Summary
Mus representerer en uvurderlig i vivo modell å studere infeksjoner og sykdommer forårsaket av gastrointestinal mikroorganismer. Her beskriver vi metoder brukt for å studere bakteriell kolonisering og histopathological endringer i musen modeller av Helicobacter pylori-relatert sykdom.
Abstract
Helicobacter pylori er en mage patogen som finnes i halvparten av den globale befolkningen og er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet hos mennesker. Flere musen modeller av mage Helicobacter infeksjon er utviklet for å studere molekylære og cellulære mekanismer der H. pylori bakterien kolonisere magen av menneskelige verter og forårsake sykdom. Her beskriver vi protokoller til: 1) forberede bakteriell suspensjoner i vivo infeksjon av mus via intragastric gavage; 2) bestemme bakteriell kolonisering nivåer i musen mage vev, av polymerasekjedereaksjons (PCR) og levedyktig teller; og 3) vurdere patologiske forandringer, ved histology. For å etablere Helicobacteh infeksjon i mus, bestemte patogen-fri (SPF) dyrene er først inokulert med suspensjoner (inneholder ≥105 colony-forming enheter, CFUs) av mus-kolonisere stammer av enten Helicobacter pylori eller andre gastrisk Helicobacter spp. fra dyr, som Helicobacter felis. På riktig tidspunkt etter infeksjon, mager forbrukeravgift og dissekert sagittally i to like vev fragmenter, hver bestående av regionene antrum og kroppen. En av disse fragmentene brukes deretter for levedyktig teller eller DNA utvinning, mens den andre er utsatt for histologiske behandling. Bakteriell kolonisering og histopathological endringer i magen kan vurderes rutinemessig i mage vev delene med Warthin-stjernehimmelen, Giemsa eller Haematoxylin og Eosin (H & E) flekker, etter behov. Ekstra immunologiske analyser kan også gjennomføres av immunohistochemistry eller immunofluorescence på musen mage vev deler. Protokollene beskrevet nedenfor er spesielt designet for å aktivere vurdering i mus mage patologi som ligner de i menneske-relaterte H. pylori sykdommer, inkludert betennelse, kjertel atrofi og lymfoide hårsekken formasjon. Inoculum forberedelse og intragastric gavage protokoller kan også tilpasses til å studere patogenesen av andre enteric human patogener som koloniser mus, for eksempel Salmonella Typhimurium eller Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori er en spiral-formet, Gram-negative, menneskelige mage patogen i alle befolkninger over hele verden, med infeksjon priser i utviklingsland anslått til i 80%1. Selv om de fleste H. pylori-infiserte individer er asymptomatisk, noen utvikler mer alvorlige sykdommer, mellom magesår magekreft2. H. pylori-tilknyttede kreft er generelt preget ved ondartet endringer i epitelceller (GECs) eller dannelsen av ekstra knutepunktet lymfoid vev i magen, resulterer i mage adenocarcinoma eller mucosa-assosiert lymfoid vev (MALT) lymfom, henholdsvis. H. pylori er svært tilpasset for å overleve i den harde nisje i magen av ulike virulens faktorer og mekanismer tilrettelegge sin tilslutning, vekst og metabolisme i denne nisje. Spesielt har virulente stammer av H. pylori 40 kb cag virusets Island (cagPAI) som koder ca 30 gener kreves for produksjonen av en Type 4 sekresjon system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positive H. pylori stammer er forbundet med induksjon av høyere nivåer av kronisk betennelse i verten, som har vært innblandet som en viktig forløper mage adenocarcinoma5.
I vivo dyr modeller, spesielt mus, har vært svært informativ ved å tillate forskere å undersøke den relative bidrag av verten, bakteriell og miljømessige faktorer på H. pylori infeksjon og sykdom resultatet6. Studier har tidligere vist som langvarig H. pylori infeksjon av mus på C57BL/6 genetisk bakgrunn resultatene i utviklingen av kronisk gastritt og kjertel atrofi, begge kjennetegnene av H. pylori infeksjon7. Videre har smitte med relaterte feline/hjørnetann bakteriell arter, H. felis, blitt vist å skape MALT i mus med lignende patologi og sykdomsprogresjon sett i menneskelig MALT lymfom8,9. De mest brukte H. pylori isolere i musen kolonisering studier er "Sydney belastningen 1" (SS1) belastning10, som er cagPAI+ men har en ikke-fungerende T4SS (T4SS−)11. Andre brukte stammer inkluderer H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 og X47-2AL (cagPAI-/T4SS−)13. For H. felis infeksjoner, belastningen CS1 ("Cat Spiral 1" cagPAI-/T4SS−) er normalt brukt14.
Her gir vi en protokoll som beskriver utarbeidelse av Helicobacter inocula i vivo infisert, prosedyren for intragastric gavage av mus og metoder for behandling av vev for å studere histopathological endringer i magen. Spesielt vil denne artikkelen fokusere på histologiske metodene som brukes til å visualisere bakteriell kolonisering og vurdere histopathological endringer, inkludert MALT formasjon, i mage mucosa i infiserte mus. Noen av metodene som er beskrevet her kan tilpasses til studiet av andre gut patogener som S. Typhimurium eller C. rodentium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vekst og utarbeidelsen av bakteriell Inocula
- Tine glyserol aksjer H. pylori eller H. felis15 -80 ° C og subkultur på hest blod agar (HBA) plater består av: blod Agar Base No.2 (se Tabell for materiale); en modifisert "Skirrows antibiotika selektiv supplement" (bestående av vancomycin, 10 μg/mL, polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µg/mL, amfotericin B, 2,5 μg/mL); og 5 – 10% (v/v) hesten blod15,16. Bakterier vokse godt under microaerobic forhold i 2,5 eller 3,5 L anaerob krukker som inneholder riktige gass pakkene (se Tabell for materiale), på 37 ° C.
Merk: H. pylori stammer dyrket under disse forholdene må bli subcultured etter 1-1,5 dager av inkubasjon mens H. felis, minst 2 dager med inkubering er vanligvis nødvendig. Egnet kultur og lagringen media har blitt beskrevet i detalj tidligere15. -
Forberede bakteriell inocula musen infeksjon fra tidlig til middels logaritmisk fase kulturer. Høste bakterier forsiktig fra agar plater av flom hver plate med 1-2 mL av hjernen hjertet infusjon (BHI) kjøttkraft. Sug opp suspensjoner fra plater med Pasteur pipetter.
- Du kan også forberede inocula fra Helicobacter bakterier som er overført i BHI buljong 16 til 18 h15. I dette tilfellet samle bakterier ved lav hastighet sentrifugering 2200 x g i 10 min på 4 ° C.
- Vurdere levedyktighet og motilitet av bakterier ved å undersøke våt mount forberedelser under fase kontrast mikroskopi (100 X objektiv). Forberede våte monteringer av resuspending en loopful av bakterier i en 10-20 μL dråpe BHI kjøttkraft på en barometer microscope skyve. I H. felis, som er en mye større bakterie enn H. pylori, kan du bruke en haemocytometer til å telle antallet levedyktig bakterier. Bekreft kultur renhet ved å utføre en Gram-flekk.
Merk: Bruk bare H. pylori inocula hvis flertallet av bakterier har en basillær eller spiral figur (morfologi kan variere avhengig av belastningen). H. felis inocula inneholde primært spiralformede-formet bakterier. Ikke bruk inocula de fleste bakterier har en coccoid morfologi, disse skjemaene ikke er levedyktig og vil ikke opprette en infeksjon i mus. -
Anslå hvor mange bakterier i inoculum teller under fase kontrast mikroskopi antall bakterier per felt (100 X mål) og bruker følgende guide: 1 bakterie per felt = ca 106 colony-forming enheter ( CFU) av Helicobacter/mL; 10 bakterier per felt = ca 107 CFU/mL; 100 bakterier per felt = ca 108 CFU/mL, osv.
- Når du bruker en haemocytometer, beregne CFU/mL bruker følgende formel:
CFU/mL (gjennomsnittlig antall bakterier i et 4 x 4) x (fortynningsfaktoren) x (104).
- Når du bruker en haemocytometer, beregne CFU/mL bruker følgende formel:
-
Justere bakteriell celle tettheten av inoculum til ca 107– 108 CFU/mL av fortynning i BHI kjøttkraft, om nødvendig.
- For å sikre maksimal bakteriell levedyktighet, kan du bruke inocula for intragastric gavage så snart som mulig etter forberedelse.
- Alltid bekrefte H. pylori celle tetthet og gjennomførbarheten ved å utføre levedyktig telling av inocula umiddelbart etter gavage prosedyren (se nedenfor). Dette er ikke alltid mulig for H. felis, som det ikke utgjør vanligvis isolerte kolonier på kultur medier. Antall levedyktig Helicobacters i inocula kan ikke bestemmes av optisk densitet måling (en600) alene som denne metoden ikke diskriminerer mellom levedyktig (dvs.basillær/spiral/spiralformede) og ikke-levedyktige ( dvs. coccoid) bakterier.
- Bruke optisk densitet som et middel for å beregne hvor mange levedyktige H. pylori bakterier i inocula, men i dette tilfellet, det er først nødvendig for å generere en vekstkurve. For dette, er A600 verdiene for H. pylori kulturer over tid og korrelert direkte mot antallet levedyktig bakterier, bestemmes av platen teller.
Merk: En praktisk metode for å utføre slike vekst kurve bestemmelser skal kultur bakterier i flytende medium (delen 1.2), bruker standard flat bunn vev kultur flasker i en 10% CO2 inkubator. Antall CFUs, bestemmes av dele kulturer innhentet hver 4-6 h over 2-3 dager er deretter sammenlignet med tilsvarende en600 verdier17. Viktigere, må vekst kurver genereres for hver H. pylori stamme, som dette kan vokse til ulike priser, og dessuten ikke alle stammer vokse godt i 10% CO2.
2. intragastric Gavage for mus Helicobacter
Merk: Denne metoden for intragastric gavage kan brukes på andre bakterie-art som koloniser tarmen f.eks S. TyphimuriumC. rodentium, Listeria monocytogenes.
- 6-8-uke-gamle, bestemte patogen-fri (SPF) og Helicobacter-fri mann eller kvinne mus. Bruk dyr med C57BL/6 genetisk bakgrunn for infeksjon eksperimenter med H. pylori eller H. felis. Studien, vi brukte vill-type (WT) og genetisk modifisert C57BL/6 mus mangler en nøkkel medfødte immunsystemet reseptor (kalt knock-out eller KO dyr).
Merk: Mus på andre genetisk bakgrunner kan også brukes for Helicobacter infeksjoner, men kolonisering nivåer og sykdommens alvorlighetsgrad kan påvirkes av verten bakgrunn18,19. - Sug opp den bakteriell inoculum (trinn 1.5) i disponibel 1 mL sprøyter og erstatte de medfølgende nålene med 23 måle pinner som er påført disponibel polyetylen katetre (lengde, 6-8 cm, interne diameter, 0.58 mm). Fest katetre til nålene ved anvendelse av små strimler av plast film (se Tabell for materiale). Eventuelt erstatte p/kateter montering ved hjelp av steril plast fôring rør (20 gauge x 38 mm).
- Fysisk begrense mus med et fast grep på scruff i halsen og halen.
Merk: Denne fremgangsmåten kan utføres uten anestesi, eller alternativt med bruk av en inhalert utføre handlinger, for eksempel methoxyflurane eller isoflurane15. - Sett inn kateter i midten av åpne kjeven og guide caudal retning mot spiserøret. Forlenge halsen av musen for å tillate enkel tilgang til magen gjennom spiserøret (og fra luftrøret) til de fleste eller alle kateter er ikke lenger synlig og en motstand føles, tilsvarer bunnen av magen. Levere en bestemt aliquot, vanligvis 100 μL per inoculation (figur 1).
Merk: Mus bør være gavaged med ≥ 105 CFU å sikre optimal kolonisering og sykdom patologi. - Huset mus i en SPF dyr anlegg for varigheten av eksperimentet.
Merk: Alvorlig patologi og adenocarcinoma i WT C57BL/6 mus er bare observert på ca 24 måneder etter smitte20. Denne effekten kan imidlertid bli fremskyndet noen genmodifiserte dyr eller mus med andre genetisk bakgrunn. - Ved ferdigstillelse av gavage prosedyren, utføre en endring av Miles og Misra teknikken til å bestemme antall levedyktig H. pylori bakterier administrert til mus. For dette, inoculum er serielt fortynnet (fra 10−1 til 10−5) i BHI med metoden beskrevet i detalj tidligere15.
Merk: For å sikre isolering av enkelt kolonier, HBA plater bør bli varmet og tørket i en biologiske sikkerhetskabinett skap eller 37 ° C inkubator for 10-15 minutter før bruk.
3. høsting vev fra mus post eksperiment
- Euthanize mus karbondioksid innånding eller cervical forvridning, ifølge den relevante etikk for dyr eksperimentering.
- Åpne bukhulen og avgiftsdirektoratet magen med fine, buede saks.
Merk: Sera kan også samles av cardiac punktering å hjelpe til med etterforskningen av systemisk Svar å Helicobacter infeksjon. I tillegg spleens og paragastric lymfeknuter er nyttige i å studere adaptive immunreaksjoner. - Skjær magen langs større kurvatur og fjern resterende mat av mild vaske i sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) i en 50 mL-rør.
- Vask magen igjen i sterilt PBS og deretter registrere våt vekt bruker tared 6 cm plast Petri retter.
- Flate magen og dissekere sagittally i to like vev fragmenter, hver bestående av: antrum, kropp og ikke-kjertel forestomach regioner (figur 2). Fjerne ikke-kjertel regionen og veie en halvdel av hver magen før du legger til enten 1 mL steril BHI (for levedyktig teller) eller fest fryse i flytende nitrogen (for DNA/RNA utvinning).
Merk: Rør som inneholder vev i BHI må lagres på is inntil de er klar for behandling. Fest frosne mage vev kan også brukes til å pakke ut RNA eller proteiner qPCR (kvantitative PCR) eller vestlige blotting analyser, henholdsvis. - Legge til andre magen halvparten til en 15 mL tube som inneholder 10% formalin. Fordype vev i 10% formalin for 10 s og deretter flat å overdelen side av rør. Kan vev rette før å leve i 10% formalin løsning i minst 24 timer.
Merk: Vev kan forbli i 10% formalin i mange uker før behandling for histology. Langvarig lagring av vev kan imidlertid påvirke sin arkitektur og/eller antigenicity resultere i sub-optimale resultater i nedstrøms analyser.
4. bestillingsbekreftelse bakteriell kolonisering i magen etter infeksjon
-
Levedyktig opptelling av H. pylori i magen
- Supplement sterilt HBA plater med flere antibiotika (200 μg/mL bacitracin og 10 μg/mL naladixic acid) før du utfører kolonien teller fra infiserte mus mager16.
- Homogenize magen deler enten manuelt, bruker autoclavable polypropylen micropestles, eller bruker en mekanisk dissosiasjon instrument (se Tabell for materiale).
- Forberede like føljetong fortynninger (10−1 til 102) av den resulterende gastrisk homogenates i sterilt BHI.
Merk: Fortynninger bør avgjøres basert på vanlig bakteriell laster innhentet for en gitt H. pylori belastning brukes for infeksjon, så vel som varigheten av infeksjon. Ufortynnet prøver kan også brukes. - Del pre tørket HBA plater (se merknad ovenfor) i tre eller fire segmenter. Bruke en bearbeidelse av Miles og Misra teknikk, legge 10-100 mL hver fortynning på et segment av agar plate og spre bruker steril plast looper15.
- La platene tørke og plassere dem i en invertert posisjon (lokket siden ned) i anaerobe gass glass. For å opprettholde fuktighet i glassene, Inkluder en Petriskål som inneholder vann.
- Inkuber glassene i 37 ° C til koloniene danner (vanligvis 4-7 dager).
- Nummerere segment (e) som inneholder mellom 10 og 100 isolert kolonier.
Merk: H. pylori kolonier og H. felis vekst på platene kan skilles fra de andre medlemmene av den murine mage bakterieflora bruker standard urease og catalase oksidase tester. H. pylori og H. felis er positive for alle tre tester. - Beregne bakterielle laster som (CFU/g av vev), ved hjelp av følgende formel:
[(Gjennomsnittlig antall kolonier telles) × (fortynningsfaktoren) x (volum belagt)] / (magen vekt).
-
Påvisning av H. felis infeksjon i mage vev av Polymerase kjedereaksjon (PCR)
- Pakk ut DNA fra musen mager DNA isolasjon standardprotokoller eller et kommersielt tilgjengelig kit.
- Bestemme DNA konsentrasjonen av prøver ved en fluorometric kvantifisering teknikk (se Tabell for materiale).
- Definere PCR reaksjoner målretting en 325-base parene (bp) fragment av H. felis urease B genet (ureB)21. Hver reaksjon bør inneholde: 100 ng genomisk DNA; 1 mM hver forover (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3) og bakover (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3) primere; 200 mM dNTPs; 0,5 enheter Taq utvalg og den riktige mengden buffer og nuclease-fritt vann.
Merk: Dette oligonucleotide paret er utviklet for å gjenkjenne og binde til homologe sekvenser i både H. pylori og H. felis ureB gener, men når de utsettes for PCR betingelsene nedenfor, ikke de som er i ureB gener av enterohepatisk Helicobacter spp. - Utføre PCR forsterkning med følgende termisk profil: oppvarming på 94 ° C i 5 min, etterfulgt av 35 sykluser av 94 ° C for 30 s, 61 ° C for 30 s og 72 ° C i 1 min, før holder på 20 ° C.
- Kjøre PCR produkter på en 2% agarose gel for 30 min 100 V.
5. histologiske analyser av Helicobacter -infisert musen magen deler
- Behandling av mage vev
- Fjern mage vev fra formalin og plass i ren Petri retter.
- Skjær mage vev med skalpell i flere like store langsgående strimler (hver 2-3 mm tykk) og plasser i merket innebygging kassetter som inneholder skumstopp.
- Fastsette mage vev ved å plassere innebygging kassetter i et glass fylt med 80% etanol.
Merk: Mage kan behandles umiddelbart eller lagret i opptil 1-2 dager før du fortsetter til neste trinn. - Prosessen mager på en automatisert vevsprosessor som er programmert med følgende innstillinger:
Dehydrering: 70% etanol - 1 syklus, 20 min; 90% etanol - 1 syklus, 20 min; 100% etanol - 2 sykluser, 20 min + 1 syklus, 40 min + 1 syklus, 1 h.
Fjerne: xylen-2 sykluser, 30 min + 1 syklus, 45 min.
Impregnering: parafinvoks på 60 ° C - 1 syklus, 45 min + 1 syklus, 1 h + 1 syklus, 1,25 h. - Fjern behandlet prøvene fra maskinen og lagre ved romtemperatur for parafin innebygging.
- Parafin innebygging av behandlet mage vev
- Plass rustfritt stål base formene på scenen av innebygging å varme grunnlaget for formene.
Merk: Innebygging maskin skal angis til 60 ° C for effektiv parafin innebygging. - Plass vokset kassetter som inneholder prøvene i en varm voks bad/varm plate området av innebygging til voks fullt oppløses.
Merk: Det anbefales at prøven bygges etter voks oppløses. Dette sikrer at herding av vev ikke oppstår. - Fylle halvparten av rustfritt stål formene med parafin voks. Ved hjelp av varm pinsett, fjerne mage vev strimler fra den kassetter og skyv magen strimler gjennom parafinen til bunnen av formene. Nøye orientere vev strimler i rett vinkel til basen av muggsopp slik at skiver endene vender oppover.
Merk: Følgende trinn skal utføres så raskt som mulig for å unngå herding og separasjon av parafin lag innebygd kvartaler. Den riktige retningen av mage vev er avgjørende for nedstrøms analyser. - Sett mugg på kjøleplaten av innebygging å fikse de på plass og re-orientere vev om nødvendig.
Merknad: Hvis vev skulle løsne og parafinen begynner å stivne, plassere muggsopp tilbake på kokeplate smelte voksen og re bygge vev i formene. - Sted halvparten av de merkede innebygging kassettene (som ble brukt for vev behandling) på toppen av muggsopp og forsiktig fyll med varm voks. Ikke la parafin til overflyt.
- Forsiktig sett mugg på en kald tallerken og Avkjøl.
- Når parafinen er helt satt, skille innebygde blokker fra formene. Ren overflødig parafin voks på kassett kantene med en varm plate (satt over 80 ° C) eller skraper. Blokker kan lagres ved romtemperatur før snitting er utført.
- Plass rustfritt stål base formene på scenen av innebygging å varme grunnlaget for formene.
- Skjæring av vev
- Chill parafin-embedded vev blokker på isen og varme vann badekar fylt med ultrapure vann til 40-45 ° C.
- Sikre bladet i innehaveren av mikrotomen og angi klaringsvinkelen mellom 1-5° hindre kontakt mellom blokk ansiktet og kniv fasett, før du setter inn parafinblokkene.
Merk: Kontroller blokker er fri for overflødig parafin fra innebygging, som dette kan hindre passformen til blokken. - Orientere bladet for en straight cut på tvers av blokken. Forsiktig kutte 2-3 tynne snitt for å sikre riktig posisjonering av blokk.
- Trim blokker med en tykkelse på ca 10-30 mm. Dette trinnet sikrer at en maksimal areal av hver vev vil bli kuttet.
- Kutt 10 µm deler og Forkast alle som inneholder hull forårsaket av trimming.
- Forsiktig plukke opp inndelinger ved hjelp av pinsett og flyte dem i vannbad for sammenslåing. Bruke pinsett for å skille hver del.
- Samle deler fra vannbad og sted på ladet glass lysbilder (se Tabell for materiale).
- Lagre lysbilder oppreist i en objektglasstativet og plasser i en inkubator på 37 ° C. Tørr deler over natten.
- Lagre inndelinger ved romtemperatur på ubestemt tid for senere analyser.
- Haematoxylin og Eosin (H & E) flekker av mage vev
- Dewax lysbilder med 3 vasker av xylen for 5 min hver, etterfulgt av 3 vasker i 100% etanol, i 3 minutter hver. Sikre frisk løsninger brukes på hvert trinn.
- Skyll lysbilder i springen for 30-60 s.
- Fjerne overflødig vann ved å trykke forsiktig nederst på lysbilder på et papirhåndkle. Flekker med filtrerte Haematoxylin for 3 min. sikre at delene er tilstrekkelig dekket med løsningen.
- Skyll lysbilder under rennende vann fra springen til renner klar.
- Dypp lysbilder i Scotts springvann for 8-10 s. Ikke utsett lysbilder til løsning mer enn 10 s da dette vil føre til mørkere og intense flekker. Farging av inndelinger kan vises under et mikroskop. Effektiv flekker på dette stadiet vil resultere i en "baby blå" farge.
Merk: Forberede Scotts vann ved å løse opp 2 g av natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) og 20 g magnesium sulfat (MgSO4) i 1 L destillert vann. - Skyll lysbilder i springen for 30-60 s.
- Fjern overflødig vann som beskrevet i trinn 3, og deretter flekken med filtrerte 1% vandig Eosin i 3 minutter.
- Skyll lysbilder under rennende vann fra springen til renner klar.
Merk: Flekker kan vurderes med lys mikroskop. Hvis flekker er for mørk, kan lysbildene bli dehydrert i 100% etanol lenger enn angitt tid. Hvis mørkere flekker, kan lysbilder være farget med Eosin i 1-2 min lenger, før du fortsetter til neste trinn. - Tørke lysbilder med 3 vasker av 100% etanol for 30 s hver, etterfulgt av 3 vasker av xylen i 2 minutter. Sikre frisk løsninger brukes på hvert trinn.
- Montere lysbilder med montering medium. Legg en dråpe montering medium i midten av en ren dekkglassvæske før forsiktig plassere lysbilde øverst med deler vendt nedover.
Merk: Ikke tørr lysbildene før dekselet slipping. - Plasser lysbilder på et flatt underlag og la luften tørr. Lysbilder kan også tørkes i avtrekksvifte å akselerere tørketid.
- Giemsa farging av mage vev
- Dewax lysbilder med 2 vasker av histolene for 5 min hver, etterfulgt av 2 vasker av 100% etanol for 3 min og deretter en siste vask i 70% etanol for 3 min. sikre frisk løsninger brukes for hver vask.
- Skyll lysbilder i springen for 30-60 s.
- Forberede Giemsa løsning ved å blande 20% Giemsa flekk med 80% destillert vann. Stain lysbilder med Giemsa løsning for 1t.
- Plasser lysbilder i 100 mL destillert vann som inneholder 3-4 dråper eddiksyre for 2-3 s.
Merk: Løsning må blandes godt før bruk. På dette stadiet vises lysbilder blek blå i fargen. - Vaske lysbilder i 96% etanol for 30 s.
- Vask lysbilder i 3 bad i isopropanol i 2 minutter hver, etterfulgt av 3 bad i histolene i 2 minutter. Bruke friske isopropanol og histolene for hver vask.
- Dekkglassvæske lysbilder med montering medium, som beskrevet tidligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver en muntlig gavage teknikk for å oppnå intragastric infeksjon med H. pylori eller H. felis i murine musen modeller (figur 1). Etter dødshjelp, mager fjernes, veid og delt inn i 2 like halvdeler bestående av antrum, kropp og ikke-kjertel regioner av mage vev (figur 2). Ikke-kjertel regionen er fjernet før du utfører noen analyser.
Vellykket kolonisering av dyr er vanligvis bekreftet ved å utføre levedyktig regner H. pylori-infisert gastrisk homogenates, og senere opplisting personlige kolonier på HBA plater (Figur 3). Alternativt er PCR ansatt å bekrefte infeksjon med H. felis bruker bestemte, godkjente primere rettet mot en 325 bp regionen i H. felis og H. pylori ureB gener (Figur 4).
Mage vev er behandlet, innebygde og inndelte for nedstrøms histologiske programmer. H & E flekker teknikken brukes til å vurdere histopatologi i Helicobacter-infiserte mus. I dagens eksempel vise WT C57BL/6 mus moderat underskriver av betennelse, inkludert hyperplasia (forstørret slimhinner) og kjertel atrofi på 6 måneder etter smitte med H. felis. Tilstedeværelsen av mobilnettet infiltrerer kan også observeres i sub mucosa. Interessant, men er mer alvorlig betennelse observert i KO mus på samme tidspunkt, med mer tilstedeværelse av lymfoide follikler ligger i nærheten av mobilnettet infiltrerer (figur 5). Til slutt, H. felis bakterier er observert i Giemsa-farget deler av infisert musen mager (figur 6).
Figur 1: bildet demonstrere teknikken muntlig gavage. En engangs 1 mL sprøyte og fleksibel kateter brukes til å levere ≥105 CFU av bakteriell inocula til musen via intragastric rute. Musen var anesthetized bruker methoxyflurane og holdt i et fast grep på halsen, slik at tilgang til kateter på magen via spiserøret.
Figur 2: høsting mus spleens og magen etter infeksjon. Musen mager ble høstet etter euthanasia og innholdet fjernet ved skraping med en skalpell og vaske i sterilt PBS. Vev ble deretter veid og flatet på bomull ark å avsløre 2 like halvdeler, hver bestående av mage antrum, kropp og ikke-kjertel regioner. Skala bar = 10 mm.
Figur 3: Levedyktig teller på H. pylori -infisert musen mager. Mus på C57BL/6 bakgrunnen ble inokulert med 107 CFU H. pylori SS1 og venstre i 8 uker. (A) fortynninger av hver gastrisk homogenate er belagt på en halv (eller tredje) en HBA-plate og bakteriell laster vurdert av opplisting 10-100 personlige kolonier. Den venstre halvdelen av platen viser en ren kultur for H. pylori bakterier. (B) tilstedeværelsen av skadelige bakterier fra musen mage bakterieflora (venstre) eller stort antall H. pylori kolonier (til høyre) kan komplisere opplisting av H. pylori CFUs. (C) eksempler av skadelige bakterier i mage homogenate prøver. Skala bar = 1,7 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: PCR påvisning av H. felis infeksjon i mage biopsier med oligonucleotides målretting ureB genet. Noen spesifikk oligonucleotide ble utviklet for å gjenkjenne og binde til homologe sekvenser i både H. felis og H. pylori ureB gener. Disse veiledningene var bekreftes med genomisk DNA fra H. pylori SS1 (lane 2) eller H. felis (lane 3). Deionisert vann ble inkludert som en negativ kontroll (lane 1).
Figur 5: Representant bilder av H & E-farget magen seksjoner fra WT og KO mus på 6 måneder etter smitte med H. felis. Parafin-embedded vev deler var farget med H & E. WT mus mottar BHI kjøttkraft alene (kontroll) hadde en normal mage epitel og ingen betydelig betennelse. I kontrast, WT dyr med kronisk H. felis infeksjon vises moderat nivåene av betennelse og mucosal jevning som ble ytterligere forsterket H. felis-infisert KO dyr. Vev inndelinger fra H. felis-infiserte KO mus utstilt mucosal lymfoide follikler (*), mobilnettet infiltrerer (→), kjertel atrofi (▶) og hyperplasia. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representant bilder av Giemsa-farget mage deler fra C57BL/6 WT mus på 3 måneder etter smitte med H. felis. Parafin-embedded vev deler var farget med Giemsa. Pilene angir tilstedeværelsen av H. felis i gastrisk kjertler. Skala bar = 200 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av en i vivo musemodell for Helicobacter infeksjon. Kritisk trinnene av fremgangsmåten er den: 1) utarbeidelse av Helicobacter inocula som inneholder levedyktig og motile bakterier; 2) levering av passende antallet bakterier til musen via intragastric gavage; 3) oppdagelsen av bakteriell infeksjon av kolonien teller og/eller PCR; og 4) behandling av mage vev å aktivere vurdering av histopatologi i infisert mager. Ytterligere forslag til endringer, feilsøking og tekniske vurderinger er omtalt nedenfor.
Metoden for voksende Helicobacter spp. bruker blod Agar Base nr. 2 supplert med hest blod er godt etablert i vårt laboratorium. Men baser alternative agar som Brucella agar og Columbia blod agar kan også være brukt22. Det er viktig å sikre at bare sterile glass som er fri for vaskemiddel brukes å forberede vekstmediet. Videre for å få optimal vekst, bør H. pylori bakterien være rutinemessig subcultured på agar plater som har gjenværende fuktighet og er ikke tørr. Når forbereder Helicobacter spp. inocula infeksjon, er det viktig å subkultur H. pylori og H. felis påkjenningen hver 1-1,5 eller 2 dager, henholdsvis for å sikre bakteriell levedyktighet. På hver subkultur, bør bakterier vurderes for deres levedyktighet og motilitet av fase kontrast mikroskopi. En urease analysen kan også være rutinemessig ansatt å forskjellsbehandle mage Helicobacter spp. og andre bakterier23, men det er viktig å innse at denne analysen gjenkjenner både levedyktige og ikke-levedyktige Helicobacter bakterier. Etter vaksinering av dyr, levedyktig teller på Helicobacter suspensjoner må utføres til quantitate antall levedyktig bakterier brukes for infeksjon. Som H. felis ikke utgjør reproduserbar isolert kolonier på agar middels15, utføres beregningen av bakteriell tall med fase kontrast mikroskopi. Kvantifisering av bakteriell tall ved optisk densitet måling (en600) alene er unøyaktig som denne metoden ikke diskriminerer mellom levedyktige og ikke-levedyktige bakterier. Denne metoden bør ikke brukes i Helicobacter forskning uten strenge optimalisering, som beskrevet ovenfor (delen 1.5).
Når du utfører Helicobacter infeksjon studier, er det avgjørende å vurdere optimal musen og Helicobacter belastning, samt lengden på infeksjon, for hensikten med eksperimentet. Det er også viktig å regelmessig bekrefte at dyr som brukes til eksperimentering er faktisk Helicobacter-gratis ved hjelp av slekten-spesifikke PCR primere24. Tilstedeværelsen av andre enteric Helicobacter arter, som Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus eller Helicobacter muridarum, kan endre sykdom mottakelighet av mus og introdusere forvirrende faktorer i studier25,26 i vivo . Det er også lurt å ta en uekte behandling kontrollgruppe av dyr (dvs., matet kjøttkraft bare) i første screening eksperimenter for å undersøke effekten av normal bakterieflora på Helicobacter kolonisering og patogenesen.
Etter dødshjelp, H. pylori colonization i murine mager kan måles ved levedyktig teller. HBA platene brukes for kolonien teller bør suppleres med bacitracin og naladixic syre i tillegg til den endrede Skirrow selektiv supplement, begrenser veksten av bakterie-art fra den normale mage bakterieflora og dermed hindre forurensning 27. H. felis utgjør ikke alltid kolonier, men i stedet har en tendens til å danne krydde vekst på agar plater15,28. Derfor er PCR og qPCR vanligvis ansatt å bestemme tilstedeværelse og nivåer av H. felis,29,30henholdsvis. I delen 4.2, innførte vi en enkel og rask PCR metode for å bekrefte kolonisering av H. felis i murine magen med en primer, som har validert mot en 325 bp regionen H. felis og H. pylori ureB gener. Bruker PCR forholdene beskrevet ovenfor, er det mulig å skille mellom infeksjon av disse mage Helicobacter spp. og urease produserer enterohepatisk Helicobacters. Andre gener som er blitt godkjent for PCR påvisning av mage Helicobacter infeksjon inkluderer 16s rRNA og flagellin B (flaB) gener15,29,30.
Til slutt, vi har beskrevet bruk av to kraftige flekker teknikker: H & E flekker, for å vurdere histopathological endringer i magen etter infeksjon; og Giemsa flekker, for å oppdage H. felis infeksjon. For å oppnå optimal flekker, er det viktig å sikre at vev har blitt bevart, behandlet og innebygd i riktig retning. Bare nylig utarbeidet løsninger og filtrert må i tillegg flekker brukes under denne prosessen. Vev inndelinger kan lagres på ubestemt tid og benyttes for mer spesifikke analyse av mage patologi via immunofluorescence eller immunohistochemistry. Noen andre felles tiltak mage betennelse og sykdom inkluderer: immune celle rekruttering (anti-CD45 farging); slimhinnene jevning/ødeleggelse (Periodisk Acid Schiff/Alcian blå flekker); epitel celle spredning (voksende celle kjernefysiske antigen, PCNA/Bromodeoxyuridine, BrDU flekker); eller cellular apoptose (tunnel farging). Lymfoide follikler observert i H & E-farget vev av H. felis -infiserte mus kan bekreftes av immunhistokjemi, ved hjelp av antistoffer rettet mot B (B220+) og T-celle (CD3+) antigener31.
I sammendraget gir dyr modeller av bakteriell sykdom verdifulle verktøy innen infeksjonsbiologi. Protokoller av intragastric gavage og behandling av mage vev gitt her kan tilpasses til musen infeksjon modeller som involverer andre enteric patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Ms. A. De Paoli og Ms. Georgie Wray-McCann for teknisk assistanse. Forfatterne erkjenner bruk av fasilitetene og teknisk assistanse av Monash Histology plattform, Institutt for anatomi og utviklingsbiologi, Monash University. Laboratoriet er støttet av finansiering fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) til RLF (APP1079930, APP1107930). RLF støttes av en Senior Research Fellowship fra NHMRC (APP1079904). KD og MC støttes både av Monash Graduate stipender. KD er også støttet av Centre for medfødt immunitet og smittsomme sykdommer, Hudson Institute medisinsk forskning, mens MC har en internasjonal Postgraduate stipend fra fakultet, sykepleie og helsefag, Monash University. Forskning ved Hudson Institute for Medical Research støttes av den viktorianske regjeringen operative infrastruktur støtteprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
