Summary
Questo protocollo descrive un'analisi comportamentale, basata sulla prova del labirinto di Barnes, per studiare come istintiva difensiva azioni sono modificate dalla conoscenza dell'ambiente spaziale.
Abstract
Evoluzione ha selezionato un repertorio di comportamenti difensivi che sono essenziali per la sopravvivenza attraverso tutte le specie animali. Questi comportamenti sono spesso stereotipate azioni suscitate in risposta a stimoli sensoriali congenitalmente avversivi, ma il loro successo richiede una sufficiente flessibilità per adattarsi ai diversi ambienti spaziali, che possono cambiare rapidamente. Qui, descriviamo un'analisi comportamentale per valutare l'influenza della conoscenza acquisita spazio sui comportamenti difensivi in topi. Abbiamo adattato il test di memoria spaziale di labirinto Barnes ampiamente utilizzato per indagare come topi navigare verso un riparo durante le risposte di fuga a congenitalmente avversivi stimoli sensoriali in un ambiente novello, e come si adattano ai cambiamenti acuti nell'ambiente. Questo nuovo test è un paradigma etologico che non richiede una formazione e sfrutta la naturale esplorazione modelli e strategie di navigazione nei topi. Proponiamo che il set di protocolli descritti qui sono un potente mezzo di studiare i comportamenti mirati e stimolo-innescato la navigazione, che dovrebbe essere di interesse per entrambi i campi di comportamenti istintivi e memoria spaziale.
Introduction
Comportamenti difensivi istintivi in gran parte sono considerati essere hardwired risposte agli stimoli, ad esempio il movimento di C-start in pesci e anfibi, che sposta l'animale lontano da una fonte di minaccia1. Tuttavia, i comportamenti difensivi possono essere più adattabili se flessibilmente tengono conto delle informazioni apprese sull'ambiente corrente. Un esempio di tale flessibilità è il passaggio da fuga a congelamento mostrato dai roditori quando di fronte alla minaccia, a seconda della conoscenza circa la presenza o l'assenza di un ricovero in ambiente2,3. Altri esempi di flessibilità nei comportamenti innati includono adattando la soglia di iniziazione di volo o sfuggire la velocità a seconda della distanza tra una preda e suo riparo4, distanza a minaccia5,6e precedente esperienza 11 , 12, anche selezionando diverse strategie difensive a seconda delle proprietà sensoriali del stimolo avversivo7, o anche soppressione comportamento difensivo di fronte concorrenti motivazioni quali la fame8, 9,10. La dipendenza della selezione di azione su conoscenze acquisite circa le caratteristiche spaziali dell'ambiente rende istintivi comportamenti difensivi nei topi un potente modello per lo studio della selezione obiettivo, la memoria spaziale e la navigazione. Qui, descriviamo l'adattamento di un'attività comportamento comunemente usata, la memoria spaziale del labirinto (BM) Barnes del kit13, per determinare l'influenza dell'ambiente spaziale sulla selezione azione difensiva nei topi e le loro strategie di navigazione quando in fuga verso un riparo.
Il labirinto di Barnes standard usato per studiare la memoria spaziale e apprendimento nei topi è costituito da una piattaforma di diametro circolare ~ 90 cm con 20 fori equidistanti, di cui 19 sono chiuse, e uno conduce ad un rifugio sotterraneo che topi si adoperi al fine di evitare il campo aperto ambiente della piattaforma. Spesso, deboli stimoli avversivi (cicalino, luce, ventilatore) vengono utilizzati continuamente durante tutto il test per rendere l'ambiente che ha avversione e promuovere così entrata nel rifugio14. Nel dosaggio più comunemente usato15,16, l'animale ha una prova di assuefazione dove è guidato al riparo manualmente dallo sperimentatore immediatamente dopo essendo posizionato sulla piattaforma. Questo è seguito da un periodo di 4 giorni acquisizione, dove ogni giorno che il mouse è permesso di navigare liberamente nel labirinto per 3 min, dopo di che viene nuovamente manualmente guidato al riparo se non si raggiunge durante il periodo di esplorazione. L'ultima tappa del dosaggio è una sonda di prova sul 5° giorno (anche se una memoria a lungo termine di sette giorni trial è anche comunemente eseguita) quando l'animale Esplora il labirinto con tutti i fori chiusi. Memoria a lungo termine e apprendimento sono quantificati dal tempo necessario per trovare riparo e pokes nei fori sbagliati durante il periodo di acquisizione e con il tempo trascorso vicino al foro chiuso riparo la prova della sonda. I risultati tipici mostrano una diminuzione del numero di errori e latenza a raggiungere il rifugio durante l'acquisizione e una proporzione sopra possibilità di tempo trascorso nel quadrante contenente il buco bersaglio chiuso nella sonda prova15.
Mentre parecchie varianti del dosaggio BM sono stati descritti in precedenza17,18,19, il paradigma che descriviamo qui ha tre cambiamenti fondamentali del dosaggio standard. In primo luogo, l'animale viene lasciato per esplorare il labirinto e trovare rifugio in proprio, e test avviene nella stessa sessione, poco dopo il ricovero è stato trovato, durante i periodi in cui l'animale è impegnata nel comportamento esplorativo. Anche se questa impostazione non prova la memoria a lungo termine della posizione riparo, esso è progettato per essere uno scenario naturalistico che imita l'esplorazione del territorio romanzo, sotto la minaccia di predazione. Inoltre, permette testing di come gli animali si adattano ai cambiamenti acuti nell'ambiente, quali cambiamenti improvvisi nel paesaggio. In secondo luogo, un aspetto fondamentale della nostra analisi è che lo sperimentatore non impone mai l'animale dentro o fuori il rifugio, che può disorientare l'animale ed Escludi percorso integrazione20 come una navigazione valida strategia21. Integrazione dei cammini è una strategia di navigazione che utilizza segnali auto-moto, ad esempio spunti propriocettivi e vestibolari, derivanti dall'integrazione del motore deflusso, per aggiornare la posizione corrente dell'animale e navigare verso un obiettivo, che non è possibile se il animale è passivamente trasferito dallo sperimentatore. In terzo luogo, usiamo visual congenitalmente avversivi22 e stimoli uditivi23 per suscitare fuga al rifugio, che è facilmente distinguibile dal comportamento di foraggiamento in corso e consente la valutazione e quantificazione delle strategie di navigazione specifici utilizzati durante la difesa da minacce imminenti. Proponiamo che questo test può essere utile per il ruolo della memoria spaziale nella selezione e implementazione dei comportamenti difensivi di dissezione, e più in generale per il più ampio studio di navigazione mirati e memoria spaziale a breve termine. I protocolli descritti qui sono stati introdotti da Vale et al. nel 2017, a cui rimandiamo i lettori per di più in discussione in profondità delle motivazioni per esperimenti e risultati.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti sotto il Regno Unito animali (procedure scientifiche) Act del 1986 (PPL 70/7652) dopo l'approvazione etica locale.
1. impostare l'apparato comportamentale
Nota: Il componente principale dell'apparato comportamentale è una variante del labirinto di Barnes13 che consiste di una piattaforma circolare acrilica bianca (92 cm di diametro) con 20 equidistante, diametro 5 cm, fori circolari, trova radialmente, 5 cm dal bordo della piattaforma . 19 di questi devono essere chiusi con tappo di plastica nera (5 mm di profondità), mentre il restante foro conduce ad un riparo di Perspex nero (dimensioni 15 x 5.8 x 4,7 cm) che topi possono facilmente entrare e uscire. La zona centrale dell'arena è costituito da una piattaforma circolare fissa (22 cm di diametro) e la periferia è montata su un telaio che permette la rotazione oltre a 360 gradi tramite un motore passo passo controllati dal computer. La piattaforma è elevato 45 cm dal pavimento per evitare che i topi da arrampicata verso il basso. Vedere disegno schematico in Figura 1.
- Allegare visual cues alla periferia della piattaforma (simboli 2D o 3D con diverse forme, colori e modelli), almeno 2 cm dal bordo per impedire topi di raggiungerli.
Nota: Esempi di segnali visivi sono semplici quadrati blu di 262 cm2, o cerchi (diametro di cm 15,5) riempiti con strisce diagonali viola. - Aggiungere ~ 2 g di biancheria da letto da casa-gabbia del mouse all'interno del rifugio per servire come spunto olfattivo locale. Facoltativamente, posizionare un diodo luminoso (LED all'ingresso del rifugio per fornire un'indicazione locale punto di riferimento visivo).
- Per isolare il mouse da esterno, segnali visivi distale, assemblare una parete cilindrica o ottagonale, tavolo allungabile 40 cm di sopra e 15 cm sotto la superficie della piattaforma, intorno all'arena, posizionato 10 cm dal bordo della piattaforma.
- Posizionare un altoparlante ultrasuoni 50 cm sopra il centro della piattaforma, per fornire stimoli uditivi che ha avversione.
- Posto uno schermo traslucido 64 centimetri sopra l'arena a retro-progetto overhead avversivi stimoli visivi utilizzando un proiettore.
- La luce fornita dal proiettore si accende l'apparato comportamentale; calibrarlo affinché c'è 5-10 lx al centro della superficie della piattaforma. Posizionare le luci a infrarossi e una telecamera a infrarossi sopra la piattaforma, con un filtro passa-lungo (> 700 nm) per impedire lo sfarfallio proiettore nel video acquisito.
- Tenere traccia della posizione del mouse on-line, utilizzando un algoritmo adatto o software disponibile in commercio. Per rilevamento neri topi su un'arena bianca, un'operazione di semplice Sogliatura seguita da calcolo del centroide maschera è appropriata.
- Idealmente, posizionare l'apparato comportamentale all'interno di una casella di prova di suono e luce, per impedire che interessano l'esperimento di indicazioni esterne.
2. fornire stimoli avversivi congenitalmente
Nota: Gli stimoli descritti di seguito possono essere generati con una vasta gamma di pacchetti software diversi, inclusi LabVIEW e Matlab.
- Stimolo visivo
- Progetto gli stimoli su schermo posizionato 64 centimetri sopra l'arena. Lo stimolo è costituito da un cerchio scuro linearmente in espansione su una priorità bassa grigia22 (contrasto di Weber =-0.98, luminanza = 7,95 cd/m2).
Nota: Il cerchio standard dovrebbe idealmente essere centrato direttamente sopra la posizione del mouse, che sottende un angolo visivo di 2,6 ° all'inizio e si espande in modo lineare a 224 ° /s oltre 200 ms a 47,4 °, a cui rimane per 250 ms prima di offset. - Quando trasporta lo stimolo visivo, centrarla sopra il mouse. Ciò può essere ottenuto in attesa fino a quando il mouse passa attraverso una regione pre-definita nell'arena, oppure tracciare la posizione del mouse online e utilizzando le coordinate di rilevamento per definire il centro del cerchio.
Nota: Anche se consigliamo di proiettare lo stimolo visivo direttamente sopra il mouse, comportamenti difensivi anche possono essere suscitati se lo stesso stimolo è proiettato davanti il mouse (mentre ancora parallelo al pavimento). Nella nostra esperienza, questo è il caso, almeno fino a 30 cm davanti alla posizione del mouse.
- Progetto gli stimoli su schermo posizionato 64 centimetri sopra l'arena. Lo stimolo è costituito da un cerchio scuro linearmente in espansione su una priorità bassa grigia22 (contrasto di Weber =-0.98, luminanza = 7,95 cd/m2).
- Stimolo acustico
- Innescare uno stimolo costituito da un treno di tre modulato in frequenza up-spazza da 17 a 20 kHz23 oltre 3 s, durata 9 s in totale. Il livello di pressione sonora (SPL), misurato a livello di piattaforma, dovrebbe essere in un range tra 73 e 78 dB.
- Collegare una scheda audio e un amplificatore all'altoparlante ultrasuoni posizionata sopra l'arena per fornire lo stimolo uditivo.
3. gli animali:
- Utilizzare topi C57BL/6J maschi o femminili, tra 6 e 24 settimane di età. Mantenere che gli animali su una luce di 12 h ciclo con accesso gratuito per cibo e acqua.
- Garantire che i topi sono singoli alloggiati almeno 72 ore prima l'analisi comportamentale e la prova loro durante la fase di luce della luce del ciclo.
Nota: Troviamo che il comportamento esplorativo basale dei topi singolo-ospitato è più paragonabile in animali che in topi stabulati in gruppo. Inoltre, animali con impianti chirurgici per la registrazione di attività neurale o manipolazione spesso bisogno di essere unico ospitato, e così può essere utile avere controllo DataSet nelle stesse condizioni di alloggiamento.
4. analisi comportamentale standard:
- Meticolosamente pulita la superficie della piattaforma con etanolo al 70% o acido acetico per rimuovere indesiderati segnali olfattivi. Sciacquare il riparo con acqua e lavare con etanolo al 70%, dopo di che devono essere risciacquato con acqua per ridurre l'odore di etanolo.
- Asciugare accuratamente, sia la piattaforma ed il rifugio come il mouse può evitare di entrare al riparo se è bagnato.
- Randomizzare la posizione del rifugio nella piattaforma per ogni prova ruotando la piattaforma prima dell'esperimento. La posizione di riparo sarà ancorata nell'arena ma sarà ruotata in relazione il recinto apparato comportamentale.
- Portare il mouse a camera esperimento nella sua casa-gabbia e posizionare la gabbia in cima alla piattaforma di prova per un periodo di acclimatazione di 10 min.
- Rimuovere il mouse dalla sua casa-gabbia ed evitare il recupero dalla coda: sia esso della tazza o lasciarlo salire su un elemento di arricchimento che può essere sollevato. Picking topi per la coda è stato mostrare per aumentare i livelli di ansia e così possono influenzare le risposte comportamentali per24di minaccia.
- Delicatamente, posizionare il mouse al centro dell'arena e avviare l'acquisizione di video.
- Consentire per un periodo di assuefazione di 7 min, durante il quale nessun stimolo avversivo è presentato. Assicurarsi che il topo ha abbastanza tempo per trovare e immettere almeno una volta al riparo. Consideratela come una voce se tutte e quattro le membra sono dentro il rifugio. 7 min dovrebbe essere sufficiente per la maggior parte dei topi trovare e immettere al riparo, ma nel caso in cui questo non accade, estendere il periodo di assuefazione di ulteriori periodi di 5 min fino a quando almeno un ingresso è stato verificato.
- Attivare la consegna dello stimolo avversivo (uditiva o visiva) o manualmente osservando il feed video dal vivo, o automaticamente rilevando la posizione dell'animale online e pre-definire una regione di interesse nell'arena per l'innesco di stimolo-consegna una volta che l'animale lo raggiunge. Lo stimolo visivo viene solitamente consegnato direttamente sopra l'animale utilizza il rilevamento delle coordinate di video online.
- Per suscitare più di una risposta di fuga nella stessa sessione, lasciare che il mouse lasciare volontariamente il riparo. Se il mouse non è sfuggita con successo al rifugio all'ultimo stimolo avversivo, attendere almeno 60 s prima di presentare un altro stimolo.
- Dopo il test è finito, è possibile restituire l'animale alla sua casa-gabbia. Nel caso in cui sono necessari altri controlli dello stesso mouse, attendere almeno 48 h prima di ripetere il test.
- Pulire la piattaforma e il rifugio come descritto al punto 4.1 e 4.2 prima di testare il prossimo animale.
Nota: I passaggi 5, 6 e 7 sono indipendenti variazioni del dosaggio standard comportamento e ciascuno può essere eseguita singolarmente.
5. ' strategia di navigazione' analisi comportamentale:
Nota: L'obiettivo di questo test è quello di determinare quali spunti topi utilizzano per guidare il comportamento di fuga. In questa analisi, la porzione esterna mobile della piattaforma viene ruotata mentre il mouse si trova sul centro fisso arena, che sposta radialmente al riparo, i segnali olfattivi che si trova dentro il rifugio e gli indicatori visivi prossimali collegati alla piattaforma. Se il mouse è seguito uno dei segnali che sono stati ruotati per navigare verso il rifugio, scapperà correttamente nella nuova posizione del rifugio, ma se utilizza qualsiasi altri spunti che sono rimaste nel luogo, esso si sposterà alla posizione precedente del riparo.
- Eseguire passaggi 4.1 a 4,8 di analisi comportamentale standard descritto in precedenza, suscitando almeno una risposta di volo per essere utilizzato come linea di base.
- Lasciare che il mouse attivamente lasciare il riparo e aspettare passare alla parte centrale della piattaforma. Posizionare un piccolo piatto con biancheria da letto nel centro di incoraggiare l'esplorazione e mantenere l'animale nella piattaforma centrale abbastanza a lungo per consentire la rotazione della parte esterna della piattaforma. Aggiungere il piatto e la biancheria da letto, mentre il mouse si trova dentro il rifugio e dopo la fuga di successo che precede la rotazione della piattaforma. Se il mouse non riesce ad entrare al riparo durante la risposta di fuga, aspettare che entrano volontariamente al riparo e quindi aggiungere il piatto e la biancheria da letto.
- Utilizzare il motore stepper per ruotare la piattaforma almeno 36 gradi (2 fori) e quindi immediatamente utilizzare uno stimolo sensoriale per suscitare una risposta di fuga. È possibile che la rotazione innesca un startle e avvia anche una risposta di fuga.
Nota: Dalla nostra esperienza, ~ 55% dei topi verrà eseguito di fuori della piattaforma centrale (non rotante) mentre la parte esterna è ancora in rotazione, e queste prove dovrebbero essere esclusi dall'analisi. - Pulire la piattaforma e riparo e tornare il mouse alla sua casa-gabbia come descritto al punto 4.10 e 4.11.
6. ' ambiente dinamico' analisi comportamentale:
Nota: Questo test è stato progettato per valutare come topi adattano i loro comportamenti difensivi a improvvisi cambiamenti nell'ambiente. In questi esperimenti, dopo provoca fuga almeno una risposta, la posizione del rifugio è cambiata e il mouse è permesso di visitarla una volta prima di una successiva fuga risposta è innescata. Se il mouse perfettamente aggiorna la nuova posizione del riparo e calcola l'assenza del rifugio nella relativa posizione precedente, esso dovrebbe sfuggire alla nuova posizione. In caso contrario, esso non è memorizzato nella nuova posizione del riparo o ha memorizzato entrambe le posizioni, ma preferisce sfuggire a quello vecchio.
- Eseguire questo test dopo passaggi 4.1 a 4,8 descritti sopra, suscitando almeno una risposta di volo come un controllo.
- Una volta che il mouse lascia volontariamente il riparo, rimuovere il riparo e riposizionare in un nuovo buco all'estremità opposta della piattaforma.
- Consentire il mouse per esplorare l'ambiente fino a quando entra il rifugio nella nuova posizione.
- Quando il mouse volontariamente viene fuori dal riparo, presente esso con uno stimolo avversivo e osservare la sua risposta.
- Utilizzare lo stimolo acustico per questo esperimento a causa della sua durata, come in prolungata minaccia, gli animali possono eseguire risposte di fuga supplementari ad altre posizioni se riescono a trovare riparo in un primo momento.
- Pulire la piattaforma e riparo e tornare il mouse alla sua casa-gabbia come descritto ai punti 4.10 e 4.11.
7. ' nessun riparo' analisi comportamentale:
Nota: Lo scopo di questo test è di capire come l'assenza di un rifugio nell'ambiente influenza l'espressione dei comportamenti difensivi.
- Collegare tutti i 20 fori. In questo esperimento, non c'è nessun riparo nell'arena.
- Dopo la pulizia e l'asciugatura della piattaforma (punti 4.1 e 4.2), eseguire i punti 4.4-4.6.
- Consentire un periodo di assuefazione di 7 min.
- Presentare lo stimolo visivo e osservare la risposta difensiva. La mancanza di un riparo promuove il comportamento di blocco, di solito durano per tutta la durata dello stimolo visivo. Utilizzare un posto lentamente espansione (ad es. un cerchio che sottende un angolo visivo di 2,6 ° all'inizio e si espande in modo lineare a 11,2 ° /s oltre 4 s a 47,4 °, a cui rimane per 1 s prima offset) per facilitare l'osservazione delle risposte di congelamento.
- Se è necessaria più di una risposta per topo, utilizzare un intervallo di Inter-stimolo di almeno 60 s.
- Dopo ottenere il numero necessario di risposte in assenza del rifugio, introdurre il riparo sotto uno dei fori e lasciate il mouse esplorare l'ambiente per almeno 5 min 5 min sarà abbastanza tempo per la maggior parte dei mouse trovare e immettere il rifugio recentemente introdotto , ma nel caso in cui questo non accade, prorogare tale termine di ulteriori 5 min blocchi fino a quando è verificata almeno una voce.
- Ripetere i passaggi da 4.8 e 4.9 e osservare le risposte di fuga eseguite in presenza di un rifugio nell'ambiente.
- Pulire la piattaforma e riparo e tornare il mouse alla sua casa-gabbia come descritto ai punti 4.10 e 4.11.
8. analisi dei dati:
Nota: Tutte le seguenti fasi di analisi dei dati può essere eseguita in modo indipendente.
- Risposte di fuga possono essere facilmente identificate come un'accelerazione improvvisa dopo la presentazione di uno stimolo avversivo. Quantificare la latenza di fuggire come il tempo tra la presentazione dello stimolo e l'inizio di un movimento di rotazione della testa diretto al bersaglio della fuga o l'inizio del movimento di accelerazione, si verifichi per primo.
- Le risposte di congelamento può essere caratterizzata da totale immobilità dell'animale ad eccezione di respirazione movimenti25, durata almeno 0,5 s7. Misurare la latenza di congelare il tempo tra la presentazione dello stimolo avversivo e l'inizio del periodo di immobilità.
- Per ogni risposta di fuga, quantificare la linearità del percorso di volo calcolando il rapporto tra la distanza tra il mouse e il rifugio e lo spostamento reale durante il volo.
- Per ogni risposta di fuga, calcolare la precisione misurando la distanza tra il foro dove l'animale diretto relativo volo a e il foro che conduce al rifugio. Poiché ci sono 20 fori, ogni buco fuori target rappresenta un decremento del 10% in precisione (ad es., 2 fori fuori target possono essere espresso come 80% di precisione)
- Per il dosaggio del comportamento 'strategia di navigazione', quantificare la precisione della risposta rispetto alla posizione del riparo prima la rotazione della piattaforma. Una precisione media che non è significativamente diversa dalla precisione di pre-rotazione indica che l'animale non è utilizzando uno dei segnali sensoriali che sono stati ruotati per individuare la destinazione di fuga.
- Per il dosaggio del comportamento 'ambiente dinamico', classificare ogni risposta di fuga provocata come essendo diretto verso il nuovo o il vecchio percorso di riparo, o nessuno dei due. Valutare come il pattern si evolve lungo le iterazioni dei comportamenti difensivi hanno suscitati.
- Per il dosaggio del comportamento 'nessun riparo', confrontare la velocità del mouse dopo la presentazione dello stimolo visivo che ha avversione in presenza e in assenza di un riparo e calcolare la latenza per l'avvio della risposta difensiva. Inoltre, calcolare la probabilità di innescare una risposta congelamento in risposta allo stimolo per ogni situazione.
Representative Results
Topi esposti a stimoli uditivi o visivi ha avviato le risposte di fuga veloce con breve latenze tra l'inizio della stimolazione e l'inizio del volo. La latenza media per sfuggire lo stimolo visivo era 202 ± 16 ms (n = 51 risposte da 26 animali) e significativamente più lungo per stimolo uditivo: 510 ± 61 ms (n = 36 risposte da 15 animali, p< 0,0001 t-test tra visivo e uditivo stimolazione; Figura 2A) (punto 8.1). Risposte di fuga sono stati accuratamente diretti al rifugio (dire precisione per stimolo visivo: 97,2 ± 1,4% e ± 95,0 1,4% per stimolo uditivo, non significativamente differente tra i due tipi di stimoli, p = 0.1655 t-test; Figura 2B) (punto 8.4), e traiettorie di volo erano vicino a una linea retta (rapporto medio di spostamento a distanza al riparo per stimolo visivo 107,3 ± 1,3% e 113,9 ± 1,5% per stimolo uditivo; Figura 2) (punto 8.3). Osservando una breve latenza dallo stimolo è importante distinguere il comportamento stimolo-evocato dalle esecuzioni di homing e l'elevata linearità della traiettoria di volo dimostra che la risposta di fuga ha l'obiettivo di raggiungere il rifugio e non semplicemente allontanandosi dallo stimolo.
Presentazione dello stimolo dopo la rotazione della parte esterna del labirinto mentre il mouse è stato stazionario nella piattaforma centro (gamma = 36° - 90°, media 56°) con successo ha suscitato risposte di fuga (passo 5). Tutti i topi sono fuggiti verso la posizione precedente del rifugio, con nessuna diminuzione in accuratezza e linearità della traiettoria di volo in confronto le prove prima di rotazione. La precisione media, misurata in riferimento alla posizione originale di riparo, era 96.3 ± 1,3% prima di rotazione (n = 25 risposte da 8 topi) e anche leggermente superiore dopo la rotazione (100 ± 0%, p = 0.009 test t tra pre e post rotazione). La linearità media in base alla posizione di riparo originale era 109,4 ± 5.0% pre-rotazione (25 risposte da 8 topi) e 109,1 ± 2,1%, post-rotazione (n = 8 risposte da 8 topi), p = 0.957 test t tra pre e post-rotazione, Figura 3A e B). Questi risultati dimostrano che prossimale segnali visivi non sono usati per guidare il volo al riparo (passaggi 8.3-8.5).
Cambiando la posizione del rifugio dopo suscitando una risposta di fuga di successo (passaggio 6) ha provocato topi visitando la nuova posizione di riparo poco dopo il cambiamento (tempo medio di visita del nuovo rifugio = 33.1 s, gamma = s 4-82). Successivi studi sequenziali di stimolazione sonora prodotta un graduale aumento della probabilità di sfuggire alla nuova posizione (44,4% il primo trial), raggiungendo il 100% in tutti gli animali dalla quinta prova (n = 9 animali, Figura 3). Questi esperimenti sonda le dinamiche di aggiornare la memoria di posizione del riparo di adattarsi ai cambiamenti nell'ambiente (passo 8,6).
Dopo un periodo di acclimatazione di 7 min per il labirinto con nessun riparo (passaggio 7), la presentazione di uno stimolo lungo visivo di s 5 prodotto comportamento di blocco anziché escape (probabilità di congelamento = 95,2%, media tempo di congelamento = 7,9 ± 2.7 s, n = 7 animali). Successiva introduzione di un riparo nella stessa sessione e la presentazione dello stimolo visivo lungo ha suscitato sfuggire le risposte in modo affidabile, mostrando che topi flessibilmente possono cambiare strategie difensive a seconda della presenza del rifugio (Figura 3D) ( a pochi passi 8.1 e 8,7).
Figura 1: schematica dell'arena comportamentale. Disegno dei componenti principali dell'arena comportamento hanno visualizzato dall'alto (a destra) e dal lato (a sinistra). Una grande frazione della piattaforma può essere ruotata, tra cui il ricovero e l'annesso segnali visivi. Cerchi scuri nella vista dall'alto sono i fori a cui il riparo può essere collegato a, che sono tutte identici (un esempio di posizione di riparo è indicato). L'intera arena è racchiuso in una cabina fonoassorbenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: risposte di fuga sono comportamenti mirati veloci e precisi. (A) latenza all'insorgenza di fuga dall'inizio della stimolazione visiva o uditiva. (B) la precisione della navigazione al riparo durante la fuga, misurata in modo che il valore è 100% se il mouse viene eseguito direttamente al rifugio e 10% in meno per ogni buca dal rifugio (ad es., 80% se il foro ha raggiunto in primo luogo era due fori lontano da quella giusta). (C) lo spostamento del mouse durante la fuga tramato contro la distanza lineare tra la posizione iniziale dell'animale e il percorso di destinazione, mostrando che il volo è vicino a lineare. Scatola e baffi Visualizza dati da 10-90 ° percentile e i rimanenti punti di dati vengono visualizzati come cerchi. Trame di colore rosso sono dati da stimolo uditivo (n = 36 risposte da 15 animali) e nero sono da stimolazione visiva (n = 51 risposte da 26 animali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: topi non utilizzano segnali visivi prossimale o correlate a riparo spunti per guidare le risposte fuga. (A) grafico di spostamento come in Figura 2, per le risposte pre- e post-rotazione della piattaforma. (B) precisione di navigazione durante la fuga in condizioni di pre- e post-rotazione. Precisione di post-rotazione è misurata in riferimento alla posizione iniziale del riparo e mostra che i topi navigare nella posizione originale di riparo invece la nuova posizione. (C) frazione di risposte di fuga dirette verso la nuova posizione di riparo complottata contro numero di stimolazione. Dopo la presentazione dith 5 dello stimolo, tutti gli animali fuggire direttamente verso la nuova posizione di riparo (n = 9 animali). (D) velocità media attraverso gli animali in risposta alla stimolazione visiva con un riparo disponibile (rosso) o assente (blu), mostrando la fuga e congelamento risposte, rispettivamente. Velocità è stato normalizzato al basale e allineato al tempo di reazione (definito come sia l'inizio di un volo o congelamento risposta, linea tratteggiata). Aree ombreggiate Visualizza SEM. (n = 7 animali). Per 2A e 2B, la scatola e baffi Visualizza dati da 10-90 ° percentile e i rimanenti punti di dati vengono visualizzati come cerchi. Trame di colore rosso sono dati da stimolo uditivo prima rotazione della piattaforma (n = 25 risposte da 8 animali) e blu sono da risposte dopo la piattaforma rotante (n = 8 risposte da 8 animali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I saggi che descriviamo qui sono tecnicamente semplici da eseguire, e fatta eccezione per la piattaforma esperimenti di rotazione, può essere facilmente implementato in un labirinto di Barnes standard. Tuttavia, alcune complicazioni possono sorgere: da un lato, il mouse può sembrare paura di entrare il rifugio, che può essere dovuto al riparo non essendo sufficientemente puliti o secchi. D'altra parte, il mouse può stare dentro al riparo per lunghissimi periodi di tempo. È fondamentale per questi esperimenti che gli animali non sono mai rimosso dal riparo manualmente, poiché ciò può interferire con integrazione dei cammini così come afflizione gli animali e cambiare la loro risposta alla minaccia. Si consiglia di terminare l'esperimento dopo 90 min e ripetere il test dopo 48 h se necessario. Un'altra considerazione pratica rilevante è che quando il mouse indaga il bordo della piattaforma, potrebbe non rilevare stimoli visivi se la testa è inclinata sopra il bordo, e così si consiglia di trattenere gli stimoli in tali situazioni. Inoltre, topi possono saltare giù dalla piattaforma in rare occasioni. Si consiglia di terminare l'esperimento e ripetere il test dopo 48 h. topi che attivamente lasciano la piattaforma una volta rischiano di farlo nuovamente in futuro e potrebbero essere necessario essere esclusi dallo studio. Infine, dalla nostra esperienza, la maggior parte dei topi risponderà allo stimolo visivo (34/36 topi). Tuttavia, se i topi non mostrano alcun tipo di risposta allo stimolo visivo (un trasalimento, un volo o una risposta congelamento), dovrebbero essere esclusi dallo studio.
Un punto importante da considerare è che il controllo dei segnali sensoriali è in genere un problema nelle analisi di memoria spaziale, come spesso è difficile da eliminare tutte le possibili fonti di contaminazione spunti. La nostra messa a punto sperimentale riduce segnali visivi esterni circondando il labirinto con un muro e viene inserito all'interno di un armadio fonoassorbenti per isolamento acustico. Per ridurre al minimo i segnali olfattivi, si consiglia di pulire accuratamente il set-up con etanolo al 70% o acido acetico tra esperimenti.
Nostra analisi comportamentale si aggiunge ai precedenti metodi per lo studio della navigazione spaziale26 utilizzando comportamenti difensivi istintivi per sondare la memoria spaziale e concentrandosi su scenari etologici. Una differenza fondamentale tra le procedure qui descritte e il test standard di BM è la mancanza di sessioni di formazione. Nelle nostre analisi, il periodo di assuefazione assicura che il mouse visite al riparo almeno una volta e spesso molte più volte, che abbiamo precedentemente dimostrato sufficiente memorizzare la posizione di riparo2. Noi crediamo che un motivo importante per l'alto tasso di successo e la precisione nella ricerca del rifugio nonostante la mancanza di formazione è mai passivamente spostando l'animale durante l'esperimento, rendendo così l'integrazione del percorso una strategia praticabile di navigazione. Notiamo tuttavia che la nostra analisi occupa memoria formata e valutati durante una singola sessione, e che non è stato testato per la memoria a lungo termine della posizione di riparo, che di solito è l'obiettivo degli standard BM esperimenti. Infine, utilizzando stimoli avversivi congenitalmente discreti piuttosto che il ventilatore comunemente usati o buzz per tutta la durata della sessione, nostro test fornisce un ottimo controllo sperimentale oltre due comportamenti che potrebbero utilizzare strategie di navigazione differenti: foraggiamento e riparo-regia fuga. Noi crediamo che l'uso di questi metodi in combinazione con tecniche moderne neuroscienze per la registrazione e la manipolazione delle attività neurale può fornire importanti intuizioni circuiti neurali come calcolare il comportamento.
Disclosures
La maggior parte dei dati inseriti nella sezione risultati è un sottoinsieme dei dati presentati a Vale et. al 2017.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da un Wellcome Trust/Royal Society Henry Dale Fellowship (098400/Z/12/Z), un Consiglio di ricerca medica (MRC) concedere il MC-UP-1201/1, Wellcome Trust e Gatsby Charitable Foundation Fellowship SWC (a T.B.), MRC PhD Studentship (D.E. e rap) e una borsa di dottorato di ricerca di Boehringer Ingelheim Fonds (di rap). Ringraziamo Kostas Betsios per la programmazione del software di acquisizione dati, il LMB meccanici ed elettrici officine per la costruzione dell'arena sperimentale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared iluminators TV6700 | Abus | - | |
| DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
| Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | - | |
| Amplifier QTX PRO240 | QTX | - | |
| Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
| HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
| 100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
| Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
| National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
| LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | - | |
| Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | - |
References
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