Este protocolo descreve um ensaio comportamental, com base no teste de labirinto de Barnes, para estudar como instintiva defensiva ações são modificadas pelo conhecimento do ambiente espacial.
Evolução selecionou um repertório de comportamentos defensivos que são essenciais para a sobrevivência em todas as espécies animais. Esses comportamentos são muitas vezes ações estereotipadas que suscitou em resposta a estímulos sensoriais intrinsecamente contrário, mas seu sucesso requer flexibilidade suficiente para adaptar a diferentes ambientes espaciais, que podem mudar rapidamente. Aqui, descrevemos um ensaio comportamental para avaliar a influência do conhecimento espacial em comportamentos defensivos em camundongos. Adaptámos o ensaio de memória espacial de labirinto Barnes amplamente usado para investigar como os ratos navegam para um abrigo durante respostas de fuga aos estímulos sensoriais intrinsecamente contrário em um ambiente de romance, e como eles se adaptam às mudanças agudas no ambiente. Este novo ensaio é uma paradigma Etológica que não requer treinamento e explora os padrões de exploração natural e estratégias de navegação em camundongos. Propomos que o conjunto de protocolos descritos aqui são um meio poderoso de estudo dos comportamentos objetivo direcionado e acionadas por estímulo de navegação, que deve ser de interesse para ambos os campos de comportamentos instintivos e memória espacial.
Comportamentos defensivos instintivos são amplamente considerados hardwired-respostas aos estímulos, tais como o movimento de C-início em peixes e anfíbios, que move o animal longe de uma fonte de ameaça1. No entanto, comportamentos defensivos podem ser mais adaptáveis se flexìvel levam em conta as informações sobre o ambiente atual. Um exemplo de tal flexibilidade é o interruptor de fuga para congelamento mostrado por roedores quando confrontado com a ameaça, dependendo do conhecimento prévio sobre a presença ou ausência de um abrigo no ambiente2,3. Outros exemplos de flexibilidade em comportamentos inatas incluem adapta o limiar de início de voo ou escapar de velocidade dependendo da distância entre uma presa e seu abrigo4, distância anteriores e a ameaça de5,6, experiência 11 , 12, bem como selecionando diferentes estratégias defensivas, dependendo das propriedades sensoriais do estímulo aversive7, ou mesmo suprimir o comportamento defensivo face a concorrentes motivações como fome8, 9,10. A dependência de seleção de ação no conhecimento adquirido sobre as características espaciais do ambiente faz instintivos comportamentos defensivos em camundongos um poderoso modelo para o estudo objetivo seleção, memória espacial e navegação. Aqui, descrevemos a adaptação de uma tarefa comportamental comumente usada, a memória espacial de labirinto (BM) de Barnes do ensaio13, para determinar a influência do ambiente espacial na seleção de ação defensiva em ratos e suas estratégias de navegação quando fugindo em direção um abrigo.
O labirinto de Barnes padrão usado para estudar a memória espacial e aprendizagem em ratos consiste em uma plataforma de diâmetro circular ~ 90 cm com 20 furos igualmente espaçados, dos quais 19 estão fechadas, e um leva a um abrigo subterrâneo que ratos procuram a fim de evitar o campo aberto ambiente da plataforma. Estímulos aversive fracos (campainha, luz brilhante, ventilador) são frequentemente usados continuamente durante todo o ensaio para tornar o ambiente contrário e assim promover a entrada para o abrigo de14. No ensaio mais comumente usados15,16, o animal tem um julgamento de habituação onde pauta-se para o abrigo manualmente pelo experimentador imediatamente após ser posicionado na plataforma. Isto é seguido por um período de aquisição de 4 dias, onde cada dia que o mouse é permitido navegar livremente no labirinto por 3 min, após o qual novamente manualmente pauta-se para o abrigo se não alcançar, durante o período de exploração. A última fase do ensaio é uma sonda de julgamento sobre o 5º dia (embora uma memória a longo prazo de sete dias julgamento é também comumente realizada) quando o animal explora o labirinto com todos os buracos fechados. Aprendizagem e a longo prazo de memória são quantificados pelo tempo gasto para encontrar o abrigo e pokes nos buracos errados durante o período de aquisição e quando passei perto do furo de abrigo fechado no julgamento de sonda. Resultados típicos mostram uma diminuição do número de erros e latência para alcançar o abrigo durante a aquisição e uma proporção acima-oportunidade de tempo gasto no quadrante contendo o buraco fechado alvo da sonda experimental15.
Enquanto diversas variantes do ensaio BM têm sido descritas anteriormente17,18,19, o paradigma que descrevemos aqui tem três mudanças fundamentais de ensaio padrão. Primeiro, o animal é deixado para explorar o labirinto e encontrar o abrigo por conta própria, e teste é feito na mesma sessão, logo após o abrigo foi encontrado, durante os períodos onde o animal está envolvido em comportamento exploratório. Embora essa configuração não testar a memória de longo prazo, do local de abrigo, ele é projetado para ser um cenário naturalista que imita a exploração do novo território, sob a ameaça de predação. Além disso, permite testes de como animais se adaptar às mudanças agudas no ambiente, tais como mudanças bruscas na paisagem. Em segundo lugar, um aspecto fundamental do nosso ensaio é que o experimentador nunca força o animal dentro ou fora do abrigo, que pode desorientar o animal e excluir caminho integração20 como uma estratégia de navegação viável21. Integração do caminho é uma estratégia de navegação que utiliza sinais de auto-movimento, como pistas proprioceptivas e vestibulares, decorrentes da integração da saída do motor, para atualizar a posição atual do animal e navegar para um objetivo, que não é possível se o animal é deslocado passivamente pelo experimentador. Em terceiro lugar, usamos intrinsecamente contrário visual22 e estímulos auditivos23 para eliciar a fuga para o abrigo, que é facilmente distinguido do comportamento de forrageamento em curso e permite a avaliação e quantificação das estratégias específicas de navegação usado durante a defesa de ameaças iminentes. Propomos que este ensaio será útil para dissecar o papel da memória espacial na seleção e implementação de comportamentos defensivos, e mais geralmente para o mais amplo estudo de navegação objetivo-dirigido e a curto prazo memória espacial. Os protocolos descritos aqui foram introduzidos por Vale et al. em 2017, a que nos referimos aos leitores para mais na discussão de profundidade sobre a justificativa para as experiências e resultados.
Os ensaios que descrevemos aqui são tecnicamente simples de executar, e com excepção da plataforma experimentos de rotação, pode ser implementado facilmente em um labirinto de Barnes padrão. No entanto, algumas complicações podem surgir: por um lado, o rato pode parecer com medo de entrar no abrigo, que pode ser devido ao abrigo de não ser suficientemente limpos ou secas. Por outro lado, o mouse pode ficar dentro do abrigo por longos períodos de tempo. É crítico para estas experiências que os animais são nunca removidos do abrigo manualmente, como isso pode perturbar a integração do caminho, bem como a angústia dos animais e mudar sua resposta à ameaça. Sugerimos que encerra o experimento após 90 min e refazer o teste após 48 h se necessário. Uma outra consideração prática relevante é que quando o mouse investiga a borda da plataforma, não pode detectar estímulos visuais se sua cabeça é dobrada sobre a borda, e, portanto, é recomendável reter os estímulos em tais situações. Além disso, os ratos podem saltar fora da plataforma em raras ocasiões. Sugerimos que terminando o experimento e refazer o teste após 48 h. ratos que ativamente deixar a plataforma uma vez poderão fazê-lo novamente no futuro e podem ter que ser excluídos do estudo. Finalmente, de nossa experiência, a maioria dos ratos responderá ao estímulo visual (34/36 ratos). No entanto, se os ratos não mostram qualquer tipo de resposta ao estímulo visual (um alarme, um voo ou uma resposta de congelamento), eles devem ser excluídos do estudo.
Um aspecto importante a considerar é que o controle de sinais sensoriais normalmente é um problema em ensaios de memória espacial, como muitas vezes é difícil de eliminar todas as possíveis fontes de contaminação pistas. Nossa configuração experimental reduz visuais externas, em torno do labirinto com uma parede, e é colocado dentro de um armário de amortecimento-som para isolamento acústico. Para minimizar as sugestões olfactory, recomendamos limpar cuidadosamente a afinação com 70% de etanol ou ácido acético entre experiências.
Nosso ensaio comportamental adiciona métodos anteriores para estudar navegação espacial26 usando comportamentos defensivos instintivos para sondar a memória espacial e com foco em cenários etológicos. Uma diferença fundamental entre os procedimentos descritos aqui e o teste padrão do BM é a falta de sessões de treinamento. Em nossos ensaios, o período de habituação garante que o mouse visita o abrigo pelo menos uma vez e, frequentemente, muitas vezes mais, que temos demonstrado anteriormente para ser suficientes para memorizar o abrigo local2. Acreditamos que uma razão importante para a elevada taxa de sucesso e precisão em encontrar o abrigo apesar da falta de treinamento nunca passivamente é deslocar o animal durante o experimento, tornando assim a integração do caminho uma estratégia viável de navegação. No entanto notamos que nosso ensaio lida com memória formada e avaliados durante uma única sessão, e que nós não testamos para memória de longo prazo da localização do abrigo, que geralmente é o objetivo do padrão BM experiências. Finalmente, usando estímulos intrinsecamente contrário discretos ao invés do fã comumente usado ou buzz para a duração da sessão, nosso ensaio fornece controle experimental muito bom em dois comportamentos que podem usar estratégias diferentes de navegação: forrageamento e fuga de abrigo-dirigido. Acreditamos que o uso destes ensaios em combinação com técnicas da moderna neurociência para gravação e manipulação de atividade neural pode fornecer insights importantes sobre circuitos neurais como calcular o comportamento.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por um Wellcome Trust/real sociedade Henry Dale Fellowship (098400/Z/Z/12), um Conselho de pesquisa médica (MRC) conceder MC-UP-1201/1, Wellcome Trust e Gatsby Charitable Foundation SWC Fellowship (para tuberculose), MRC PhD Studentship (D.E. e RV) e uma bolsa de doutoramento de Fonds Boehringer Ingelheim (para RV). Agradecemos a Kostas Betsios para o software de aquisição de dados, o LMB mecânicos e elétricos oficinas para construção da arena experimental de programação.
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