Summary
Dit protocol beschrijft een gedrags assay, op basis van de test van de doolhof Barnes, om te bestuderen hoe instinctieve defensieve acties worden gewijzigd door de kennis van de ruimtelijke omgeving.
Abstract
Evolutie heeft een repertoire van defensief gedrag dat essentieel voor overleving in alle diersoorten zijn geselecteerd. Deze gedragingen zijn vaak stereotiep acties ontlokte in reactie op aangeboren aversieve sensorische stimuli, maar hun succes vereist voldoende flexibiliteit voor de aanpassing aan verschillende ruimtelijke omgevingen, die snel kunnen veranderen. Hier beschrijven we een gedrags test ter evaluatie van de invloed van geleerde ruimtelijke kennis over defensief gedrag in muizen. Wij hebben de meest gebruikte Barnes doolhof ruimtelijke geheugen test om te onderzoeken hoe de muizen navigeren naar een schuilplaats tijdens vlucht reacties op aangeboren aversieve sensorische stimuli in een nieuwe omgeving, en hoe zij zich aanpassen aan acute veranderingen in de omgeving aangepast. Deze nieuwe bepaling is een ethologische paradigma dat vereist geen opleiding en exploiteert de exploratie van natuurlijke patronen en navigatie strategieën in muizen. Wij stellen voor dat de set van protocollen die hier beschreven zijn een krachtig instrument doelgericht gedrag en prikkel-geactiveerd navigatie, die van belang zijn voor zowel op gebied van instinctief gedrag en ruimtelijke geheugen moet bestuderen.
Introduction
Instinctieve defensief gedrag zijn grotendeels beschouwd als hardwired stimulus-respons, zoals de beweging van de C-start in vissen en amfibieën, die het dier uit de buurt van een bedreiging bron1 beweegt. Defensief gedrag kunnen echter meer adaptieve neemt ze flexibel rekening met informatie over de huidige omgeving geleerd. Een voorbeeld van een dergelijke flexibiliteit is de overgang van ontsnappen naar bevriezing getoond door knaagdieren wanneer zij worden geconfronteerd met de dreiging, afhankelijk van de voorkennis over de aanwezigheid of afwezigheid van een schuilplaats in de omgeving2,3. Andere voorbeelden van flexibiliteit in aangeboren gedrag omvatten aanpassing van de vlucht initiatie drempel of ontsnappen van de snelheid afhankelijk van de afstand tussen een prooi en haar schuilplaats4, afstand naar bedreiging5,6, en eerdere ervaring 11 , 12, evenals verschillende defensieve strategieën, afhankelijk van de zintuiglijke eigenschappen van de aversieve stimulus7te selecteren, of zelfs het onderdrukken van defensief gedrag ten opzichte van concurrerende motivaties zoals honger8, 9,10. De afhankelijkheid van actie selecteren op verworven kennis over de ruimtelijke kenmerken van het milieu maakt instinctieve defensief gedrag in muizen een krachtig model voor het bestuderen van doel selectie, ruimtelijke geheugen en navigatie. Hier beschrijven we de aanpassing van een veelgebruikte gedrags taak, het Barnes doolhof (BM) ruimtelijke geheugen assay13, om te bepalen van de invloed van de ruimtelijke omgeving op defensieve actie selecteren bij muizen, en hun strategieën navigatie wanneer ontsnappen naar een schuilplaats.
De standaard Barnes doolhof gebruikt bij het bestuderen van leren en ruimtelijk geheugen in muizen bestaat uit een cirkelvormige ~ 90 cm diameter platform rijggat 20 gelijkelijk verdeelde, waarvan 19 zijn gesloten, en een leidt naar een ondergrondse schuilplaats die muizen zoeken om te voorkomen dat de open-veld omgeving van het platform. Vaak zijn zwakke aversieve prikkels (zoemer, fel licht, fan) continu gedurende de test het milieu aversieve en dus het bevorderen van binnenkomst in de schuilplaats14gebruikt. In de meest gebruikte assay15,16heeft het dier een gewenning proces waar het wordt geleid naar het opvangcentrum handmatig door de experimentator onmiddellijk na wordt geplaatst op het platform. Dit wordt gevolgd door een periode van 4-daagse acquisitie, waar elke dag die de muis is toegestaan om vrij te navigeren in de maze voor 3 min, waarna het wordt opnieuw handmatig geleid naar het asiel als het het niet tijdens de periode van exploratie bereikt. De laatste fase van de test is één sonde trial op de 5th dag (hoewel een lange-termijn geheugen van zeven dagen proef wordt ook vaak uitgevoerd) wanneer het dier de doolhof met alle gaten gesloten verkent. Leren en lange termijn geheugen worden gekwantificeerd door de tijd genomen om de opvang en pokes in de verkeerde gaten zoeken tijdens de periode van de verwerving en de tijd doorgebracht in de buurt van het gesloten onderdak gat in het proces van de sonde. Typische resultaten tonen een daling van het aantal fouten en de latency te bereiken de shelter tijdens overname, en een deel van de boven-kans van tijd doorgebracht in het kwadrant met het gesloten doelstelling gat in de sonde proef15.
Hoewel verschillende varianten van de BM-assay eerder beschreven17,18,geweest heeft19, het paradigma we hier beschrijven drie fundamentele wijzigingen ten opzichte van de standaard assay. Ten eerste, het dier wordt overgelaten aan de doolhof verkennen en zoeken de beschutting op eigen en testen is gedaan in dezelfde sessie, kort nadat de schuilplaats heeft gevonden, tijdens perioden waarin het dier houdt zich bezig met verkennend gedrag. Hoewel deze instelling niet lange-termijn geheugen van de locatie van de schuilplaats test, is het ontworpen om een naturalistische scenario dat de verkenning van nieuwe grondgebied, onder de dreiging van predatie nabootst. Verder staat het testen van hoe dieren zich aan acute veranderingen in de omgeving, zoals plotselinge veranderingen in landschap aanpassen. Ten tweede, een belangrijk aspect van onze test is dat de experimentator nooit dwingt het dier binnen of buiten de shelter, die kan het dier te desoriënteren en pad integratie20 als een levensvatbare navigatie strategie21uitsluiten. Pad integratie is een navigatie-strategie die zichzelf beweging aanwijzingen, zoals proprioceptief en vestibulair signalen, die voortvloeien uit de integratie van motor uitstroom, gebruikt bijwerken van de huidige positie van het dier te navigeren naar een doel, dat niet mogelijk is als de dier wordt passief bewogen door de experimentator. Ten derde, we aangeboren aversieve visuele22 en auditieve23 stimuli gebruiken om te ontlokken ontsnappen naar de schuilplaats, die gemakkelijk onderscheiden van lopende foerageren gedrag is en laat de beoordeling en de kwantificering van Truckspecifieke navigatie strategieën gebruikt tijdens de verdediging van imminente dreigingen. Wij stellen voor dat deze test nuttig zitten zal voor het ontleden van de rol van ruimtelijk geheugen in de selectie en uitvoering van defensief gedrag, en meer in het algemeen het bredere studie van doelgericht navigatie en ruimtelijke kortetermijngeheugen. De protocollen die hier beschreven werden geïntroduceerd door Vale et al. in 2017, waarnaar wij de lezers voor meer diepgaande bespreking van de reden voor experimenten en resultaten verwijzen.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd onder de Britse dieren (wetenschappelijke Procedures) Act van 1986 (70/7652 PPL) na lokale ethische goedkeuring.
1. het opzetten van het Behavioral apparaat
Opmerking: De belangrijkste component van het gedrags apparaat is een variant op de Barnes doolhof13 bestaande uit een witte acryl cirkelvormig platform (92 cm in diameter) met 20 equidistante, 5 cm doorsnede, ronde gaten, radiaal, gelegen 5 cm vanaf de rand van het platform . 19 daarvan moeten worden gesloten met zwarte kunststof stekker (5 mm diep), terwijl het resterende gat leidt naar een zwarte Perspex schuilplaats (afmetingen 15 x 5.8 x 4,7 cm) die muizen gemakkelijk kunnen betreden en verlaten. Het centrale gedeelte van de arena bestaat uit een vaste cirkelvormig platform (diameter van 22 cm) en de periferie wordt gemonteerd op een frame waarmee meer dan 360 graden rotatie via een computergestuurde stappenmotor. Het platform is verhoogde 45 cm vanaf de vloer om te voorkomen dat de muizen klimmen naar beneden. Zie schematische tekening in Figuur 1.
- Hechten visuele aanwijzingen naar de periferie van het platform (2D of 3D symbolen met verschillende vormen, kleuren en patronen), ten minste 2 cm van de rand om te voorkomen dat muizen van het bereiken van hen vandaan.
Opmerking: Voorbeelden van visuele aanwijzingen zijn duidelijke blauwe vierkantjes van 262 cm2of cirkels (15,5 cm diameter) gevuld met diagonale paarse strepen. - Voeg ~ 2 g van beddengoed uit van de muis huis-kooi aan de binnenkant van het asiel om te dienen als een lokale olfactorische cue. Plaats eventueel een licht emitterende diode (LED) bij de ingang van de schuilplaats te bieden van een lokale landmark van visuele cue.
- Om te isoleren van de muis van externe, monteren distale visuele aanwijzingen, een achthoekige of cilindrische muur, uitbreiding van 40 cm boven en 15 cm onder het oppervlak platform rond de arena, 10 cm afstand van de rand van het platform.
- Plaats een echografie luidspreker 50 cm boven het midden van het platform te leveren van de aversieve auditieve prikkels.
- Plaats een doorzichtig scherm 64 cm boven de arena op rug-project overhead aversieve visuele stimuli met behulp van een projector.
- Het licht van de projector die zal verlichten de gedrags toestellen; Kalibreer het zodat er 5-10 lx in het midden van het oppervlak van het platform. Plaats van infrarood licht en een infrarood camera boven het platform, met een lange-pass filter (> 700 nm) om te voorkomen dat de flikkering van de projector in de verworven video.
- Bijhouden van de positie van de muis online, met behulp van commercieel beschikbare software of een geschikt algoritme. Voor het bijhouden van zwarte muizen op een witte arena, past een eenvoudige drempelmethode operatie gevolgd door berekening van het masker centroid.
- Ideaal, plaats het gedrags apparaat binnen een geluid - en licht-proof vak om te voorkomen dat externe signalen op het gebied van het experiment.
2. leveren van aangeboren aversieve Stimuli
Opmerking: De hieronder beschreven prikkels kunnen gegenereerd worden met een breed scala van verschillende softwarepakketten, met inbegrip van LabVIEW en Matlab.
- Visuele stimuli
- Project de stimuli op het scherm gepositioneerd 64 cm boven de arena. De prikkel bestaat uit een lineair groeiende donkere cirkel op een grijze achtergrond22 (Weber contrast =-0.98, luminantie = 7,95 cd/m2).
Opmerking: De standaard cirkel moet idealiter worden gecentreerd direct boven de positie van de muis, omspannen een visuele hoek van 2.6° bij aanvang en breidt lineair op 224 ° /s meer dan 200 ms tot 47.4°, waartegen het blijft voor 250 ms voor verschuiving. - Bij het afleveren van de visuele stimuli, centreren boven de muis. Dit kan worden bereikt door te wachten totdat de muis loopt door een vooraf gedefinieerde regio in de arena, of door het bijhouden van de muispositie online en het midden van de cirkel te definiëren met behulp van de coördinaten volgen.
Opmerking: Hoewel we stellen voor het projecteren van de visuele stimuli direct boven de muis, defensief gedrag kunnen ook worden ontlokte als de dezelfde stimulus zal naar verwachting vóór de muis (terwijl het nog steeds parallel aan de vloer). In onze ervaring is dit het geval op zijn minst tot 30 cm voorsprong van de muis positie.
- Project de stimuli op het scherm gepositioneerd 64 cm boven de arena. De prikkel bestaat uit een lineair groeiende donkere cirkel op een grijze achtergrond22 (Weber contrast =-0.98, luminantie = 7,95 cd/m2).
- Auditieve prikkel
- Leiden tot een stimulans bestaande uit een trein van drie frequentie-gemoduleerd up-veegt van 17 tot en met 20 kHz23 meer dan 3 s, duurzame 9 s in totaal. Het geluidsdrukniveau (SPL), gemeten op het niveau van het platform, moet in een bereik tussen 73 en 78 dB.
- Sluit een geluidskaart en een versterker aan de spreker van de echografie gepositioneerd boven de arena te leveren van de auditieve prikkel.
3. dieren:
- Gebruik van mannelijke of vrouwelijke C57BL/6J muizen, tussen 6 en 24 weken oud. Handhaving van dat de dieren op een 12 h licht fietsen met vrije toegang naar chow en water.
- Zorgen dat de muizen enkele zijn ondergebracht ten minste 72 uur vóór de gedrags test en test hen tijdens de licht-fase van het licht fietsen.
Opmerking: Wij vinden dat het verkennend gedrag van de basislijn van single-gehuisvest muizen meer vergelijkbare over dieren dan over muizen groep-gehuisvest. Bovendien, dieren met chirurgische implantaten voor neurale activiteit opname of manipulatie vaak opnieuw moet één gehuisvest, en het dus nuttig om controle datasets in dezelfde behuizing voorwaarden kan zijn.
4. standaard gedrags Assay:
- Zorgvuldig reinigen van het oppervlak van het platform met 70% ethanol of azijnzuur te verwijderen van ongewenste olfactorische signalen. De shelter met water spoelen en wassen met 70% ethanol, waarna het moet worden gespoeld met water weer aan het verminderen van de geur van ethanol.
- Zowel het platform als de shelter zorg volledig droog is, zoals de muis de shelter invoeren vermijden kan als het nat is.
- De locatie van het asiel in het platform voor elk afzonderlijk experiment willekeurig door het draaien van het platform voor het experiment. De schuilplaats-locatie zal worden verankerd in de arena maar wordt gedraaid ten opzichte van de behuizing van de gedragsmatige apparaat.
- Breng de muis naar de kamer van het experiment in zijn huis-kooi en plaats van de kooi op de top van het testen platform voor een periode van 10 min acclimatisatie.
- Verwijder de muis uit zijn huis-kooi en vermijden ophalen door de staart: het kopje of laat het klimmen op een verrijking item dat kan worden opgeheven. Muizen door de staart plukken geweest weergeven te verhogen van angst niveaus en dus gedrags reacties op24bedreiging kan beïnvloeden.
- Voorzichtig plaatst u de muisaanwijzer in het midden van de arena en start de video acquisitie.
- Toestaan gedurende 7 min gewenning, waarin geen aversieve stimulus wordt gepresenteerd. Zorg ervoor dat de muis heeft genoeg tijd om te zoeken en invoeren van het asiel ten minste eenmaal. Beschouwen het als een vermelding als alle vier ledematen binnen het opvangcentrum zijn. 7 min moet voldoende zijn voor de meerderheid van de muizen te vinden en invoeren van het opvangcentrum, maar in het geval dat dit niet gebeurt, verlengen de gewenning door aanvullende periodes van 5 minuten tot ten minste één ingang is geverifieerd.
- Leiden tot de levering van de aversieve stimulus (auditieve of visuele) handmatig door het observeren van het levende videovoer of automatisch door het bijhouden van de positie van het dier online en vooraf te definiëren een regio van belang in de arena voor de inwerkingtreding van de stimulus-levering Zodra het dier het bereikt. De visuele prikkel wordt meestal aangeboden direct boven het dier met behulp van de online video bijhouden van coördinaten.
- Om meer dan één vlucht reactie uitlokken in dezelfde sessie, laat u de muis vrijwillig verlaten de shelter. Als de muis niet met succes naar het asiel op de laatste aversieve stimulus, wacht ten minste 60 s ontsnappen ging vóór de presentatie van een andere stimulans.
- Nadat de test is voltooid, terug het dier naar zijn huis-kooi. Indien verdere proeven van de dezelfde muis vereist is, wacht ten minste 48 uur voor nacontrole.
- Reinig het platform en de shelter zoals beschreven in stap 4.1 en 4.2 vóór de proef het volgende dier.
Opmerking: Stappen 5, 6 en 7 zijn onafhankelijke variaties van de standaard gedrags test en elk afzonderlijk kan worden uitgevoerd.
5. "navigatie strategie" gedrags Assay:
Opmerking: Het doel van deze test is om te bepalen welke signalen muizen gebruiken om te ontsnappen gedrag leiden. In deze test, wordt de roerende buitenste gedeelte van het platform gedraaid, terwijl de muisaanwijzer zich op het vaste arena center, die radiaal verdringt het onderdak, de olfactorische signalen bevindt zich in het asiel en de proximale visuele aanwijzingen aangesloten op het platform. Als de muis een van de signalen die hebben gedraaid om te navigeren naar het opvangcentrum volgt, het correct zal ontsnappen naar de nieuwe locatie van het asiel, maar als het gebruikt alle andere aanwijzingen die zijn gebleven, in plaats, zal het navigeren naar de vorige locatie van de schuilplaats.
- Voer stap 4.1 tot 4.8 van de standaard gedrags test hierboven beschreven, aanleiding kunnen geven tot ten minste één vluchtreactie te worden gebruikt als basislijn.
- Laat de muis actief verlaten de shelter en wachten om te navigeren naar het centrale deel van het platform. Plaats een kleine schotel met beddengoed in het midden te moedigen exploratie en houden van het dier in het centrale platform lang genoeg opdat de rotatie van het buitenste gedeelte van het platform. Voeg de schotel en beddengoed, terwijl de muisaanwijzer zich binnen de shelter en na de succesvolle ontsnapping die voorafgaat aan de rotatie van het platform. Als de muis niet invoeren van de shelter tijdens de vlucht reactie, wachten tot het vrijwillig Voer de shelter en voeg vervolgens de schotel en beddengoed.
- Gebruik de stappenmotor aan het platform minstens 36 graden (2 gaten) draaien en dan meteen het gebruik van een zintuiglijke prikkel te wekken een reactie van ontsnappen. Het is mogelijk dat de rotatie wordt gegenereerd een schrikken en zelfs een antwoord ontsnappen initieert.
Opmerking: Uit onze ervaring, ~ 55% van de muizen wordt uitgevoerd buiten het centrale platform voor het (niet-draaiend) terwijl de externe gedeelte is nog steeds draaien, en deze proeven moeten worden uitgesloten van de analyse. - Reinig de platform en onderdak, en de muis terug naar zijn huis-kooi zoals beschreven in stap 4.10 en 4.11.
6. ' dynamische omgeving' gedrags Assay:
Opmerking: Deze test is ontworpen om te evalueren hoe muizen passen hun defensief gedrag op plotselinge veranderingen in het milieu. In deze experimenten, na ten minste één vlucht reactie, aanleiding kunnen geven tot de locatie van de shelter is gewijzigd en de muis is toegestaan voor een bezoek aan het zodra vóór een latere vlucht reactie wordt geactiveerd. Als de muis perfect werkt op de nieuwe locatie van het asiel en het ontbreken van het asiel in haar vorige locatie berekent, moet het ontsnappen naar de nieuwe locatie. Anders, het heeft niet de nieuwe locatie van de shelter gememoriseerd of beide locaties heeft gememoriseerd maar verkiest te ontsnappen naar de vergevorderd men.
- Deze test na de hierboven beschreven stappen 4.1 tot 4.8 aanleiding kunnen geven tot ten minste één vluchtreactie als een controle uitvoeren
- Zodra de muis vrijwillig de schuilplaats verlaat, verwijderen van het asiel en plaats deze opnieuw in een nieuwe gat aan het andere uiteinde van het platform.
- Laat de muis om de omgeving te verkennen, tot hij in de onderdak bij de nieuwe locatie gaat.
- Wanneer de muis vrijwillig komt uit het asiel, huidige het met een aversieve stimulus en observeren de reactie.
- Gebruik de auditieve prikkel voor dit experiment vanwege de langere duur, zoals bedreigd langdurige, dieren mogen verrichten aanvullende ontsnappen reacties op andere locaties als verzuimen om de schuilplaats aanvankelijk vinden.
- Reinig het platform en de schuilplaats en de muis terug te keren naar zijn huis-kooi zoals beschreven in stappen 4.10 en 4.11.
7. "no Shelter' gedrags Assay:
Opmerking: Het doel van deze test is om te begrijpen hoe het ontbreken van een schuilplaats in de omgeving beïnvloedt de expressie van defensief gedrag.
- Sluit alle 20 gaten. In dit experiment is er geen onderdak beschikbaar in de arena.
- Na het schoonmaken en drogen is het platform (stap 4.1 en 4.2), uitvoeren van stappen 4.4-4.6.
- Toestaan dat een periode van 7 min gewenning.
- Presenteren van de visuele stimuli en observeren van de defensieve reactie. Het ontbreken van een schuilplaats bevordert bevriezing gedrag, meestal duren voor de duur van de visuele stimuli. Gebruik van een langzaam groeiende plek (bv. een cirkel die een visuele hoek van 2.6 ° bij aanvang onderspant en breidt lineair op 11.2 ° /s meer dan 4 s tot 47.4 °, waartegen het blijft voor 1 s voordat offset) ter vergemakkelijking van de waarneming van de bevriezing van de reacties.
- Als meer dan één antwoord per muis vereist is, gebruik een interval tussen stimulans van ten minste 60 s.
- Na het verkrijgen van het vereiste aantal reacties in de afwezigheid van de shelter, de shelter onder één van de gaatjes voeren en laat de muis verkennen de omgeving voor ten minste 5 min. zal 5 min genoeg tijd voor de meeste muizen te zoeken en invoeren van het nieuw geïntroduceerde asiel worden , maar in het geval dat dit niet gebeurt, verlenging van deze termijn door aanvullende 5 min blokken totdat ten minste één vermelding is geverifieerd.
- Herhaal stap 4.8 en 4.9, en vlucht reacties uitgevoerd in de aanwezigheid van een schuilplaats in de omgeving waarnemen.
- Reinig het platform en de schuilplaats en de muis terug te keren naar zijn huis-kooi zoals beschreven in stappen 4.10 en 4.11.
8. de data-analyse:
Opmerking: Elk van de volgende stappen uit een data-analyse kan worden uitgevoerd onafhankelijk van elkaar.
- Escape reacties kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als een plotselinge versnelling na de presentatie van een aversieve stimulus. Kwantificeren van de latentie te ontsnappen als de tijd tussen prikkel presentatie en het begin van een hoofd rotatie beweging gericht op het doel van de vlucht of het begin van de beweging van de versnelling, indien dit eerder is.
- Bevriezing van de reacties kan worden gekarakteriseerd door totale immobiliteit van het dier met uitzondering van ademhaling bewegingen25, duurzame ten minste 0.5 s7. Het meten van de latentie te bevriezen als de tijd tussen de indiening van de aversieve stimulus en het begin van de periode van immobiliteit.
- Voor elke vlucht reactie, de lineariteit van de vliegroute door het berekenen van de verhouding van de afstanden tussen de muis en het asiel en de werkelijke verplaatsing tijdens de vlucht te kwantificeren.
- Voor elke vlucht reactie, bereken de juistheid door het meten van de afstand tussen het gat waar het dier haar vlucht naar geregisseerd en het gat leidt naar het opvangcentrum. Aangezien er 20 gaten, elk gat af target vertegenwoordigt een verlaging van 10% in nauwkeurigheid (bv., 2 gaten uit doel kunnen worden uitgedrukt als 80% nauwkeurigheid)
- Voor de "strategie van de navigatie" gedrags assay, de nauwkeurigheid van het antwoord ten opzichte van de locatie van de schuilplaats voor de rotatie van het platform te kwantificeren. Een gemiddelde nauwkeurigheid thats niet sterk afwijkt van de nauwkeurigheid van de pre-rotatie aangeeft dat het dier geen gebruik maakt van een van de sensorische signalen die werden gedraaid om te navigeren naar het doel van de vlucht.
- Voor de 'dynamische omgeving' gedrags assay, elke vlucht reactie ontlokte als wordt omgeleid naar de nieuwe of de oude locatie van de schuilplaats, of geen van beiden te classificeren. Evalueren hoe het patroon langs de iteraties van de elicited defensief gedrag zich ontwikkelt.
- Voor de 'no shelter' gedrags assay, vergelijken van de muis snelheid na de presentatie van de aversieve visuele stimuli in de aanwezigheid en de afwezigheid van een schuilplaats en de latentie het inleiden van de defensieve reactie te berekenen. Bovendien, berekenen de kans een bevriezing reactie naar aanleiding van de stimulans voor elke situatie teweeg te brengen.
Representative Results
Muizen blootgesteld aan auditieve of visuele stimuli ingeleid snel ontsnappen reacties met korte latencies tussen het begin van de stimulatie en tijdens het initiëren van vlucht. De gemiddelde latentie om te ontsnappen aan de visuele stimuli was 202 ± 16 ms (n = 51 reacties van 26 dieren) en aanzienlijk meer tijd voor auditieve stimulatie: 510 ± 61 ms (n = 36 reacties van 15 dieren, p< 0.0001 t-test tussen de visuele en auditieve stimulatie; Figuur 2A) (stap 8.1). Escape reacties werden nauwkeurig gericht naar het opvangcentrum (nauwkeurigheid voor visuele stimulans betekenen: 97.2 ± 1,4% en 95,0 ± 1,4% voor auditieve prikkel, niet significant verschillend tussen de twee soorten stimuli, p = 0.1655 t-toets; Figuur 2B) (stap 8.4), en vlucht trajecten waren dicht bij een rechte lijn (gemiddelde verhouding van verplaatsing naar afstand tot opvang voor visuele stimuli 107.3 ± 1,3% en 113.9 ± 1,5% voor auditieve stimulus; Figuur 2C) (stap 8.3). Observeren van een korte vertraging van de stimulus is belangrijk om te onderscheiden van stimulus-opgeroepen gedrag van homing loopt, en de hoge lineariteit van de vlucht-traject toont aan dat de escape reactie heeft als doel het bereiken van het opvangcentrum, en niet gewoon weg te bewegen van de stimulus.
Stimulans presentatie na de rotatie van de exterieur deel van de maze terwijl de muis werd stationaire in het centrum-platform (bereik = 36° - 90°, gemiddelde 56°) ontlokte met succes ontsnappen Reacties (stap 5). Alle muizen vluchtte naar de vorige locatie van de shelter, met geen afname van de nauwkeurigheid of de lineariteit van vlucht traject ten opzichte van de proeven vóór de rotatie. De gemiddelde nauwkeurigheid, gemeten met de verwijzing naar de oorspronkelijke positie van de schuilplaats, was 96,3 ± 1,3% voordat rotatie (n = 25 reacties van 8 muizen) en zelfs iets hoger na rotatie (100 ± 0%, p = 0,009 t-test tussen pre en post-rotatie). De gemiddelde lineariteit ten opzichte van de oorspronkelijke locatie van de schuilplaats was 109.4 ± 5,0% pre rotatie (25 reacties van 8 muizen) en 109.1 ± 2,1%, na rotatie (n = 8 reacties van 8 muizen), p = 0.957 t-toets tussen pre en post rotatie, figuur 3A en B). Deze resultaten tonen aan dat de proximale visuele aanwijzingen niet worden gebruikt bij de vlucht naar de opvang (stappen 8.3-8.5).
Wijzigen van de locatie van de shelter na het opwekken van een reactie van de succesvolle ontsnapping (stap 6) resulteerde in muizen een bezoek aan de nieuwe locatie van de schuilplaats kort na de verandering (gemiddelde tijd voor een bezoek aan de nieuwe inkapseling 33,1 = s, bereik 4-82 s =). Latere sequentiële proeven van geluid stimulatie geproduceerd een geleidelijke toename van de kans om te ontsnappen naar de nieuwe locatie (44.4% over het eerste proces), 100% bereiken over alle dieren door de vijfde proef (n = 9 dieren, Figuur 3 c). Deze experimenten sonde de dynamiek van het geheugen locatie onderdak aan te passen aan veranderingen in het milieu (stap 8.6) bijwerken.
Na een periode van de acclimatisatie 7 min naar de doolhof met geen onderdak (stap 7), de presentatie van een 5 s lang visuele stimuli geproduceerd bevriezing gedrag in plaats van escape (kans op bevriezing = 95,2%, gemiddelde tijd bevriezen = 7.9 ± 2,7 s, n = 7 dieren). Latere invoering van een asiel in dezelfde sessie en de presentatie van de lange visuele stimuli ontlokte ontsnappen reacties betrouwbaar, waaruit blijkt dat muizen defensieve strategieën, afhankelijk van de aanwezigheid van toevlucht (figuur 3D) (flexibel kunnen overschakelen stap 8.1 en 8.7).
Figuur 1: schematische van de gedragsmatige arena. Tekening van de belangrijkste onderdelen van de gedragsmatige arena bekeken vanaf de bovenkant (rechts) en vanaf de zijkant (links). Een groot deel van het platform kan worden gedraaid, met inbegrip van de opvang en de bijgevoegde visuele aanwijzingen. Donkere kringen in het bovenaanzicht zijn de gaten waarnaar het asiel kan worden aangesloten op, die allemaal identiek zijn (een locatie van de schuilplaats in het volgende voorbeeld wordt aangegeven). De hele arena is ingesloten in een kabinet geluid demping. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Escape reacties zijn snelle en nauwkeurige doelgericht gedrag. (A) de latency te ontsnappen begin bij het begin van visuele of auditieve stimulatie. (B) de nauwkeurigheid van de navigatie naar het opvangcentrum tijdens ontsnapping, gemeten zodanig zijn dat de waarde is 100% als de muis loopt direct naar het opvangcentrum, en 10% minder voor elk gat uit de buurt van het asiel (bv., 80% als het gat bereikt eerst twee gaten van de juiste is was). (C) de verplaatsing van de muis tijdens ontsnapping uitgezet tegen de lineaire afstand tussen het oorspronkelijke standpunt van het dier en de doellocatie, waaruit blijkt dat de vlucht dicht bij lineaire is. Vak en snorharen gegevens weergeven van 10-90-percentiel en de resterende gegevenspunten worden weergegeven als cirkels. Rode kleur percelen zijn gegevens van de auditieve stimulatie (n = 36 reacties van 15 dieren) en zwart zijn van visuele stimulatie (n = 51 reacties van 26 dieren). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: muizen gebruik geen proximale visuele aanknopingspunten of onderdak-gerelateerde signalen bij escape reacties. (A) verplaatsing plot zoals in figuur 2C, voor de reacties pre-en post rotatie van het platform. (B) de nauwkeurigheid van de navigatie tijdens ontsnapping in pre-en post rotatie voorwaarden. Na rotatie nauwkeurigheid wordt gemeten met de verwijzing naar de oorspronkelijke locatie van het opvangcentrum, en toont dat de muizen terug naar de oorspronkelijke locatie van het Onderdak in plaats daarvan de nieuwe positie navigeren. (C) breuk van escape reacties gericht zijn op de nieuwe locatie van de schuilplaats afgeplot tegen de stimulatie nummer. Na de 5th -presentatie van de stimulus, alle dieren ontsnappen rechtstreeks naar de nieuwe locatie van de schuilplaats (n = 9 dieren). (D) betekenen de snelheid over de dieren in reactie op visuele stimulatie met een schuilplaats beschikbaar (rood) of afwezig is (blauw), waaruit ontsnappen en het bevriezen van reacties, respectievelijk. Snelheid is genormaliseerd naar basislijn en uitgelijnd met de reactietijd (gedefinieerd als ofwel het begin van een vlucht of bevriezing reactie, stippellijn). Gearceerde gebieden Toon SEM. (n = 7 dieren). Voor 2A en 2B, het vak en snorharen gegevens weergeven van 10-90-percentiel en de resterende gegevenspunten worden weergegeven als cirkels. Rode kleur percelen zijn gegevens van de auditieve stimulatie voor platform rotatie (n = 25 reacties van 8 dieren) en blauw zijn van reacties na het draaien van het platform (n = 8 reacties van 8 dieren). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De tests die we hier beschrijven zijn technisch eenvoudig uit te voeren, en met uitzondering van het platform rotatie experimenten, kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in een standaard Barnes doolhof. Toch een paar complicaties voordoen: aan de ene kant, de muis lijkt misschien bang voor het invoeren van de shelter, die kan worden als gevolg van het asiel niet voldoende gereinigd of gedroogd. Aan de andere kant, kan de muis blijven binnen het opvangcentrum voor zeer lange periodes. Het is van cruciaal belang voor deze experimenten dat dieren worden nooit verwijderd uit het asiel handmatig, als dit kan verstoren pad integratie, alsmede de nood van de dieren en hun reactie op de bedreiging veranderen. Wij stellen voor beëindiging van het experiment na 90 min en nacontrole na 48 uur indien nodig. Een andere relevante praktische overweging is dat wanneer de muis de rand van het platform onderzoekt, op kan niet speurder visuele stimuli als haar hoofd is schuin over de rand, en dus is het raadzaam het achterhouden van de prikkels in dergelijke situaties. Bovendien, kunnen muizen springen naar beneden het platform op de zeldzame gelegenheden. Wij stellen voor beëindiging van het experiment en nacontrole na 48 h. muizen die actief het platform eenmaal laat zijn waarschijnlijk om het te doen in de toekomst opnieuw en wellicht worden uitgesloten van de studie. Tot slot, vanuit onze ervaring, de meeste muizen zal reageren op de visuele stimuli (34/36 muizen). Echter als de muizen vertonen geen elk soort reactie op de visuele stimuli (een schrikken, een vlucht of een bevriezing reactie), moeten zij worden uitgesloten van de studie.
Een belangrijk punt om te overwegen is dat de controle van sensorische signalen meestal een probleem in ruimtelijke geheugen testen, zoals vaak het moeilijk is te elimineren alle mogelijke bronnen van verontreiniging van de signalen. Onze experimentele opzet vermindert externe visuele aanwijzingen door de doolhof met een muur, en het wordt geplaatst in een kast geluid demping voor correcte isolatie. Om te minimaliseren olfactorische signalen, is het raadzaam de set-up met 70% ethanol of azijnzuur tussen experimenten grondig te reinigen.
Onze gedrags bepaling wordt toegevoegd aan de vorige methoden voor het bestuderen van de ruimtelijke navigatie26 door instinctieve defensief gedrag sonde ruimtelijke geheugen gebruiken en zich te concentreren op de ethologische scenario's. Een cruciaal verschil tussen de hier beschreven procedures en de standaard BM-bepaling is het ontbreken van trainingen. In onze tests, de periode van gewenning zorgt ervoor dat de muis ten minste eenmaal de beschutting en vaak veel meer tijden, die wij hebben eerder getoond voldoende te onthouden de opvang locatie2bezoeken. Wij zijn van mening dat een belangrijke reden voor de hoge slagingspercentage en de nauwkeurigheid in het vinden van de shelter ondanks het gebrek aan opleiding is nooit passief verdringt het dier tijdens het experiment, waardoor integratie van het pad een levensvatbare navigatie-strategie. Wij merken echter dat onze assay geheugen gevormd en beoordeeld tijdens een enkele sessie behandelt, en dat hebben wij niet getest voor lange-termijn geheugen van opvang locatie, dat meestal het doel van standaard BM experimenten is. Ten slotte, met behulp van discrete aangeboren aversieve stimuli in plaats van de gebruikte ventilator of buzz voor de duur van de sessie, onze assay biedt zeer goede experimentele controle over twee gedragingen die verschillende navigatie strategieën gebruikt mogelijk: foerageren en schuilplaats-geleide ontsnappen. Wij zijn van mening dat het gebruik van deze tests in combinatie met moderne neurowetenschap technieken voor het opnemen en manipuleren van neurale activiteit kan bieden belangrijke inzichten in hoe neurale circuits berekenen gedrag.
Disclosures
Het grootste deel van de gegevens opgenomen in het gedeelte ' resultaten ' is een subset van de gegevens gepresenteerd in Vale et. al 2017.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust/Royal Society Henry Dale Fellowship (098400/Z/12/Z), een medische Raad voor onderzoek (MRC) toekennen MC-UP-1201/1, Wellcome Trust en Gatsby Charitable Foundation SWC Fellowship (naar T.B.), MRC PhD studententijd (D.E. en R.V) en een Boehringer Ingelheim Fonds PhD fellowship (op R.V). Wij danken Kostas Betsios voor het programmeren van de data acquisitie software, de LMB mechanische en elektrische Workshops voor de bouw van de experimentele arena.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared iluminators TV6700 | Abus | - | |
| DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
| Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | - | |
| Amplifier QTX PRO240 | QTX | - | |
| Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
| HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
| 100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
| Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
| National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
| LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | - | |
| Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | - |
References
- Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J Exp Biol. 66 (1), 65-81 (1977).
- Vale, R., Evans, D. A., Branco, T. Rapid Spatial Learning Controls Instinctive Defensive Behavior in Mice. Curr Biol. 27 (9), 1342-1349 (2017).
- Blanchard, R. J., Flannelly, K. J., Blanchard, D. C. Defensive behavior of laboratory and wild Rattus norvegicus. J Comp Psychol. 100 (2), 101-107 (1986).
- Dill, L. M., Houtman, R. The influence of distance to refuge on flight initiation distance in the gray squirrel (Sciurus carolinensis). Canadian Journal of Zoology. 67 (1), 233-235 (1989).
- Blanchard, R. J., Blanchard, D. C., Rodgers, J., Weiss, S. M. The characterization and modelling of antipredator defensive behavior. Neurosci Biobehav Rev. 14 (4), 463-472 (1990).
- Fanselow, M. S., Lester, L. S. A functional behavioristic approach to aversively motivated behavior: Predatory imminence as a determinant of the topography of defensive behavior. Evolution and learning. , (1988).
- De Franceschi, G., Vivattanasarn, T., Saleem, A. B., Solomon, S. G. Vision Guides Selection of Freeze or Flight Defense Strategies in Mice. Curr Biol. 26 (16), 2150-2154 (2016).
- Bräcker, L. B., et al. Essential role of the mushroom body in context-dependent CO 2 avoidance in Drosophila. Current Biology. 23 (13), 1228-1234 (2013).
- Ghosh, D. D., et al. Neural architecture of hunger-dependent multisensory decision making in C. elegans. Neuron. 92 (5), 1049-1062 (2016).
- Bellman, K. L., Krasne, F. B. Adaptive complexity of interactions between feeding and escape in crayfish. Science. 221 (4612), 779-781 (1983).
- Rodgers, W., Melzack, R., Segal, J.
- Dill, L. M. The escape response of the zebra danio (Brachydanio rerio) II. The effect of experience. Animal Behaviour. 22 (3), 723-730 (1974).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Physiol Psychol. 93 (1), 74-104 (1979).
- Pompl, P. N., Mullan, M. J., Bjugstad, K., Arendash, G. W. Adaptation of the circular platform spatial memory task for mice: use in detecting cognitive impairment in the APP(SW) transgenic mouse model for Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 87 (1), 87-95 (1999).
- Patil, S. S., Sunyer, B., Höger, H., Lubec, G. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water maze. Behavioural Brain Research. 198 (1), 58-68 (2009).
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Protocol Exchange. , (2007).
- Attar, A., et al. A shortened Barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8 (11), e80355 (2013).
- Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learn Mem. 13 (6), 809-819 (2006).
- Leary, T. P., Brown, R. E. The effects of apparatus design and test procedure on learning and memory performance of C57BL/6J mice on the Barnes maze. J Neurosci Methods. 203 (2), 315-324 (2012).
- Mittelstaedt, M. -L., Mittelstaedt, H. Homing by path integration in a mammal. Naturwissenschaften. 67 (11), 566-567 (1980).
- Stackman, R. W., Golob, E. J., Bassett, J. P., Taube, J. S. Passive transport disrupts directional path integration by rat head direction cells. J Neurophysiol. 90 (5), 2862-2874 (2003).
- Yilmaz, M., Meister, M. Rapid innate defensive responses of mice to looming visual stimuli. Curr Biol. 23 (20), 2011-2015 (2013).
- Mongeau, R., Miller, G. A., Chiang, E., Anderson, D. J. Neural correlates of competing fear behaviors evoked by an innately aversive stimulus. J Neurosci. 23 (9), 3855-3868 (2003).
- Hurst, J. L., West, R. S.
- Paylor, R., Tracy, R., Wehner, J., Rudy, J. W. DBA/2 and C57BL/6 mice differ in contextual fear but not auditory fear conditioning. Behavioral neuroscience. 108 (4), 810 (1994).
- Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203 (2), 151-164 (2009).
