Dit protocol beschrijft een gedrags assay, op basis van de test van de doolhof Barnes, om te bestuderen hoe instinctieve defensieve acties worden gewijzigd door de kennis van de ruimtelijke omgeving.
Evolutie heeft een repertoire van defensief gedrag dat essentieel voor overleving in alle diersoorten zijn geselecteerd. Deze gedragingen zijn vaak stereotiep acties ontlokte in reactie op aangeboren aversieve sensorische stimuli, maar hun succes vereist voldoende flexibiliteit voor de aanpassing aan verschillende ruimtelijke omgevingen, die snel kunnen veranderen. Hier beschrijven we een gedrags test ter evaluatie van de invloed van geleerde ruimtelijke kennis over defensief gedrag in muizen. Wij hebben de meest gebruikte Barnes doolhof ruimtelijke geheugen test om te onderzoeken hoe de muizen navigeren naar een schuilplaats tijdens vlucht reacties op aangeboren aversieve sensorische stimuli in een nieuwe omgeving, en hoe zij zich aanpassen aan acute veranderingen in de omgeving aangepast. Deze nieuwe bepaling is een ethologische paradigma dat vereist geen opleiding en exploiteert de exploratie van natuurlijke patronen en navigatie strategieën in muizen. Wij stellen voor dat de set van protocollen die hier beschreven zijn een krachtig instrument doelgericht gedrag en prikkel-geactiveerd navigatie, die van belang zijn voor zowel op gebied van instinctief gedrag en ruimtelijke geheugen moet bestuderen.
Instinctieve defensief gedrag zijn grotendeels beschouwd als hardwired stimulus-respons, zoals de beweging van de C-start in vissen en amfibieën, die het dier uit de buurt van een bedreiging bron1 beweegt. Defensief gedrag kunnen echter meer adaptieve neemt ze flexibel rekening met informatie over de huidige omgeving geleerd. Een voorbeeld van een dergelijke flexibiliteit is de overgang van ontsnappen naar bevriezing getoond door knaagdieren wanneer zij worden geconfronteerd met de dreiging, afhankelijk van de voorkennis over de aanwezigheid of afwezigheid van een schuilplaats in de omgeving2,3. Andere voorbeelden van flexibiliteit in aangeboren gedrag omvatten aanpassing van de vlucht initiatie drempel of ontsnappen van de snelheid afhankelijk van de afstand tussen een prooi en haar schuilplaats4, afstand naar bedreiging5,6, en eerdere ervaring 11 , 12, evenals verschillende defensieve strategieën, afhankelijk van de zintuiglijke eigenschappen van de aversieve stimulus7te selecteren, of zelfs het onderdrukken van defensief gedrag ten opzichte van concurrerende motivaties zoals honger8, 9,10. De afhankelijkheid van actie selecteren op verworven kennis over de ruimtelijke kenmerken van het milieu maakt instinctieve defensief gedrag in muizen een krachtig model voor het bestuderen van doel selectie, ruimtelijke geheugen en navigatie. Hier beschrijven we de aanpassing van een veelgebruikte gedrags taak, het Barnes doolhof (BM) ruimtelijke geheugen assay13, om te bepalen van de invloed van de ruimtelijke omgeving op defensieve actie selecteren bij muizen, en hun strategieën navigatie wanneer ontsnappen naar een schuilplaats.
De standaard Barnes doolhof gebruikt bij het bestuderen van leren en ruimtelijk geheugen in muizen bestaat uit een cirkelvormige ~ 90 cm diameter platform rijggat 20 gelijkelijk verdeelde, waarvan 19 zijn gesloten, en een leidt naar een ondergrondse schuilplaats die muizen zoeken om te voorkomen dat de open-veld omgeving van het platform. Vaak zijn zwakke aversieve prikkels (zoemer, fel licht, fan) continu gedurende de test het milieu aversieve en dus het bevorderen van binnenkomst in de schuilplaats14gebruikt. In de meest gebruikte assay15,16heeft het dier een gewenning proces waar het wordt geleid naar het opvangcentrum handmatig door de experimentator onmiddellijk na wordt geplaatst op het platform. Dit wordt gevolgd door een periode van 4-daagse acquisitie, waar elke dag die de muis is toegestaan om vrij te navigeren in de maze voor 3 min, waarna het wordt opnieuw handmatig geleid naar het asiel als het het niet tijdens de periode van exploratie bereikt. De laatste fase van de test is één sonde trial op de 5th dag (hoewel een lange-termijn geheugen van zeven dagen proef wordt ook vaak uitgevoerd) wanneer het dier de doolhof met alle gaten gesloten verkent. Leren en lange termijn geheugen worden gekwantificeerd door de tijd genomen om de opvang en pokes in de verkeerde gaten zoeken tijdens de periode van de verwerving en de tijd doorgebracht in de buurt van het gesloten onderdak gat in het proces van de sonde. Typische resultaten tonen een daling van het aantal fouten en de latency te bereiken de shelter tijdens overname, en een deel van de boven-kans van tijd doorgebracht in het kwadrant met het gesloten doelstelling gat in de sonde proef15.
Hoewel verschillende varianten van de BM-assay eerder beschreven17,18,geweest heeft19, het paradigma we hier beschrijven drie fundamentele wijzigingen ten opzichte van de standaard assay. Ten eerste, het dier wordt overgelaten aan de doolhof verkennen en zoeken de beschutting op eigen en testen is gedaan in dezelfde sessie, kort nadat de schuilplaats heeft gevonden, tijdens perioden waarin het dier houdt zich bezig met verkennend gedrag. Hoewel deze instelling niet lange-termijn geheugen van de locatie van de schuilplaats test, is het ontworpen om een naturalistische scenario dat de verkenning van nieuwe grondgebied, onder de dreiging van predatie nabootst. Verder staat het testen van hoe dieren zich aan acute veranderingen in de omgeving, zoals plotselinge veranderingen in landschap aanpassen. Ten tweede, een belangrijk aspect van onze test is dat de experimentator nooit dwingt het dier binnen of buiten de shelter, die kan het dier te desoriënteren en pad integratie20 als een levensvatbare navigatie strategie21uitsluiten. Pad integratie is een navigatie-strategie die zichzelf beweging aanwijzingen, zoals proprioceptief en vestibulair signalen, die voortvloeien uit de integratie van motor uitstroom, gebruikt bijwerken van de huidige positie van het dier te navigeren naar een doel, dat niet mogelijk is als de dier wordt passief bewogen door de experimentator. Ten derde, we aangeboren aversieve visuele22 en auditieve23 stimuli gebruiken om te ontlokken ontsnappen naar de schuilplaats, die gemakkelijk onderscheiden van lopende foerageren gedrag is en laat de beoordeling en de kwantificering van Truckspecifieke navigatie strategieën gebruikt tijdens de verdediging van imminente dreigingen. Wij stellen voor dat deze test nuttig zitten zal voor het ontleden van de rol van ruimtelijk geheugen in de selectie en uitvoering van defensief gedrag, en meer in het algemeen het bredere studie van doelgericht navigatie en ruimtelijke kortetermijngeheugen. De protocollen die hier beschreven werden geïntroduceerd door Vale et al. in 2017, waarnaar wij de lezers voor meer diepgaande bespreking van de reden voor experimenten en resultaten verwijzen.
De tests die we hier beschrijven zijn technisch eenvoudig uit te voeren, en met uitzondering van het platform rotatie experimenten, kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in een standaard Barnes doolhof. Toch een paar complicaties voordoen: aan de ene kant, de muis lijkt misschien bang voor het invoeren van de shelter, die kan worden als gevolg van het asiel niet voldoende gereinigd of gedroogd. Aan de andere kant, kan de muis blijven binnen het opvangcentrum voor zeer lange periodes. Het is van cruciaal belang voor deze experimenten dat dieren worden nooit verwijderd uit het asiel handmatig, als dit kan verstoren pad integratie, alsmede de nood van de dieren en hun reactie op de bedreiging veranderen. Wij stellen voor beëindiging van het experiment na 90 min en nacontrole na 48 uur indien nodig. Een andere relevante praktische overweging is dat wanneer de muis de rand van het platform onderzoekt, op kan niet speurder visuele stimuli als haar hoofd is schuin over de rand, en dus is het raadzaam het achterhouden van de prikkels in dergelijke situaties. Bovendien, kunnen muizen springen naar beneden het platform op de zeldzame gelegenheden. Wij stellen voor beëindiging van het experiment en nacontrole na 48 h. muizen die actief het platform eenmaal laat zijn waarschijnlijk om het te doen in de toekomst opnieuw en wellicht worden uitgesloten van de studie. Tot slot, vanuit onze ervaring, de meeste muizen zal reageren op de visuele stimuli (34/36 muizen). Echter als de muizen vertonen geen elk soort reactie op de visuele stimuli (een schrikken, een vlucht of een bevriezing reactie), moeten zij worden uitgesloten van de studie.
Een belangrijk punt om te overwegen is dat de controle van sensorische signalen meestal een probleem in ruimtelijke geheugen testen, zoals vaak het moeilijk is te elimineren alle mogelijke bronnen van verontreiniging van de signalen. Onze experimentele opzet vermindert externe visuele aanwijzingen door de doolhof met een muur, en het wordt geplaatst in een kast geluid demping voor correcte isolatie. Om te minimaliseren olfactorische signalen, is het raadzaam de set-up met 70% ethanol of azijnzuur tussen experimenten grondig te reinigen.
Onze gedrags bepaling wordt toegevoegd aan de vorige methoden voor het bestuderen van de ruimtelijke navigatie26 door instinctieve defensief gedrag sonde ruimtelijke geheugen gebruiken en zich te concentreren op de ethologische scenario’s. Een cruciaal verschil tussen de hier beschreven procedures en de standaard BM-bepaling is het ontbreken van trainingen. In onze tests, de periode van gewenning zorgt ervoor dat de muis ten minste eenmaal de beschutting en vaak veel meer tijden, die wij hebben eerder getoond voldoende te onthouden de opvang locatie2bezoeken. Wij zijn van mening dat een belangrijke reden voor de hoge slagingspercentage en de nauwkeurigheid in het vinden van de shelter ondanks het gebrek aan opleiding is nooit passief verdringt het dier tijdens het experiment, waardoor integratie van het pad een levensvatbare navigatie-strategie. Wij merken echter dat onze assay geheugen gevormd en beoordeeld tijdens een enkele sessie behandelt, en dat hebben wij niet getest voor lange-termijn geheugen van opvang locatie, dat meestal het doel van standaard BM experimenten is. Ten slotte, met behulp van discrete aangeboren aversieve stimuli in plaats van de gebruikte ventilator of buzz voor de duur van de sessie, onze assay biedt zeer goede experimentele controle over twee gedragingen die verschillende navigatie strategieën gebruikt mogelijk: foerageren en schuilplaats-geleide ontsnappen. Wij zijn van mening dat het gebruik van deze tests in combinatie met moderne neurowetenschap technieken voor het opnemen en manipuleren van neurale activiteit kan bieden belangrijke inzichten in hoe neurale circuits berekenen gedrag.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust/Royal Society Henry Dale Fellowship (098400/Z/12/Z), een medische Raad voor onderzoek (MRC) toekennen MC-UP-1201/1, Wellcome Trust en Gatsby Charitable Foundation SWC Fellowship (naar T.B.), MRC PhD studententijd (D.E. en R.V) en een Boehringer Ingelheim Fonds PhD fellowship (op R.V). Wij danken Kostas Betsios voor het programmeren van de data acquisitie software, de LMB mechanische en elektrische Workshops voor de bouw van de experimentele arena.
Infrared iluminators TV6700 | Abus | – | |
DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | – | |
Amplifier QTX PRO240 | QTX | – | |
Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | – | |
Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | – |