Summary
Os ratos representam um modelo inestimável na vivo para estudar a infecção e doenças causadas por microorganismos gastrointestinais. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para estudar a colonização bacteriana e alterações histopatológicas em modelos do rato do Helicobacter pylori-doenças relacionadas.
Abstract
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico que está presente em metade da população mundial e é uma importante causa de morbidade e mortalidade em seres humanos. Vários modelos de rato da infecção gástrica por Helicobacter foram desenvolvidos para estudar os mecanismos moleculares e celulares, segundo o qual a bactéria H. pylori coloniza o estômago de hospedeiros humanos e causar doença. Aqui, descrevemos os protocolos: 1) preparar suspensões bacterianas para a infecção na vivo de ratos através de gavagem intragástrico; 2) determinar os níveis de colonização bacteriana nos tecidos gástricos de rato, por reação em cadeia da polimerase (PCR) e a contagem viável; e 3) avaliar as alterações patológicas, pela histologia. Para estabelecer Helicobacter infecção em ratos, os animais (SPF) isentos de agentes patogénicos específicos primeiro são inoculados com suspensões (contendo ≥ 105 unidades formadoras de colônia, CFUs) de cepas de rato-colonização de qualquer Helicobacter pylori ou outros gástrica spp. Helicobacter de animais, tais como felis Helicobacter. A pós-infecção pontos de tempo apropriado, estômagos são extirpados e dissecados essas em dois fragmentos de tecido igual, cada um compreendendo as regiões de antro e corpo. Dentre estes fragmentos é usado para contagem viável ou extração de DNA, enquanto o outro é submetido a processamento histológico. Colonização bacteriana e alterações histopatológicas no estômago poderão ser avaliadas rotineiramente em seções do tecido gástrico manchadas de Warthin-Starry, Giemsa ou hematoxilina e eosina (H & E) manchas, conforme apropriado. Análises imunológicas adicionais também podem ser efectuadas por imuno-histoquímica ou imunofluorescência em secções de tecido gástrico de rato. Os protocolos descritos abaixo são projetados especificamente para permitir a avaliação em ratos de patologias gástricas, parecidos com os de humanos relacionados com H. pylori doenças, incluindo inflamação, atrofia da glândula e formação de folículos linfoides. A preparação do inóculo e protocolos de gavage intragástrico também podem ser adaptados para estudar a patogênese de outros patógenos humanos entéricos que colonizam a ratos, tais como Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico em forma de espiral, Gram-negativo, humano presente em todas as populações em todo o mundo, com taxas de infecção nos países em desenvolvimento, estima-se que na ordem de 80%1. Embora a maioria dos H. pylori-indivíduos infectados são assintomáticos, alguns desenvolvem doenças mais graves, variando de ulceração péptica a câncer gástrico2. H. pylori-cancros associados amplamente são caracterizadas por alterações malignas nas células epiteliais (GECs) ou pela formação de tecidos linfoides extra nodais no estômago, resultando em adenocarcinoma gástrico ou mucosa associada linfoide linfoma do tecido (MALT), respectivamente. H. pylori é altamente adaptado para sobreviver no nicho ecológico duro do estômago devido à presença de vários fatores de virulência e mecanismos para facilitar a sua aderência, o crescimento e o metabolismo nesse nicho. Em particular, cepas virulentas de H. pylori possuem a 40KB cag ilha de patogenicidade (cagPascoal) que codifica aproximadamente 30 genes necessários para a produção de um tipo 4 secreção system (T4SS)3,4 . CAG Pascoal-positivo cepas de H. pylori são associadas com a indução de níveis mais elevados de inflamação crônica no acolhimento, que tem sido implicado como um precursor essencial do adenocarcinoma gástrico5.
Na vivo modelos animais, particularmente os ratos, tem sido altamente informativos, permitindo que os pesquisadores a investigar as contribuições relativas de anfitrião, bacterianas e condições ambientais na infecção pelo H. pylori e doença resultado6. Estudos têm demonstrado anteriormente que prolongou o H. pylori infecção de ratos sobre os resultados do fundo genético de C57BL/6 no desenvolvimento da gastrite crônica e glândula atrofia, as duas principais características do H. pylori infecção7. Além disso, a infecção com as espécies bacterianas relacionadas canino/felino, a H. felis, foi mostrada para induzir a formação de malte em camundongos com patologia semelhante e progressão da doença, visto na humana malte linfoma8,9. O mais comumente usado o H. pylori isolada em estudos de colonização do rato é o "Sydney tensão 1" (SS1) tensão10, que é o cagPascoal+ , mas tem um T4SS não-funcional (T4SS−)11. Outras cepas amplamente utilizadas incluem H. pylori B128 7.13 (cagPascoal+/T4SS+)12 e X47-2AL (cagPascoal–/T4SS−)13. Para H. felis infecções, a estirpe CS1 ("gato espiral 1", cagPascoal–/T4SS−) é usado geralmente14.
Neste documento, nós fornecemos um protocolo descrevendo a preparação de inóculos de Helicobacter infecção na vivo , o procedimento para gavage intragástrico de ratos, bem como métodos para o processamento dos tecidos para o estudo das alterações histopatológicas no estômago. Em particular, este artigo focalizará os métodos histológicos usado para visualizar a colonização bacteriana e avaliar as mudanças histopatológicas, incluindo formação de malte, na mucosa gástrica de ratos infectados. Alguns dos métodos descritos aqui podem ser adaptados para o estudo de outros patógenos de intestino como S. Typhimurium ou c. rodentium.
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Protocol
1. crescimento e preparação de inóculos bacterianos
- Descongelar a existências de glicerol de H. pylori ou H. felis15 de-80 ° C e a subcultura em placas de ágar sangue (HBA) cavalo compreendendo: Agar sangue Base n º 2 (ver Tabela de materiais); uma modificada "Suplemento de Skirrow seletivo antibióticos" (consistindo de vancomicina, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL trimetoprim, 5 µ g/mL; anfotericina B, 2,5 μg/mL); e 5 – 10% (v/v) cavalo sangue15,16. As bactérias crescem bem em condições de microaerobic em 2.5 ou 3.5 L anaeróbicos frascos contendo os pacotes de gás apropriado (consulte a Tabela de materiais), a 37 ° C.
Nota: Cepas de H. pylori crescidas sob estas condições devem ser repicagem depois de 1-1,5 dias de incubação, Considerando que para H. felis, pelo menos 2 dias de incubação é geralmente necessária. Meios adequados de armazenamento e cultura têm sido descritos em detalhe anteriormente15. -
Prepare inóculos bacterianos para infecção de rato de culturas do início a meados de fase logarítmica. Colheita de bactérias suavemente de placas de ágar inundando cada prato com 1 a 2 mL de caldo de infusão (BHI) cérebro coração. Aspire suspensões de placas com pipetas Pasteur.
- Em alternativa, prepare inóculos de bactérias Helicobacter tem sido propagada em caldo BHI para 16 – 18 h15. Neste caso, recolher as bactérias por centrifugação de baixa velocidade a 2.200 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
- Avalie a viabilidade e motilidade das bactérias examinando molhado monte preparações sob microscopia de contraste de fase (objetivo de X 100). Prepare montagens molhadas por resuspending um loopful de bactérias em gotas 10 – 20 μL de BHI caldo em uma lâmina de vidro de microscópio. No caso de H. felis, que é uma bactéria muito maior do que o H. pylori, use um haemocytometer para contar com precisão o número de bactérias viáveis. Confirme a pureza da cultura através da realização de uma coloração de Gram.
Nota: Utilize apenas inóculos de H. pylori , se a maioria das bactérias têm uma forma bacilar ou espiral (a morfologia pode variar dependendo da estirpe). H. felis inóculos principalmente devem conter bactérias helicoidais em forma de. Não use inóculos se a maioria das bactérias têm uma morfologia cocoides, estas formas não são viáveis e não estabelecerá uma infecção em camundongos. -
Estimar o número de bactérias no inóculo pela contagem sob microscopia de contraste de fase o número aproximado de bactérias por campo (objetivo de X 100) e usando o seguinte guia: 1 bactéria por campo = aproximadamente 106 (de unidades formadoras de colônia CFU) de Helicobacter/mL; 10 bactérias por campo = aproximadamente 107 UFC/mL; 100 bactérias por campo = aproximadamente 108 UFC/mL, etc.
- Ao usar um haemocytometer, calcule UFC/mL, usando a seguinte fórmula:
UFC/mL = (número médio de bactérias em um campo de 4 x 4) x (fator de diluição) x (104).
- Ao usar um haemocytometer, calcule UFC/mL, usando a seguinte fórmula:
-
Ajuste a densidade da célula bacteriana do inóculo para aproximadamente 107– 108 UFC/mL por diluição em caldo BHI, se necessário.
- Para garantir máxima viabilidade bacteriana, use inóculos para gavage intragástrico logo que possível após o preparo.
- Sempre confirme a densidade de células de H. pylori e viabilidade realizando contagem viável dos inóculos imediatamente após o procedimento de gavagem (veja abaixo). Isto não é sempre possível para H. felis, como geralmente não formar colônias isoladas em meios de cultura. Os números de s de Helicobacterviável em inóculos não podem ser determinados pela medição da densidade óptica (600) sozinha como esse método não discrimina entre viável (ou seja, bacilar/espiral/helicoidal) e não-viáveis ( ou seja, cocoides) bactérias.
- Usar valores de densidade óptica como um meio de estimar os números de viável de H. pylori bactérias em inóculos, mas neste caso, é primeiro necessário para gerar uma curva de crescimento. Para isso, os valores das culturas de H. pylori 600 são monitorados ao longo do tempo e correlacionados diretamente contra o número de bactérias viáveis, determinados pela contagem de placa.
Nota: É um método conveniente para a realização de tais determinações de curva de crescimento bactérias da cultura em meio líquido (seção 1.2), usando frascos de cultura de tecidos de fundo plano padrão colocados numa incubadora 10% CO2 . Os números de CFUs, determinados a partir de alíquotas das culturas obtidas a cada 4-6 h durante 2-3 dias, então são comparados com o correspondente A600 valores17. Importante, curvas de crescimento devem ser geradas para cada estirpe de H. pylori , como estas podem crescer em ritmos diferentes e, além disso, nem todas as cepas crescem bem em 10% CO2.
2. intragástrico Gavage de ratos com Helicobacter
Nota: Este método de gavage intragástrico pode ser aplicado a outras espécies de bactérias que colonizam o intestino , por exemplo, S. Typhimuriumc. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Uso 6 – 8 semanas de idade, específico com isentos de agentes patogénicos (SPF) e Helicobacter-livre de ratos machos ou fêmeas. Use animais com um fundo genético C57BL/6 para experimentos de infecção com H. pylori ou H. felis. No presente estudo, nós usamos o selvagem-tipo (WT) e modificado geneticamente camundongos C57BL/6 falta um receptor imune inato chave (denominado nocaute ou animais KO).
Nota: Mouses em outros planos de fundo genéticos também podem ser usados para infecções de Helicobacter , no entanto, os níveis de colonização e severidade da doença podem ser afetados pelo tipo de anfitrião fundo18,19. - Aspire o inóculo bacteriano (passo 1.5) para seringas descartáveis de 1ml e substituir as agulhas fornecidas com 23 agulhas de calibre, em que se encontram os cateteres de polietileno descartáveis aposta (comprimento, 6 a 8 cm; diâmetro interno, 0,58 mm). Apertem os cateteres para as agulhas pela aplicação de pequenas tiras de plástico filme (ver Tabela de materiais). Como alternativa, substitua o conjunto agulha/cateter usando plástico estéril, tubos de alimentação (20 gauge x 38 mm).
- Impedir fisicamente ratos com um aperto firme na nuca do pescoço e cauda.
Nota: Este procedimento pode ser realizado sem anestesia, ou alternativamente, com o uso de um anestésico inalado, tais como Metoxiflurano ou isoflurano15. - Introduza o cateter no centro da mandíbula aberta e guia em uma direção caudal para o esôfago. Esticar o pescoço do rato para permitir a facilidade de acesso ao estômago através do esôfago (e longe da traqueia) até a maioria ou todos do cateter não é mais visível e sentir uma resistência, correspondente à base do estômago. Entrega uma alíquota específica, geralmente 100 μL por inoculação (Figura 1).
Nota: Os ratos devem ser gavaged com ≥ 105 CFU para garantir patologia ideal de colonização e doença. - Ratos de casa em uma facilidade animal SPF para a duração do experimento.
Nota: Patologia severa e adenocarcinoma em camundongos WT C57BL/6 só é observada em aproximadamente pós-infecção20 24 meses. No entanto, este efeito pode ser acelerado em alguns animais geneticamente modificados, ou em camundongos com outras origens genéticas. - Após a conclusão do procedimento de gavage, realizar uma modificação da técnica milhas e Misra para determinar os números de viável de H. pylori bactérias administradas a ratos. Para isso, o inóculo é serialmente diluído (a partir de 10− 1 a 10,5) em BHI usando o método descrito em detalhe anteriormente15.
Nota: A fim de garantir o isolamento das colônias simples, placas HBA devem ser aquecidas e seco em uma incubadora de segurança biológica gabinete ou 37 ° C durante 10 a 15 min antes de usar.
3. colheita de tecidos de ratos pós-experiência
- Eutanásia em ratos, por inalação de dióxido de carbono ou deslocamento cervical, de acordo com o Comité deontológico competente a experimentação animal.
- Abrir a cavidade abdominal e excisar o estômago com uma tesoura curva, bem.
Nota: Sera também pode ser coletado por punção cardíaca para auxiliar na investigação de respostas sistêmicas à infecção Helicobacter . Além disso, a coleção de baços e linfonodos paragastric são úteis no estudo de respostas imunes adaptáveis. - Cortar o estômago ao longo da curvatura maior e remover alimentos residual de gentil lavagem em tampão de fosfato estéril salino (PBS) em um tubos de 50 mL.
- Lavar o estômago novamente em PBS estéril e depois gravar o peso molhado usando pratos de Petri plástico tarada 6 cm.
- Achatar o estômago e dissecar essas em dois fragmentos de tecido igual, cada contendo: o antro, corpo e regiões não-glandular forestomach (Figura 2). Remover a região não-glandular e pesar uma metade de cada um no estômago antes de adicionar a ou 1 mL de BHI estéril (para contagem viável) ou snap congelamento em nitrogênio líquido (para extração de DNA/RNA).
Nota: Tubos contendo tecido em BHI devem ser armazenados em gelo até que estejam prontos para serem processados. Encaixe os tecidos congelados do estômago também podem ser usados para extrair o RNA ou proteínas para qPCR (PCR quantitativo) ou análises de mancha ocidentais, respectivamente. - Adicione o outro estômago metade para um tubo de 15 mL contendo formol a 10%. Mergulhe tecidos em formol a 10% por 10 s e depois achate ao lado superior dos tubos. Permitir que os tecidos corrigir antes de re-imersão em solução de formalina 10% por um período mínimo de 24 h.
Nota: Os tecidos podem permanecer em formol a 10% por muitas semanas antes da sua transformação para a histologia. Armazenamento prolongado do tecido pode, no entanto, afetar sua arquitetura e/ou a antigenicidade, resultando em resultados abaixo do ideal em análises a jusante.
4. a confirmação da colonização bacteriana na pós-infecção estômago
-
Contagem viável de H. pylori no estômago
- Suplemento estéril placas HBA com antibióticos adicionais (200 μg/mL bacitracina e ácido de naladixic de 10 μg/mL) antes de executar a colônia contagens de rato infectado estômagos16.
- Homogeneizar as seções do estômago também manualmente, usando micropestles de polipropileno autoclavável, ou usando um instrumento de dissociação mecânica (ver Tabela de materiais).
- Prepare diluições em série duplicadas (10− 1 a 10− 2) do homogenates gástrico resultante em BHI estéril.
Nota: As diluições devem ser decididas com base nas cargas bacterianas típicas obtidas para um determinado H. pylori estirpes utilizadas para infecção, bem como a duração da infecção. Amostras não diluídas podem também ser usadas. - Divida pré-secada as placas HBA (ver nota acima) em três ou quatro segmentos. Usando uma adaptação da técnica milhas e Misra, adicionar 10 – 100 mL de cada diluição para um segmento da placa de ágar e espalhar usando laços de plástico estéril15.
- Permitir que as placas secar e depois colocá-los em posição invertida (lado da tampa para baixo) em frascos de gás anaerobe. Para manter a umidade em frascos, incluem uma placa de Petri contendo água.
- Incube frascos a 37 ° C até colônias formam (geralmente 4-7 dias).
- Enumere ou nos segmentos contendo entre 10 e 100 colônias isoladas.
Nota: Colônias de H. pylori e o crescimento de H. felis em placas podem ser distinguidas dos outros membros da microbiota gástrica murino usando testes padrão da urease, catalase e oxidase. H. pylori e H. felis são positivos para todos os três testes. - Calcular o bacteriano carrega como (CFU/g de tecido), usando a seguinte fórmula:
[(Número médio de colônias contadas) × (fator de diluição) x (volume de chapeado)] / estômago (peso).
-
Detecção da infecção por H. felis em tecidos gástrico pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Extrai DNA de estômagos de rato usando protocolos padrão de isolamento de DNA, ou um kit disponível comercialmente.
- Determinar a concentração de DNA das amostras usando uma técnica de quantificação fluorométrica (ver Tabela de materiais).
- Configure as reações de PCR como alvo um fragmento de pares 325-base (bp) da urease B H. felis gene (ureB)21. Cada reação deve conter: 100 ng de DNA genômico; 1 mM de avanço (5'-AAA ATC CAC GAA GAC ro GG-3') e reversa (5'-CTT TTA TCC AAG ro ro CAC ACC-3') as primeiras demão; 200 mM dNTPs; 0,5 unidades de Taq polimerase e as quantidades adequadas de buffer e água livre de nuclease.
Nota: Este par do oligonucleotide foi concebido para reconhecer e ligar com sequências homólogas nos genes de ureB tanto a H. pylori e a H. felis mas quando sujeito às condições abaixo, não os presentes na ureB PCR genes de entero-hepática Helicobacter spp. - Executar a amplificação por PCR usando o seguinte perfil térmico: aquecimento a 94 ° C por 5 min, seguido por 35 ciclos de 94 ° C por 30 s, 61 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min, antes segurando a 20 ° C.
- Execute produtos do PCR em um gel de agarose 2% por 30 min a 100 V.
5. histológicas análises de Helicobacter -infectados seções de estômago do rato
- Processamento dos tecidos do estômago
- Remova os tecidos do estômago do formol e coloque em pratos de Petri limpa.
- Corte os tecidos do estômago com um bisturi em vários tamanhos iguais tiras longitudinais (cada 2-3 milímetros grosso) e coloque rotulados encastre cassetes contendo o estofamento da espuma.
- Reparar os tecidos do estômago colocando fitas incorporação em um frasco enchido com 80% de etanol.
Nota: Estômagos podem ser processados imediatamente ou armazenados por até 1 a 2 dias antes de prosseguir para a próxima etapa. - Estômagos de processo em um processador de tecido automatizado, programado com as seguintes configurações:
Desidratação: 70% de etanol - 1 ciclo, 20 min; etanol a 90% - 1 ciclo, 20 min; 100% de etanol - 2 ciclos, 20 min cada + 1 ciclo, 40 min + 1 ciclo, 1 h.
Compensação: xileno – 2 ciclos, 30 min cada + 1 ciclo, 45 min.
Impregnação: cera de parafina a 60 ° C - 1 ciclo, 45 min + 1 ciclo, ciclo de 1 h + 1 h 1,25. - Retire da máquina, as amostras processadas e armazenar à temperatura ambiente para a incorporação de parafina.
- Parafina a incorporação dos tecidos gástricos transformados
- Coloque os moldes base de aço inoxidável no palco da unidade de incorporação para aquecer as bases dos moldes.
Nota: Incorporando a máquina deve ser fixado em 60 ° C, para a incorporação de parafina eficiente. - Lugar de encerar cassettes contendo as amostras em uma área cera morna quente banho/placa da unidade de incorporação, até cera dissolve-se totalmente.
Nota: É recomendável que a amostra ser incorporado logo após a cera se dissolve. Isso garante que não ocorra o endurecimento dos tecidos. - Encha até metade dos moldes de aço inoxidável com cera de parafina. Usando pinça quente, retire as tiras de tecido do estômago do cassettes e suavemente empurrar que o estômago tiras através da parafina para a base dos moldes. Oriente cuidadosamente as tiras de tecido em um ângulo direito à base dos moldes para que suas extremidades fatiadas estão virada para cima.
Nota: As seguintes etapas devem ser executadas mais rapidamente possível para evitar o endurecimento e a separação entre as camadas de parafina dentro de blocos incorporados. A orientação adequada dos tecidos do estômago é essencial para análises a jusante. - Coloque os moldes na placa fria da unidade de incorporação para corrigir os espécimes no lugar e reorientar os tecidos se necessário.
Nota: Se os tecidos se tornam desalojados e a parafina começa a endurecer, coloque moldes volta na chapa quente para derreter a cera e re-incorporar tecidos em moldes. - Coloque metade das fitas encastre rotuladas (que eram usadas para o processamento do tecido) sobre o cimo dos moldes e preencher suavemente com cera quente. Não permita que parafina a transbordar.
- Delicadamente, coloque os moldes para um prato frio e deixe arrefecer.
- Uma vez que a parafina tem totalmente definido, separe os blocos incorporados de moldes. Limpe o excesso da cera de parafina nas bordas de fita usando uma placa quente (definido acima de 80 ° C) ou um raspador. Blocos podem ser armazenados à temperatura ambiente até o corte é realizado.
- Coloque os moldes base de aço inoxidável no palco da unidade de incorporação para aquecer as bases dos moldes.
- Corte de tecidos
- Blocos de parafina do tecido no gelo de relaxar e aquecer num banho de água cheio de água ultrapura para 40-45 ° C.
- Fixar a lâmina no suporte do micrótomo e definir o ângulo de incidência entre 1 – 5° para evitar o contato entre o bloco face e faca faceta, antes de inserir blocos de parafina.
Nota: Certifique-se de blocos são claros de parafina em excesso, adquirida a partir da incorporação, pois isso pode impedir o ajuste do bloco. - Oriente a lâmina para um corte reto do outro lado do bloco. Delicadamente, corte 2 – 3 secções finas para garantir o correto posicionamento do bloco.
- Corte blocos por uma espessura de cerca de 10 a 30 mm. Esta etapa assegura que uma superfície máxima de cada tira de tecido será cortada.
- Corte 10 µm seções e descartar qualquer que contêm buracos causados por aparar.
- Cuidadosamente pegar seções usando uma pinça e eles flutuam em banho-maria para achatamento. Use uma pinça para separar cada seção.
- Recolha seções do banho de água e coloque em lâminas de vidro carregada (veja a Tabela de materiais).
- Armazenar slides na posição vertical em um porta-lâminas e coloque em uma incubadora a 37 ° C. Seções de secas durante a noite.
- Armazenar as seções em temperatura ambiente por tempo indeterminado para análises subsequentes.
- Hematoxilina e eosina (H & E) coloração dos tecidos do estômago
- Dewax slides usando 3 lavagens de xileno por 5 min cada, seguido de 3 lavagens em etanol 100%, por 3 min cada. Certifique-se de soluções novas são utilizadas em cada estágio.
- Enxágue slides na água da torneira para 30 a 60 s.
- Remova o excesso de água batendo suavemente a parte inferior dos slides em uma toalha de papel. Mancha com hematoxilina filtrada por 3 min. Assegure-se que as seções são suficientemente cobertos com a solução.
- Enxágue slides sob água corrente até que água saia clara.
- Mergulhe os slides na água da torneira de Scott para 8 – 10 s. Não exponha os slides para a solução mais do que 10 s como isto irá resultar em manchas mais escuras e intensas. Coloração de seções pode ser visto sob um microscópio. Coloração eficiente nesta fase resultará em uma cor 'azul bebé'.
Nota: Prepare a água da torneira de Scott, dissolver 2 g de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) e 20 g de sulfato de magnésio (MgSO4) em 1 litro de água destilada. - Enxágue slides na água da torneira para 30 a 60 s.
- Remover o excesso de água, conforme descrito na etapa 3 e em seguida mancha com filtrado 1% eosina aquosa por 3 min.
- Enxágue slides sob água corrente até que água saia clara.
Nota: A coloração pode ser avaliada usando um microscópio de luz. Se a coloração é muito escura, slides podem ser desidratados em etanol 100%, por mais que o tempo especificado. Se a coloração mais escura é necessária, slides podem ser manchados com eosina por 1 – 2 min mais, antes de prosseguir para as etapas subsequentes. - Desidratar slides usando 3 lavagens de etanol 100% por 30 s cada, seguido de 3 lavagens de xileno por 2 min cada. Certifique-se de soluções novas são utilizadas em cada estágio.
- Monte lâminas com meio de montagem. Adicione uma gota de meio de montagem no centro de uma lamela limpo antes de colocar suavemente o slide no topo com seções virado para baixo.
Nota: Não seque slides antes da capa escorregando. - Coloque slides sobre uma superfície plana e deixar secar ao ar. Slides também podem ser secados em uma coifa para acelerar o tempo de secagem.
- Coloração de Giemsa dos tecidos do estômago
- Dewax slides usando 2 lavagens de histolene por 5 min cada, seguido por 2 lavagens de etanol 100% por 3 min cada e, em seguida, uma lavagem final em etanol a 70% por 3 min. Certifique-se de soluções frescas são usadas para cada lavagem.
- Enxágue slides na água da torneira para 30 a 60 s.
- Prepare a solução de Giemsa misturando 20% Giemsa mancha com água destilada de 80%. Mancha de slides com Giemsa solução por 1h.
- Coloque slides em 100 mL de água destilada contendo 3-4 gotas de ácido acético para s de 2 – 3.
Nota: Solução deve ser misturada bem antes de usar. Nesta fase, slides devem aparecer azul pálido na cor. - Lavar as lâminas em etanol a 96% para 30 s.
- Lave slides em 3 banhos de isopropanol por 2 min cada, seguido de 3 banhos de histolene por 2 min cada. Use o isopropanol fresco e histolene para cada lavagem.
- Lamela desliza com meio de montagem, conforme descrito anteriormente.
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Representative Results
Este protocolo descreve uma técnica de gavagem oral para alcançar intragástrico infecção com H. pylori ou H. felis em modelos do rato murino (Figura 1). Após eutanásia, estômagos são removidos, pesados e divididos em 2 metades iguais, compreendendo os antro, corpo e regiões não-glandular dos tecidos gástricos (Figura 2). A região não-glandular é removida antes de realizar qualquer análise.
Colonização bem sucedida dos animais é normalmente confirmada realizando viável contando com H. pylori-infectado homogenates gástrica e posteriormente, enumerando as colônias individuais em placas HBA (Figura 3). Alternativamente, a PCR é empregado para verificar a infecção com H. felis usando específicas, validados primers dirigidos em uma região de bp 325 do H. felis e genes de H. pylori ureB (Figura 4).
Tecidos gástricos são processados, incorporado e seccionado para aplicações a jusante histológicas. A H & E técnica de coloração é usada para avaliar a histopatologia em Helicobacter-infectados de ratos. No exemplo atual, WT C57BL/6 ratos exibem sinais moderados de inflamação, incluindo hiperplasia da próstata (hiperplasia mucosa) e atrofia da glândula no pós-infecção de 6 meses com H. felis. A presença de infiltrados celulares também pode ser observada na mucosa sub. Curiosamente, no entanto, mais severa inflamação é observada em camundongos KO no mesmo tempo, com a maior presença de folículos linfoides, localizado nas proximidades de infiltrados celulares (Figura 5). Finalmente, H. felis bactérias são observadas nas seções manchadas de Giemsa de estômagos rato infectada (Figura 6).
Figura 1: imagem demonstrando a técnica de gavagem oral. Uma seringa descartável 1 mL e cateter flexível são usadas para entregar um rato através da rota intragástrico ≥ 105 CFU de inóculos bacterianos. O mouse estava anestesiado usando Metoxiflurano e realizada em um aperto firme pelo pescoço, permitindo acesso do cateter no estômago através do esôfago.
Figura 2: colheita de spleens do rato e estômagos pós infecção. Mouse estômagos estavam pós-eutanásia colheita e seu conteúdo removido por raspagem com um bisturi e lavagem em PBS estéril. Os tecidos foram então pesava e achatados em uma folha de algodão para revelar 2 igual a metades, cada compreendendo os antro gástrico, corpo e regiões não-glandular; Barra de escala = 10 mm.
Figura 3: Viável conta com H. pylori -infectados estômagos de rato. Ratos no fundo C57BL/6 foram inoculados com 107 UFC de H. pylori SS1 e esquerda durante 8 semanas. (A) diluições de cada homogenate gástrico são banhadas em um meio (ou terceiro) de uma placa HBA e cargas bacterianas avaliadas, enumerando colónias individuais de 10-100. A metade esquerda da placa mostra uma cultura pura de bactéria H. pylori . (B) a presença de bactérias contaminantes do mouse gástrico microbiota (à esquerda) ou um grande número de colônias de H. pylori (à direita) pode complicar a enumeração de CFUs de H. pylori . (C) exemplos comuns de bactérias contaminantes em amostras homogenate gástrica. Barra de escala = 1,7 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Detecção de PCR da infecção por H. felis em biópsias gástricas usando oligonucleotídeos como alvo o gene ureB . Um par específico do oligonucleotide foi concebido para reconhecer e ligar com sequências homólogas nos genes tanto H. felis e ureB de H. pylori . Estas primeiras demão foram validada utilizando DNA genômico de H. pylori SS1 (pista 2) ou H. felis (faixa 3). Água desionizada foi incluída como um controle negativo (faixa 1).
Figura 5: Imagens representativas da H & estômago manchada E seções de WT e KO ratos a pós-infecção de 6 meses com H. felis. Cortes de tecido de parafina foram corados com H & E. WT os ratos recebendo caldo BHI sozinho (controle) tiveram um epitélio gástrico normal e nenhuma inflamação significativa. Em contraste, os animais WT com crônica H. felis infecção exibido níveis moderados de inflamação e espessamento da mucosa que foi ainda mais agravada em H. felis-KO de animais infectados. Cortes histologicos de H. felis-ratos infectados de KO exibiram a presença de folículos linfoides na mucosa (*), infiltrações celulares (→), atrofia da glândula (▶) e hiperplasia. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens representativas de Giemsa-manchado seções gástricas de camundongos C57BL/6 WT no pós-infecção de 3 meses com H. felis. Cortes de tecido de parafina foram corados com Giemsa. As setas indicam a presença de H. felis nas glândulas gástricas. Barra de escala = 200 μm.
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Discussion
Este protocolo descreve a utilização de um modelo de rato in vivo de Helicobacter infecção. Os passos críticos do processo são a: 1) preparação de inóculos de Helicobacter contendo bactérias motile e viáveis; 2) a entrega dos números adequados de bactérias para o mouse através de gavagem intragástrico; 3) a detecção da infecção bacteriana por contagem de colônia e/ou PCR; e 4) processamento de tecidos gástricos para permitir a avaliação da histopatologia em infectados estômagos. Mais sugestões para modificações, considerações técnicas e de solução de problemas são discutidos abaixo.
O método de cultivo Helicobacter spp. utilizando Agar sangue Base n º 2 suplementado com sangue de cavalo tem sido bem estabelecido em nosso laboratório. No entanto, ágar alternativo bases tais como Brucella agar e Columbia agar de sangue também podem ser usado22. É importante garantir que os produtos vidreiros apenas estéril livre de detergente é usado para preparar o meio de crescimento. Além disso, para obter o crescimento ideal, bactéria H. pylori deve ser rotineiramente repicagem em placas de ágar que tem umidade residual e não são secos. Ao preparar inóculos. de Helicobacter spp para infecção, é vital para a subcultura H. pylori e H. felis cepas cada 1,5 – 1 ou 2 dias, respectivamente, para garantir a viabilidade bacteriana. Em cada subcultura, bactérias devem ser avaliadas para sua viabilidade e motilidade por microscopia de contraste de fase. Um ensaio da urease também pode ser empregado rotineiramente para discriminar entre gástrico Helicobacter spp e outras bactérias,23, no entanto, é importante perceber que este teste detecta viáveis e não viáveis as bactérias Helicobacter . Após inoculação de animais, viável conta com suspensões de Helicobacter deve ser realizada para quantificar o número de bactérias viáveis, utilizados para a infecção. Como H. felis reproducibly não formam colónias isoladas em meio de ágar-ágar15, estimativa de números bacterianas é executada usando o microscópio de contraste de fase. Quantificação de números bacterianas por medição da densidade óptica (600) sozinho é imprecisa como esse método não discrimina entre bactérias viáveis e não viáveis. Este método não deve ser usado em pesquisa de Helicobacter sem otimização rigorosa, como descrito acima (seção 1.5).
Ao realizar estudos de infecção de Helicobacter , é fundamental considerar o mouse ideal e Helicobacter estirpe, bem como a duração da infecção, de acordo com a finalidade do experimento. Também é essencial para confirmar regularmente que os animais utilizados para experimentação são de fato Helicobacter-livre usando o género específico do PCR primers24. A presença de outras espécies de Helicobacter entéricos, como Helicobacter bilis, Helicobacter eu ou Helicobacter muridarum, pode alterar a suscetibilidade a doenças dos ratos e introduzir fatores de confundimento em em vivo estudos25,26. Também é aconselhável incluir um grupo de controle de tratamento simulado de animais (ou seja, caldo alimentado apenas) em experimentos de triagem inicial para investigar os efeitos da microbiota normal na colonização de Helicobacter e patogênese.
Pós-eutanásia, colonização de H. pylori no estômago murino pode ser medida pela contagem viável. Placas HBA usadas para colônia contagens devem ser complementadas com ácido bacitracina e naladixic, além de suplemento do Skirrow modificados seletivo, para restringir o crescimento de espécies bacterianas a microbiota gástrica normal e, portanto, evitar a contaminação 27. H. felis sempre não forma colônias, mas em vez disso, tende a formar o enxame de crescimento em placas de ágar15,28. Portanto, PCR e qPCR normalmente são empregados para determinar a presença e níveis de H. felis, respectivamente de29,30. Na seção 4.2, introduziu um método PCR simples e rápido para confirmar a colonização por H. felis no estômago murino usando um par de primers, validados para atingir uma região bp 325 de H. felis e H. pylori ureB genes. Usando as condições PCR descritas acima, é possível discriminar entre infecção por estes gástrico Helicobacter spp e entero-hepática da urease-produzindo Helicobacters. Outros genes que tenham sido validados para detecção de PCR da infecção por Helicobacter gástrica incluem o 16s rRNA e flagellin B (flacidez) genes15,29,30.
Finalmente, descrevemos a utilização das duas poderosas técnicas de coloração: H & E mancha, para avaliar as alterações histopatológicas na pós-infecção estômago; e, para detectar a infecção de H. felis a coloração de Giemsa. Para obter a coloração ideal, é essencial para garantir que os tecidos preservados, transformados e incorporados na orientação correta. Além disso, apenas recentemente soluções preparadas e filtrada manchas devem ser usadas durante este processo. Seções do tecido podem ser armazenadas indefinidamente e utilizadas para uma análise mais específica de patologia gástrica através de imunofluorescência ou imuno-histoquímica. Algumas outras medidas comuns de inflamação gástrica e doença incluem: recrutamento de células imunes (anti-CD45 mancha); espessamento da mucosa/destruição (coloração ácido periódico Schiff/Alcian blue); proliferação de células epiteliais (proliferação antígeno nuclear da pilha, PCNA/Bromodeoxyuridine, BrDU coloração); ou apoptose celular (coloração de TUNEL). Os folículos linfoides observados no H & manchadas E tecidos de camundongos H. felis -infectado podem ser confirmados por imuno-histoquímica, utilizando anticorpos dirigidos contra B (B220+) e células T (CD3+) antígenos31.
Em resumo, modelos animais de doença bacteriana fornecem ferramentas valiosas no campo da biologia da infecção. Os protocolos de gavage intragástrico e processamento dos tecidos do estômago forneceram aqui podem ser adaptadas aos modelos de infecção de rato envolvendo outros patógenos entéricos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a Sra. r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann para assistência técnica. Os autores reconhecem a utilização das instalações e assistência técnica da plataforma de histologia de Monash, departamento de anatomia e biologia do desenvolvimento, Universidade de Monash. O laboratório é suportado pelo financiamento da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para RLF (APP1079930, APP1107930). RLF é apoiado por uma bolsa de pesquisa sênior do NHMRC (APP1079904). KD e MC são suportados por bolsas de pós-graduação de Monash. KD também é apoiado pelo centro de imunidade inata e infecciosa doenças, Hudson Instituto de pesquisa médica, enquanto MC tem uma bolsa de pós-graduação internacional desde a faculdade de medicina, enfermagem e Ciências da saúde, Universidade de Monash. Pesquisa no Instituto de investigação médica Hudson é suportada pelo programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
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