Questo protocollo descrive un’analisi comportamentale, basata sulla prova del labirinto di Barnes, per studiare come istintiva difensiva azioni sono modificate dalla conoscenza dell’ambiente spaziale.
Evoluzione ha selezionato un repertorio di comportamenti difensivi che sono essenziali per la sopravvivenza attraverso tutte le specie animali. Questi comportamenti sono spesso stereotipate azioni suscitate in risposta a stimoli sensoriali congenitalmente avversivi, ma il loro successo richiede una sufficiente flessibilità per adattarsi ai diversi ambienti spaziali, che possono cambiare rapidamente. Qui, descriviamo un’analisi comportamentale per valutare l’influenza della conoscenza acquisita spazio sui comportamenti difensivi in topi. Abbiamo adattato il test di memoria spaziale di labirinto Barnes ampiamente utilizzato per indagare come topi navigare verso un riparo durante le risposte di fuga a congenitalmente avversivi stimoli sensoriali in un ambiente novello, e come si adattano ai cambiamenti acuti nell’ambiente. Questo nuovo test è un paradigma etologico che non richiede una formazione e sfrutta la naturale esplorazione modelli e strategie di navigazione nei topi. Proponiamo che il set di protocolli descritti qui sono un potente mezzo di studiare i comportamenti mirati e stimolo-innescato la navigazione, che dovrebbe essere di interesse per entrambi i campi di comportamenti istintivi e memoria spaziale.
Comportamenti difensivi istintivi in gran parte sono considerati essere hardwired risposte agli stimoli, ad esempio il movimento di C-start in pesci e anfibi, che sposta l’animale lontano da una fonte di minaccia1. Tuttavia, i comportamenti difensivi possono essere più adattabili se flessibilmente tengono conto delle informazioni apprese sull’ambiente corrente. Un esempio di tale flessibilità è il passaggio da fuga a congelamento mostrato dai roditori quando di fronte alla minaccia, a seconda della conoscenza circa la presenza o l’assenza di un ricovero in ambiente2,3. Altri esempi di flessibilità nei comportamenti innati includono adattando la soglia di iniziazione di volo o sfuggire la velocità a seconda della distanza tra una preda e suo riparo4, distanza a minaccia5,6e precedente esperienza 11 , 12, anche selezionando diverse strategie difensive a seconda delle proprietà sensoriali del stimolo avversivo7, o anche soppressione comportamento difensivo di fronte concorrenti motivazioni quali la fame8, 9,10. La dipendenza della selezione di azione su conoscenze acquisite circa le caratteristiche spaziali dell’ambiente rende istintivi comportamenti difensivi nei topi un potente modello per lo studio della selezione obiettivo, la memoria spaziale e la navigazione. Qui, descriviamo l’adattamento di un’attività comportamento comunemente usata, la memoria spaziale del labirinto (BM) Barnes del kit13, per determinare l’influenza dell’ambiente spaziale sulla selezione azione difensiva nei topi e le loro strategie di navigazione quando in fuga verso un riparo.
Il labirinto di Barnes standard usato per studiare la memoria spaziale e apprendimento nei topi è costituito da una piattaforma di diametro circolare ~ 90 cm con 20 fori equidistanti, di cui 19 sono chiuse, e uno conduce ad un rifugio sotterraneo che topi si adoperi al fine di evitare il campo aperto ambiente della piattaforma. Spesso, deboli stimoli avversivi (cicalino, luce, ventilatore) vengono utilizzati continuamente durante tutto il test per rendere l’ambiente che ha avversione e promuovere così entrata nel rifugio14. Nel dosaggio più comunemente usato15,16, l’animale ha una prova di assuefazione dove è guidato al riparo manualmente dallo sperimentatore immediatamente dopo essendo posizionato sulla piattaforma. Questo è seguito da un periodo di 4 giorni acquisizione, dove ogni giorno che il mouse è permesso di navigare liberamente nel labirinto per 3 min, dopo di che viene nuovamente manualmente guidato al riparo se non si raggiunge durante il periodo di esplorazione. L’ultima tappa del dosaggio è una sonda di prova sul 5° giorno (anche se una memoria a lungo termine di sette giorni trial è anche comunemente eseguita) quando l’animale Esplora il labirinto con tutti i fori chiusi. Memoria a lungo termine e apprendimento sono quantificati dal tempo necessario per trovare riparo e pokes nei fori sbagliati durante il periodo di acquisizione e con il tempo trascorso vicino al foro chiuso riparo la prova della sonda. I risultati tipici mostrano una diminuzione del numero di errori e latenza a raggiungere il rifugio durante l’acquisizione e una proporzione sopra possibilità di tempo trascorso nel quadrante contenente il buco bersaglio chiuso nella sonda prova15.
Mentre parecchie varianti del dosaggio BM sono stati descritti in precedenza17,18,19, il paradigma che descriviamo qui ha tre cambiamenti fondamentali del dosaggio standard. In primo luogo, l’animale viene lasciato per esplorare il labirinto e trovare rifugio in proprio, e test avviene nella stessa sessione, poco dopo il ricovero è stato trovato, durante i periodi in cui l’animale è impegnata nel comportamento esplorativo. Anche se questa impostazione non prova la memoria a lungo termine della posizione riparo, esso è progettato per essere uno scenario naturalistico che imita l’esplorazione del territorio romanzo, sotto la minaccia di predazione. Inoltre, permette testing di come gli animali si adattano ai cambiamenti acuti nell’ambiente, quali cambiamenti improvvisi nel paesaggio. In secondo luogo, un aspetto fondamentale della nostra analisi è che lo sperimentatore non impone mai l’animale dentro o fuori il rifugio, che può disorientare l’animale ed Escludi percorso integrazione20 come una navigazione valida strategia21. Integrazione dei cammini è una strategia di navigazione che utilizza segnali auto-moto, ad esempio spunti propriocettivi e vestibolari, derivanti dall’integrazione del motore deflusso, per aggiornare la posizione corrente dell’animale e navigare verso un obiettivo, che non è possibile se il animale è passivamente trasferito dallo sperimentatore. In terzo luogo, usiamo visual congenitalmente avversivi22 e stimoli uditivi23 per suscitare fuga al rifugio, che è facilmente distinguibile dal comportamento di foraggiamento in corso e consente la valutazione e quantificazione delle strategie di navigazione specifici utilizzati durante la difesa da minacce imminenti. Proponiamo che questo test può essere utile per il ruolo della memoria spaziale nella selezione e implementazione dei comportamenti difensivi di dissezione, e più in generale per il più ampio studio di navigazione mirati e memoria spaziale a breve termine. I protocolli descritti qui sono stati introdotti da Vale et al. nel 2017, a cui rimandiamo i lettori per di più in discussione in profondità delle motivazioni per esperimenti e risultati.
I saggi che descriviamo qui sono tecnicamente semplici da eseguire, e fatta eccezione per la piattaforma esperimenti di rotazione, può essere facilmente implementato in un labirinto di Barnes standard. Tuttavia, alcune complicazioni possono sorgere: da un lato, il mouse può sembrare paura di entrare il rifugio, che può essere dovuto al riparo non essendo sufficientemente puliti o secchi. D’altra parte, il mouse può stare dentro al riparo per lunghissimi periodi di tempo. È fondamentale per questi esperimenti che gli animali non sono mai rimosso dal riparo manualmente, poiché ciò può interferire con integrazione dei cammini così come afflizione gli animali e cambiare la loro risposta alla minaccia. Si consiglia di terminare l’esperimento dopo 90 min e ripetere il test dopo 48 h se necessario. Un’altra considerazione pratica rilevante è che quando il mouse indaga il bordo della piattaforma, potrebbe non rilevare stimoli visivi se la testa è inclinata sopra il bordo, e così si consiglia di trattenere gli stimoli in tali situazioni. Inoltre, topi possono saltare giù dalla piattaforma in rare occasioni. Si consiglia di terminare l’esperimento e ripetere il test dopo 48 h. topi che attivamente lasciano la piattaforma una volta rischiano di farlo nuovamente in futuro e potrebbero essere necessario essere esclusi dallo studio. Infine, dalla nostra esperienza, la maggior parte dei topi risponderà allo stimolo visivo (34/36 topi). Tuttavia, se i topi non mostrano alcun tipo di risposta allo stimolo visivo (un trasalimento, un volo o una risposta congelamento), dovrebbero essere esclusi dallo studio.
Un punto importante da considerare è che il controllo dei segnali sensoriali è in genere un problema nelle analisi di memoria spaziale, come spesso è difficile da eliminare tutte le possibili fonti di contaminazione spunti. La nostra messa a punto sperimentale riduce segnali visivi esterni circondando il labirinto con un muro e viene inserito all’interno di un armadio fonoassorbenti per isolamento acustico. Per ridurre al minimo i segnali olfattivi, si consiglia di pulire accuratamente il set-up con etanolo al 70% o acido acetico tra esperimenti.
Nostra analisi comportamentale si aggiunge ai precedenti metodi per lo studio della navigazione spaziale26 utilizzando comportamenti difensivi istintivi per sondare la memoria spaziale e concentrandosi su scenari etologici. Una differenza fondamentale tra le procedure qui descritte e il test standard di BM è la mancanza di sessioni di formazione. Nelle nostre analisi, il periodo di assuefazione assicura che il mouse visite al riparo almeno una volta e spesso molte più volte, che abbiamo precedentemente dimostrato sufficiente memorizzare la posizione di riparo2. Noi crediamo che un motivo importante per l’alto tasso di successo e la precisione nella ricerca del rifugio nonostante la mancanza di formazione è mai passivamente spostando l’animale durante l’esperimento, rendendo così l’integrazione del percorso una strategia praticabile di navigazione. Notiamo tuttavia che la nostra analisi occupa memoria formata e valutati durante una singola sessione, e che non è stato testato per la memoria a lungo termine della posizione di riparo, che di solito è l’obiettivo degli standard BM esperimenti. Infine, utilizzando stimoli avversivi congenitalmente discreti piuttosto che il ventilatore comunemente usati o buzz per tutta la durata della sessione, nostro test fornisce un ottimo controllo sperimentale oltre due comportamenti che potrebbero utilizzare strategie di navigazione differenti: foraggiamento e riparo-regia fuga. Noi crediamo che l’uso di questi metodi in combinazione con tecniche moderne neuroscienze per la registrazione e la manipolazione delle attività neurale può fornire importanti intuizioni circuiti neurali come calcolare il comportamento.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato da un Wellcome Trust/Royal Society Henry Dale Fellowship (098400/Z/12/Z), un Consiglio di ricerca medica (MRC) concedere il MC-UP-1201/1, Wellcome Trust e Gatsby Charitable Foundation Fellowship SWC (a T.B.), MRC PhD Studentship (D.E. e rap) e una borsa di dottorato di ricerca di Boehringer Ingelheim Fonds (di rap). Ringraziamo Kostas Betsios per la programmazione del software di acquisizione dati, il LMB meccanici ed elettrici officine per la costruzione dell’arena sperimentale.
Infrared iluminators TV6700 | Abus | – | |
DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | – | |
Amplifier QTX PRO240 | QTX | – | |
Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | – | |
Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | – |