hastighed centrifugering på 2.200 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Vurdere levedygtighed og motilitet af bakterierne ved at undersøge våde mount præparater under fase kontrast mikroskopi (100 X mål). Forbered våde mounts ved resuspending en oejefuld af bakterier i en 10 – 20 μL dråbe af BHI bouillon på et glas objektglas. I tilfælde af H. felis, som er en meget større bakterie end H. pylori, skal du bruge en hæmocytometer til præcist tælle antallet af levedygtige bakterier. Bekræfte kultur renhed ved at udføre en gramfarvning.
Bemærk: Kun bruge H. pylori inocula hvis fleste bakterier har en bacillær eller spiral form (morfologi kan variere afhængigt af stammen). H. felis inocula bør primært indeholder spiralformet-formede bakterier. Brug ikke inocula, hvis de fleste bakterier har en coccoid morfologi, som disse former er ikke levedygtige og etablerer ikke en infektion i mus. -
Estimere antallet af bakterier i inokulat ved at tælle under fase kontrast mikroskopi det omtrentlige antal bakterier pr. felt (100 X mål) og ved hjælp af følgende guide: 1 bakterie pr. felt = ca. 106 kolonidannende enheder () CFU) af Helicobacter/mL; 10 bakterier pr. felt = ca 107 CFU/mL; 100 bakterier pr. felt = ca 108 CFU/mL, osv.
- Når du bruger en hæmocytometer, beregne CFU/mL ved hjælp af følgende formel:
CFU/mL = (gennemsnitligt antal bakterier i en 4 x 4 felt) x (fortyndingsfaktoren) x (104).
- Når du bruger en hæmocytometer, beregne CFU/mL ved hjælp af følgende formel:
-
Justere bakteriel celle tætheden af inokulum til ca 107– 108 CFU/mL ved fortynding i BHI bouillon, hvis nødvendigt.
- For at sikre maksimal bakteriel levedygtighed, skal du bruge inocula til gastrisk sonde hurtigst muligt efter tilberedning.
- Altid bekræfte H. pylori celle tæthed og levedygtighed ved at udføre levedygtige optælling af inocula umiddelbart efter sonde procedure (se nedenfor). Det er ikke altid muligt for H. felis, da det ikke udgør normalt isolerede kolonier på dyrkningsmedier. Antallet af levedygtige Helicobacters i inocula kan ikke bestemmes af optisk tæthed måling (en600) alene, som denne metode ikke diskriminerer mellem levedygtige (dvs.bacillær/spiral/helical) og ikke-levedygtige ( dvs., coccoid) bakterier.
- Bruge ekstinktionen værdier som et middel til at anslå antallet af levedygtige H. pylori bakterier i inocula, men i dette tilfælde er det nødvendigt først at generere en vækstkurve. For dette, A600 værdier af H. pylori kulturer overvåges over tid og korreleret direkte mod antallet af levedygtige bakterier, bestemt ved optælling af pladen.
Bemærk: En praktisk metode til at udføre sådanne vækst kurve bestemmelser er at kultur bakterier i lage (punkt 1.2), ved hjælp af standard flad bund vævskultur flasker placeret i en 10% CO2 inkubator. Numrene på CFUs, bestemt ud fra delprøver af de kulturer, der er fremstillet hver 4-6 h over 2-3 dage, er derefter sammenlignet med den tilsvarende en600 værdier17. Vigtigere, skal vækstkurver oprettes for hver H. pylori stamme, som disse kan vokse ved forskellige satser, og desuden, ikke alle stammer vokse godt i 10% CO2.
2. gastrisk sonde af mus med Helicobacter
Bemærk: Denne metode af gastrisk sonde kan anvendes til andre bakteriearter, at koloniser gut f.eks. S. TyphimuriumC. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Brug 6-8 uger gamle, specifikt patogenfri (SPF) og Helicobacter-fri mandlige eller kvindelige mus. Bruge dyr med C57BL/6 genetiske baggrund for infektion eksperimenter med H. pylori eller H. felis. I den foreliggende undersøgelse, vi brugte wild-type (WT) og genetisk modificeret C57BL/6 mus mangler en nøgle medfødte immun receptor (betegnes knock-out eller KO dyr).
Bemærk: Mus på andre genetiske baggrunde kan også bruges til Helicobacter infektioner, men kolonisering niveauer og sygdommens sværhedsgrad kan blive påvirket af typen af vært baggrund18,19. - Opsug den bakterielle inokulum (trin 1,5) i engangs 1 mL sprøjter og erstatte de medfølgende nåle med 23 gauge nåle som er anbragt engangs polyethylen katetre (længde, 6 – 8 cm, indvendig diameter, 0.58 mm). Fastgør katetre til nålene ved anvendelse af små strimler af plastic film (Se Tabel af materialer). Alternativt kan du erstatte nål/kateter forsamlingen ved hjælp af sterile plastik fodring rør (20 gauge x 38 mm).
- Fysisk begrænse mus med et fast greb på harmoniske hals og hale.
Bemærk: Denne procedure kan udføres uden bedøvelse, eller alternativt, med brug af inhaleret bedøvelse, såsom methoxyflurane eller isofluran15. - Indsæt kateter ind i midten af åbne kæben og guide i en caudale retning mod spiserøret. Forlænge halsen af musen til at give nem adgang til maven gennem spiserøret (og fra luftrøret) til de fleste eller alle af kateteret er ikke længere synlig og en modstand føles, svarende til bunden af maven. Levere en specifik alikvot, normalt 100 μL per podning (figur 1).
Bemærk: Mus bør være gavaged med ≥ 105 CFU at sikre optimal kolonisering og sygdom patologi. - Hus mus i en SPF dyr facilitet for varigheden af forsøget.
Bemærk: Alvorlig patologi og adenokarcinom i WT C57BL/6 mus er kun observeret på ca 24 måneder efter infektionen20. Men denne effekt kan fremskyndes i visse genetisk modificerede dyr, eller mus med andre genetiske baggrunde. - Efter afslutningen af proceduren mavesonde, udføre en ændring af Miles og Misra teknikken til at bestemme antallet af levedygtige H. pylori bakterier administreret til mus. For dette, inokulat er seriefremstillede fortyndet (fra 101 til 10−5) i BHI ved hjælp af metoden beskrevet i detaljer tidligere15.
Bemærk: For at sikre isolering af enkelt kolonier, HBA plader skal varmes og tørret i en biologisk sikkerhed kabinet eller 37 ° C inkubator for 10-15 min før brug.
3. høst væv fra mus efter eksperiment
- Aflive mus enten CO2-indånding eller livmoderhalskræft dislokation, efter den relevante etiske komité for dyreforsøg.
- Åbn i bughulen og punktafgifter maven ved hjælp af fine, buet saks.
Bemærk: Sera kan også afhentes af cardiac punktering til støtte i forbindelse med undersøgelsen af systemiske reaktioner på Helicobacter infektion. Derudover samling af milt og paragastric lymfeknuder er nyttige i at studere adaptive immunrespons. - Skåret maven langs den større krumning og fjerne resterende mad ved skånsom vask i sterile phosphat bufferet saltvand (PBS) i en 50 mL rør.
- Vask maven igen i steril PBS og derefter registrere den våd vægt ved hjælp af tareret 6 cm plastik petriskåle.
- Flatten maven og dissekere sagittally i to lige store væv fragmenter, hver bestående af: antrum, krop og ikke-glandulær formaven regioner (figur 2). Fjern de ikke-glandulær region og vejer en halvdel af hver mave før du tilføjer til enten 1 mL sterilt BHI (til levedygtige optælling) eller snap frysning i flydende kvælstof (for DNA/RNA udvinding).
Note: Rør indeholdende væv i BHI skal opbevares på is, indtil de er klar til at blive behandlet. Fastgør frosne mave væv kan også bruges til at udtrække RNA eller proteiner til qPCR (kvantitativ PCR) eller western blotting analyser, henholdsvis. - Tilføje andre maven halvdelen til en 15 mL tube, som indeholder 10% formalin. Fordyb væv i 10% formalin for 10 s og derefter tromle til oversiden af rør. Tillad væv til rette, før re nedsænkning i 10% formalin løsning i mindst 24 timer.
Bemærk: Væv kan forblive i 10% formalin i mange uger inden forarbejdning til histologi. Langvarig opbevaring af væv kan dog påvirke dens arkitektur og/eller antigenicity resulterer i sub-optimale resultater i downstream analyser.
4. bekræftelse af bakteriel kolonisering i maven efter infektionen
-
Levedygtige optælling af H. pylori i maven
- Supplement sterile HBA plader med ekstra antibiotika (200 μg/mL bacitracin og 10 μg/mL naladixic syre) inden du udfører koloni tæller fra inficerede mus maver16.
- Homogeniseres mave sektioner enten manuelt, ved hjælp af autoklaverbart polypropylen micropestles, eller ved hjælp af en mekanisk dissociation instrument (Se Tabel af materialer).
- Forberede dublerede serielle fortyndinger (101 til 10−2) af den resulterende gastrisk homogeniseret i sterile BHI.
Bemærk: Fortyndinger bør være besluttet baseret på de typiske bakteriel belastninger fremstillet for en given H. pylori stamme bruges til infektion, samt varigheden af infektion. Ufortyndet prøver kan også bruges. - Opdele pre tørrede HBA plader (se bemærkning ovenfor) i tre eller fire segmenter. Ved hjælp af en tilpasning af Miles og Misra teknik, tilføje 10-100 mL af hver fortynding på et segment af agar plade og spredes ved hjælp af sterile plastik sløjfer15.
- Tillad plader til tørre og derefter placere dem i en inverteret positionslygter låg ned i anaerobe gas krukker. For at opretholde fugtigheden i krukker, omfatte en petriskål, der indeholder vand.
- Inkuber krukker ved 37 ° C, indtil kolonier danner (typisk 4-7 dage).
- Optælles segmentet(med) indeholdende mellem 10 og 100 isolerede kolonier.
Bemærk: H. pylori kolonier og H. felis vækst på plader kan skelnes fra de øvrige medlemmer af den murine gastriske mikrobiota ved hjælp af urease, catalase og oxidase standardtest. H. pylori og H. felis er positive for alle tre prøver. - Beregne bakterielle belastninger som (CFU/g af væv), ved hjælp af følgende formel:
[(Gennemsnitlige antal kolonier tælles) × (fortyndingsfaktoren) x (volumen belagt)] / (mave vægt).
-
Påvisning af H. felis infektion i gastrisk væv ved Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Uddrag DNA fra mus maver ved hjælp af DNA isoleret standardprotokoller, eller et kommercielt tilgængeligt kit.
- DNA-koncentrationen af prøver med en teknik, fluorometriske kvantitering (Se Tabel af materialer).
- Opsætning af PCR reaktioner rettet mod en 325-basepar (bp) fragment af H. felis urease B genet (ureB)21. Hver reaktion bør indeholde: 100 ng af genomisk DNA; 1 mM af frem (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3') og omvendt (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3') primere; 200 mM dNTP'er; 0,5 enheder af Taq-Polymerase og de relevante mængder af buffer og nukleasen-gratis vand.
Bemærk: Denne oligonukleotid par er udformet til at genkende og binde sig til homolog sekvenser i både H. pylori og H. felis ureB gener, men når de udsættes for PCR betingelserne nedenfor, ikke de tilstedeværende i ureB gener af enterohepatiske Helicobacter spp. - Udføre PCR-amplifikation ved hjælp af følgende varmeprofilen: varme på 94 ° C i 5 min, efterfulgt af 35 cyklusser af 94 ° C til 30 s, 61 ° C til 30 s og 72 ° C i 1 min., før holding ved 20 ° C.
- Køre PCR-produkter på en 2%-agarosegel i 30 min. ved 100 V.
5. histologiske analyser af Helicobacter -inficerede mus mave sektioner
- Behandling af mave væv
- Fjerne mave væv fra formalin og sted i ren petriskåle.
- Skåret maven væv med en skalpel i flere lige store langsgående strimler (hver 2-3 mm tyk) og placere i mærket indlejring kassetter indeholdende skum polstring.
- Fix mave væv ved at placere indlejring kassetter i en krukke fyldt med 80% ethanol.
Bemærk: Maver kan behandles straks eller gemt i op til 1-2 dage før går videre til næste trin. - Processen maver på en automatiseret væv processor, programmeret med følgende indstillinger:
Dehydrering: 70% ethanol - 1 cyklus, 20 min. 90% ethanol - 1 cyklus, 20 min. 100% ethanol - 2 cykler, 20 min + 1 cyklus, 40 min + 1 cyklus, 1 h.
Clearing: xylen – 2 cykler, 30 min + 1 cyklus, 45 min.
Imprægnering: paraffin voks på 60 ° C - 1 cyklus, 45 min + 1 cyklus, 1 h + 1 cyklus, 1,25 h. - Fjerne de forarbejdede prøver fra maskinen og opbevares ved stuetemperatur til integrering af paraffin.
- Paraffin indlejring af forarbejdede gastrisk væv
- Placer rustfrit stål base forme på scenen af indlejring enheden for at varme baserne af formene.
Bemærk: Indlejring maskine bør fastsættes til 60 ° C for effektiv paraffin indlejring. - Sted voksede kassetter med prøverne i en varm voks bad/hot plade område af indlejring enheden indtil voks er fuldt opløst.
Bemærk: Det anbefales, at prøven være integreret kort efter voks opløses. Dette sikrer, at hærdning af væv ikke forekommer. - Fylde halvdelen af rustfrit stål forme med paraffinvoks. Ved hjælp af varme pincet, fjerne mave væv strimler fra kassetter og forsigtigt skubbe maven strips gennem paraffinen til bunden af formene. Nøje orientere væv strimler i en ret vinkel til bunden af formene, således at enderne skiver opad.
Bemærk: Følgende trin skal udføres så hurtigt som muligt at undgå hærdning og adskillelse af paraffin lag inden for indlejrede blokke. Den korrekte orientering af maven væv er kritisk for downstream analyser. - Placer forme på køleplade af indlejring enheden for at lave modellerne i sted og re orientere væv, hvis nødvendigt.
Bemærk: Hvis væv blive forskubbet og paraffin begynder at hærde, placere forme tilbage på varmepladen smelter voks og igen integrere væv i forme. - Læg halvdelen af mærket indlejring kassetter, (som blev brugt til væv forarbejdning) på toppen af formene og forsigtigt fyldes med varm voks. Tillad ikke paraffin til overløb.
- Forsigtigt placere forme på en kold tallerken og afkøles.
- Når paraffinen er fuldt ud indstillet, adskille de indlejrede blokke fra forme. Ren overskydende paraffin voks på kassette kanter ved hjælp af en varmeplade (fastsat over 80 ° C) eller en skraber. Blokke kan opbevares ved stuetemperatur indtil skæring er udført.
- Placer rustfrit stål base forme på scenen af indlejring enheden for at varme baserne af formene.
- Skæring af væv
- Chill paraffin-embedded væv blokke på is og varme vandbad fyldt med ultrarent vand til 40-45 ° C.
- Sikre klinge i indehaveren af mikrotomen og indstille frivinkel mellem 1-5° til at undgå kontakt mellem blok ansigt og kniv facet, før du indsætter paraffinblokke.
Bemærk: Sikre blokke er klart af overskydende paraffin erhvervet fra integrering, som dette kan hindre anfald af blokken. - Orientere kniv til et lige snit på tværs af blokken. Blidt skær 2-3 tynde sektioner for at sikre korrekt placering af blokken.
- Trim blokke af en tykkelse på ca. 10-30 mm. Dette trin sikrer, at en maksimal areal for hver væv strimmel vil blive skåret.
- Skære 10 µm sektioner og kassere enhver der indeholder huller forårsaget af trimning.
- Omhyggeligt afhente sektioner ved hjælp af pincet og flyde dem i vandbad til udfladning. Bruge pincet til at adskille hver sektion.
- Indsamle sektioner fra vandbadet og sted på ladet glas dias (Se Tabel af materialer).
- Gemme dias oprejst i en slide rack og sted i en inkubator ved 37 ° C. Tørre sektioner natten over.
- Gemme sektioner ved stuetemperatur på ubestemt tid for efterfølgende analyser.
- Haematoxylin og Eosin (H & E) farvning af maven væv
- Afvoksning dias ved hjælp af 3 vasker xylen i 5 min hver, efterfulgt af 3 vasker i 100% ethanol, i 3 min. Sikre frisk løsninger anvendes i hver fase.
- Skyl dias i vand fra hanen i 30 – 60 s.
- Fjern overskydende vand ved forsigtigt at trykke i bunden af dias på et stykke køkkenrulle. Pletten med filtrerede Haematoxylin i 3 min. at sikre, at sektioner er tilstrækkeligt dækket med løsningen.
- Skyl dias under rindende vand, indtil vandet løber klar.
- Dyp dias i Scotts postevand for 8-10 s. Udsæt ikke dias til løsningen, der er mere end 10 s som dette vil resultere i mørkere og intens pletter. Farvning af afsnittene kan ses under et mikroskop. Effektiv farvning på dette stadium vil resultere i en baby blå farve.
Bemærk: Forberede Scotts postevand ved at opløse 2 g natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) og 20 g magnesiumsulfat (MgSO4) i 1 L destilleret vand. - Skyl dias i vand fra hanen i 30 – 60 s.
- Fjern overskydende vand som beskrevet i trin 3, og derefter pletten med filtreret 1% vandig Eosin i 3 min.
- Skyl dias under rindende vand, indtil vandet løber klar.
Bemærk: Farvning kan vurderes ved hjælp af et lysmikroskop. Hvis farvningen er for mørkt, kan dias blive dehydreret i 100% ethanol i længere tid end det angivne tidspunkt. Hvis mørkere pletter er påkrævet, kan dias farves med Eosin i 1-2 min. længere, inden proceduren til efterfølgende trin. - Dehydrere dias ved hjælp af 3 vasker 100% ethanol til 30 s hver, efterfulgt af 3 vasker xylen i 2 min. Sikre frisk løsninger anvendes i hver fase.
- Montere dias med montering medium. Tilføj en dråbe af montering medium midt i en ren coverslip før forsigtigt placerer slide på toppen med sektioner vender nedad.
Bemærk: Tør ikke dias før dæksel glider. - Placer dias på en flad overflade og lad lufttørre. Dias kan også tørres i et stinkskab at fremskynde tørretid.
- Giemsa farvning af maven væv
- Afvoksning dias ved hjælp af 2 gange vask af histolene for 5 min hver, efterfulgt af 2 vasker 100% ethanol i 3 min og derefter en sidste vask i 70% ethanol i 3 min. sikre frisk løsninger anvendes for hver vask.
- Skyl dias i vand fra hanen i 30 – 60 s.
- Forberede Giemsa løsning ved at blande 20% Giemsa pletten med 80% destilleret vand. Pletten dias med Giemsa løsning for 1 h.
- Placer dias i 100 mL destilleret vand indeholdende 3-4 dråber af eddikesyre til 2-3 s.
Bemærk: Løsning skal være blandet godt før brug. På dette stadium bør diasenes bleg blå farve. - Vask dias i 96% ethanol til 30 s.
- Vask dias i 3 bade af isopropanol i 2 min. hver, efterfulgt af 3 bade af histolene for 2 min. Brug frisk isopropanol og histolene for hver vask.
- Coverslip glider med montering medium, som beskrevet tidligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver en mundtlig sonde teknik for at opnå gastrisk infektion med H. pylori eller H. felis i murine musemodeller (figur 1). Efter eutanasi, maver fjernet, vejes og opdelt i 2 lige store halvdele bestående af antrum, krop og ikke-glandulær regioner af gastrisk væv (figur 2). Ikke-glandulær regionen er fjernet inden du udfører nogen analyser.
Vellykket kolonisering af dyr er typisk bekræftet ved at udføre levedygtige regner H. pylori-inficeret gastrisk homogeniseret, og efterfølgende optælling af enkelte kolonier på HBA plader (figur 3). Alternativt, PCR er ansat til at kontrollere infektion med H. felis ved hjælp af specifikke, validerede primere rettet mod en 325 bp region H. felis og H. pylori ureB gener (figur 4).
Gastrisk væv behandles, integrerede og sektioneret for downstream histologiske applikationer. H & E farvning teknik bruges til at vurdere histopatologisk i Helicobacter-inficerede mus. I det aktuelle eksempel vise WT C57BL/6 mus moderat tegn på betændelse, herunder hyperplasi (udvidede mucosa) og kirtel atrofi på 6 måneder efter infektionen med H. felis. Tilstedeværelsen af cellulære infiltrater kan også observeres i sub slimhinden. Interessant, men er mere alvorlige betændelse observeret i KO mus på det samme tidspunkt, med den ekstra tilstedeværelsen af lymfoide follikler beliggende i umiddelbar nærhed af cellulære infiltrater (figur 5). Endelig, H. felis bakterier er observeret i Giemsa-farvede dele af inficerede mus maver (figur 6).
Figur 1: billedet viser den mundtlige sonde teknik. En engangs 1 mL sprøjte og fleksible kateter bruges til at levere ≥105 CFU af bakterielle inocula at en mus via gastrisk rute. Musen var bedøvede ved hjælp af methoxyflurane og holdt i et fast greb i nakken, giver mulighed for adgang af kateter i maven via spiserøret.
Figur 2: høst af musen milt og maver efter infektionen. Musen maver var høstet efter eutanasi og deres indhold fjernes ved at skrabe med en skalpel og vask i steril PBS. Væv blev derefter vejet og fladtrykt på en bomuld ark til at afsløre 2 lige halvdele, hver bestående af mavens antrum, krop og ikke-glandulær regioner; Skalalinjen = 10 mm.
Figur 3: Levedygtige tæller på H. pylori -inficerede mus maver. Mus på C57BL/6 baggrund blev podet med 107 CFU af H. pylori SS1 og venstre i 8 uger. (A) fortyndinger af hvert gastrisk homogenatet er belagt på et halvt (eller tredje) af en HBA plade og bakteriel belastninger vurderes ved optælling 10-100 enkelte kolonier. Den venstre halvdel af pladen viser en ren kultur af H. pylori bakterier. (B) tilstedeværelsen af kontaminerende bakterier fra musen gastrisk mikrobiota (venstre) eller store tal af H. pylori kolonier (til højre) kan komplicere tælling af H. pylori CFUs. (C) almindelige eksempler på forurenende bakterier i gastrisk homogenatet prøver. Skalalinjen = 1,7 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: PCR påvisning af H. felis infektion i gastrisk biopsier ved hjælp af oligonukleotider målretning ureB genet. En bestemt oligonukleotid par var designet til at genkende og binde sig til homolog sekvenser i både H. felis og H. pylori ureB gener. Disse primere blev valideret ved hjælp af genomisk DNA fra H. pylori SS1 (lane 2) eller H. felis (lane 3). Deioniseret vand blev inkluderet som en negativ kontrol (lane 1).
Figur 5: Repræsentative billeder af H & E-farvede mave sektioner fra WT og KO mus på 6 måneder efter infektionen med H. felis. Paraffin-embedded væv sektioner var plettet med H & E. WT mus modtage BHI bouillon alene (kontrol) havde en normal gastrisk epitel og ingen betydelig inflammation. I kontrast, WT dyr med kronisk H. felis infektion vises moderate niveauer af betændelse og slimhinde fortykkelse som blev yderligere forværret i H. felis-inficeret KO dyr. Væv sektioner fra H. felis-inficeret KO mus udstillet tilstedeværelsen af slimhinde lymfoide follikler (*), cellulære infiltrater (→), kirtel atrofi (▶) og hyperplasi. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative billeder af Giemsa-farvede gastrisk sektioner fra C57BL/6 WT mus på 3 måneder efter infektionen med H. felis. Paraffin-embedded væv sektioner var plettet med Giemsa. Pilene indikerer tilstedeværelsen af H. felis i de gastriske kirtler. Skalalinjen = 200 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af en i vivo musen model for Helicobacter infektion. De kritiske trin af proceduren er det: 1) forberedelse af Helicobacter inocula som indeholder levedygtige og motile bakterier; 2) levering af den passende antal bakterier til musen via gastrisk sonde; 3) påvisning af bakteriel infektion af kolonien optælling og/eller PCR; og 4) behandling af gastrisk væv til at muliggøre vurdering af histopatologisk i inficeret maver. Yderligere forslag til ændringer, fejlfinding og tekniske overvejelser diskuteres nedenfor.
Metoden for voksende Helicobacter spp. ved hjælp af blod Agar Base no. 2 suppleret med hest blod har været veletablerede i vores laboratorium. Men alternative agar baserer såsom Brucella agar og Columbia blod agar kan også være brugt22. Det er vigtigt at sikre, at kun sterile glasvarer, der er fri for vaskemiddel bruges til at forberede vækstmediet. Desuden, for at opnå optimal vækst, H. pylori bakterier bør være rutinemæssigt podes på agar plader, der har resterende fugt ikke og tør. Når du forbereder Helicobacter spp. inocula for infektion, det er afgørende at subkultur H. pylori og H. felis stammer hver 1-1,5 eller 2 dage, henholdsvis, for at sikre bakteriel levedygtighed. På hver subkultur, skal bakterier vurderes for deres levedygtighed og motilitet af fase kontrast mikroskopi. En urease assay kan også rutinemæssigt ansat til at skelne mellem gastrisk Helicobacter spp. og andre bakterier23, men det er vigtigt at indse, at denne analyse registrerer både levedygtige og ikke-levedygtige Helicobacter bakterier. Efter podning af dyr, skal der foretages levedygtige tæller på Helicobacter suspensioner for at kvantificere antallet af levedygtige bakterier til infektion. Da H. felis ikke udgør reproducerbar isolerede kolonier på agar medium15, foretages vurdering af bakteriel numre ved hjælp af fase kontrast mikroskopi. Kvantificering af bakteriel numre af optisk tæthed måling (en600) alene er unøjagtige, som denne metode ikke diskriminerer mellem levedygtige og ikke-levedygtige bakterier. Denne metode bør ikke anvendes i Helicobacter forskning uden strenge optimering, som beskrevet ovenfor (afsnit 1.5).
Når du udfører Helicobacter infektion undersøgelser, er det afgørende at overveje den optimale mus samt Helicobacter stamme og længden af infektion, der passer til formålet med forsøget. Det er også vigtigt at regelmæssigt bekræfte, at de dyr, der anvendes til forsøg er faktisk Helicobacter-gratis brug af slægten-specifikke PCR-primere24. Tilstedeværelsen af andre enteriske Helicobacter arter, såsom Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus eller Helicobacter muridarum, kan ændre sygdommen modtagelighed af mus og indføre konfunderende faktorer i i vivo undersøgelser25,26. Det er også tilrådeligt at medtage en mock behandling kontrolgruppe af dyr (dvs., fodret bouillon kun) i indledende screening eksperimenter til at undersøge virkningerne af den normale mikrobiota på Helicobacter kolonisering og patogenese.
Efter eutanasi, H. pylori kolonisering i murine maver kan måles ved optælling af levedygtige. HBA plader anvendes til kolonien tæller bør suppleres med bacitracin og naladixic syre ud over den modificerede Skirrow selektive supplement, at begrænse væksten af bakteriearter fra den normale gastriske mikrobiota og dermed forhindre forurening 27. H. felis ikke altid danner kolonier, men i stedet har tendens til at danne myldrende vækst på agar plader15,28. Derfor, PCR og qPCR er normalt ansat til at bestemme tilstedeværelsen og niveauer af H. felis, henholdsvis29,30. I afsnit 4.2, indførte vi en enkel og hurtig PCR metode for at bekræfte kolonisering af H. felis i murine maven ved hjælp af et par af primere, der er valideret til at målrette en 325 bp region H. felis og H. pylori ureB gener. Ved hjælp af PCR betingelserne beskrevet ovenfor, er det muligt at skelne mellem infektion med disse gastrisk Helicobacter spp. og urease-producerende enterohepatiske Helicobacters. Andre gener, der er blevet valideret for PCR påvisning af gastrisk Helicobacter infektion omfatter 16s rRNA og flagellin B (flaB) gener15,29,30.
Endelig, vi har beskrevet brugen af to kraftfulde farvning teknikker: H & E farvning, for at vurdere histopatologiske forandringer i maven efter infektionen; og Giemsa farvning, for at opdage H. felis infektion. For at opnå optimal farvning, er det vigtigt at sikre, at væv har bevaret, behandlet og indkapslet i den rigtige retning. Derudover kun frisk fremstillede opløsninger og filtreret skal pletter bruges under denne proces. Væv sektioner kan gemmes på ubestemt tid og udnyttet til mere specifikke analyser af gastrisk patologi via immunofluorescens eller Immunhistokemi. Nogle andre fælles foranstaltninger af gastrisk betændelse og sygdom omfatter: immun celle rekruttering (anti-CD45 farvning); slimhinde fortykkelse/destruktion (periodiske syre Schiff/Alcian blå farvning); epitelcelle spredning (prolifererende celle nukleare antigen, PCNA/Bromodeoxyuridine, BrDU farvning); eller cellulære apoptose (TUNEL farvning). De lymfoide follikler observeret i H & E-farvede væv af H. felis -inficerede mus kan bekræftes ved Immunohistokemi, ved hjælp af antistoffer rettet mod B (B220+) og T-celle (CD3+) antigener31.
I Resumé giver animalske modeller af bakteriel sygdom værdifulde værktøjer inden for infektion biologi. Protokoller af gastrisk sonde og behandling af mave væv til rådighed her kan tilpasses til musemodeller infektion der involverer andre enteriske patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Ms. A. De Paoli og Ms. Georgie Wray-McCann for teknisk bistand. Forfatterne anerkender brugen af faciliteter og tekniske bistand Monash histologi Platform, Institut for anatomi og udviklingsmæssige biologi, Monash University. Laboratoriet er støttet af midler fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) til RLF (APP1079930, APP1107930). RLF understøttes af en Senior Research Fellowship fra NHMRC (APP1079904). KD og MC understøttes både af Monash ph.d. stipendier. KD er også støttet af centret for medfødt immunitet og smitsom sygdomme, Hudson Institute of Medical Research, mens MC har en International Postgraduate Scholarship fra Faculty of Medicine, sygepleje og sundhedsvidenskab, Monash University. Forskning ved Hudson Institute for Medical Research er støttet af den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
