Microinjection के Nasonia vitripennis भ्रूण heritable जीनोम संशोधनों पैदा करने के लिए एक आवश्यक तरीका है । यहां वर्णित microinjection और Nasonia vitripennis भ्रूण है, जो बहुत इस जीव में भविष्य जीनोम हेरफेर की सुविधा होगी के प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया है ।
गहना ततैया Nasonia vitripennis सेक्स संकल्प, haplo-द्विगुणित सेक्स संकल्प, विष संश्लेषण, और दूसरों के बीच मेजबान symbiont बातचीत सहित प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक प्रभावी मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है । इस जीव के साथ काम करने का एक प्रमुख सीमा प्रभावी के जीनोम संशोधनों का निर्देश प्रदर्शन प्रोटोकॉल की कमी है । जीनोम संशोधन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा CRISPR/Cas9 अणुओं सहित संपादन रिएजेंट, microinjection के माध्यम से भ्रूण में वितरण है । जबकि microinjection अच्छी तरह से कई मॉडल जीवों में स्थापित है, इस तकनीक विशेष रूप से अपने छोटे भ्रूण के आकार के कारण मुख्य रूप से एन. vitripennis में प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, और तथ्य यह है कि भ्रूण विकास पूरी तरह से एक के भीतर होता है parasitized blowfly pupa. निंनलिखित प्रक्रिया इन महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करते हुए एक सुव्यवस्थित, प्रभावी ढंग से parasitized मेजबान कोषस्थों से ततैया भ्रूण को हटाने के लिए दृश्य प्रक्रिया का प्रदर्शन, उंहें microinjecting, और ध्यान से उंहें वापस में प्रत्यारोपण मेजबान निरंतरता और विकास के पूरा होने के लिए । इस प्रोटोकॉल दृढ़ता से अनुसंधान समूहों की क्षमता बढ़ाने के लिए इस जीव में उंनत जीनोम संशोधनों प्रदर्शन करेंगे ।
गहना ततैया, एन vitripennis, जीनस Nasonia के भीतर चार प्रजातियों में से एक है कि मांस खाने के ectoparasitoids है जैसे Sarcophaga bullata1के रूप में मक्खियों । उनकी तेजी से पीढ़ी के समय के कारण, प्रयोगशाला में पालन की आसानी, और अद्वितीय और महत्वपूर्ण जैविक विशेषताओं की एक श्रृंखला, एन vitripennis पारंपरिक मॉडल जीवों में पाया कई प्रयोगात्मक उपकरणों के विकास के लिए ध्यान दिया गया है . उदाहरण के लिए, कुछ अद्वितीय जैविक विशेषताओं में शामिल है एक haplo-द्विगुणित प्रजनन प्रणाली2, माइक्रोबियल और आनुवंशिक परजीवी के साथ एक रिश्ता3,4, और एक supernumary (बी) गुणसूत्र5,6 ,7. साथ में ले लिया, इन N. vitripennis इन प्रक्रियाओं के आणविक और सेलुलर पहलुओं elucidating के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण प्रायोगिक प्रणाली, विष उत्पादन सहित दूसरों के अलावा8, 9, सेक्स दृढ़ संकल्प10,11, और विकास और अक्ष पैटर्न गठन12,13,14। इसके अलावा, आनुवंशिक toolkit के जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए N। vitripennis नाटकीय रूप से पिछले एक दशक में वृद्धि हुई है या तो, एक उच्च संकल्प जीनोम15के अनुक्रमण के साथ, कई जीन अभिव्यक्ति अध्ययन16,17,18, और कार्यात्मक आरएनए हस्तक्षेप (RNAi)19,20है, जो एक साथ इस जीव में रिवर्स आनुवंशिकी प्रदर्शन की क्षमता और क्षमताओं में सुधार हुआ है पर निर्भर जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने की क्षमता ।
कई महत्वपूर्ण वैज्ञानिक प्रगति और इस जीव में विस्तार toolkit के बावजूद, वर्तमान ज्ञान के रूप में केवल एक ही समूह सफलतापूर्वक भ्रूण microinjections प्रदर्शन किया है heritable जीनोम संशोधन21उत्पंन करते हैं । यह मुख्य रूप से एन vitripennis के भ्रूण के साथ काम करने की कठिनाइयों के कारण के रूप में वे काफी नाजुक और छोटे हैं, जा रहा है ~ 2/3 Drosophila melanogaster भ्रूण के आकार, उंहें आम तौर पर मुश्किल में हेरफेर कर । इसके अतिरिक्त, एन vitripennis मादा पूर्व में अपने अंडे जमा-नीतिश blowfly कोषस्थों, जिसके भीतर embryogenesis, लार्वा, और ुपाल विकास की संपूर्णता होती है. इसलिए, सफल microinjections, पूर्व blastoderm चरण के लिए, भ्रूण कुशलतापूर्वक मेजबान कोषस्थों से एकत्र किया जाना चाहिए, जल्दी microinjected, और तुरंत विकास के लिए अपने मेजबान में वापस प्रत्यारोपित । इन कदमों सटीक और निपुणता microinjected भ्रूण, या ुपाल मेजबान, हानिकारक तकनीक असाधारण चुनौतीपूर्ण बनाने से बचने के लिए की आवश्यकता है । बावजूद, वहां एक लघु एक दशक पहले कि एन vitripennis भ्रूण microinjection22का वर्णन करता है पर प्रकाशित प्रोटोकॉल है । हालांकि, इस प्रक्रिया की आवश्यकता है कि हौसले से रखी भ्रूण शुष्क हो, यह चिपचिपा टेप का उपयोग करता है microinjection के लिए अंडे लंगर, और तकनीक का एक दृश्य प्रदर्शन शामिल नहीं है । इसलिए, यहां वर्णित एक अद्यतन और संशोधित प्रोटोकॉल, एक दृश्य प्रक्रिया सहित, एक बेहतर कदम-दर- N. vitripennis भ्रूण microinjections कि किसी भी बुनियादी प्रयोगशाला द्वारा heritable जीनोम उत्पंन करने के बाद किया जा सकता है के लिए कदम प्रोटोकॉल का ब्यौरा है इस महत्वपूर्ण मॉडल कीट में संशोधन ।
एन vitripennis जीनोम के हाल ही में अनुक्रमण आणविक उपकरण के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता को कार्यात्मकता इस प्रजाति के भीतर अज्ञात जीन विशेषताएं23दिलाई है । CRISPR-Cas9 प्रणाली, और कई अंय जीन संपादन उपकरण, जीवों की एक संख्या के लिए जीन कार्यों की जांच में24मूल्यवान साबित कर दिया है । हालांकि, heritable उत्परिवर्तनों उत्पंन करने के लिए, इन उपकरणों भ्रूण microinjections प्रदर्शन की आवश्यकता है । इसलिए, यहां का प्रदर्शन एक विस्तृत दृश्य तकनीक है कि नवाचारों की एक संख्या है कि कुशल एन vitripennis भ्रूण microinjections के लिए अनुमति भी शामिल है ।
कुल मिलाकर, इस विस्तृत तकनीक महत्वपूर्ण नवाचारों की एक संख्या प्रदान करता है, मौजूदा तरीकों23के संबंध में, कि कुशल एन vitripennis भ्रूण microinjections के लिए अनुमति देते हैं । उदाहरण के लिए, भ्रूण, एक oviposition उपकरण (फोम डाट) के तेजी से संग्रह की सुविधा के लिए बनाया है और करने के लिए मेजबान के पीछे के अंत तक पूरी तरह से अंडे बिछाने (चित्रा 1), जो बहुत भीतर कई भ्रूण के संग्रह की सुविधा सीमित इस्तेमाल किया समय की एक छोटी अवधि । अंडे की अधिक से अधिक संख्या को इकट्ठा करने के लिए बड़ी संख्या के साथ ततैया कालोनियों के पालन के लिए तकनीक भी सुधार और परिभाषित कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, भ्रूण संरेखण में तेजी लाने के लिए, एक भ्रूण संरेखण डिवाइस जो भ्रूण के लिए अनुमति देता है कुशलता से गठबंधन किया जा करने के लिए और डबल पक्षीय चिपचिपा टेप का उपयोग करने के लिए जगह में भ्रूण सुरक्षित बिना इंजेक्शन (चित्रा 3) विकसित की है ।
इसके अलावा, यह पाया जाता है कि इंजेक्शन के दौरान पानी के साथ भ्रूण नम रखने के द्वारा और desiccating नहीं भ्रूण या उन्हें कवर तेल के साथ जीवित रहने की दर में सुधार. इसके अतिरिक्त, कई केशिका कांच प्रकार का परीक्षण कर रहे हैं और मापदंडों N. vitripennis microinjection (तालिका 1, चित्रा 4) के लिए सही सुई का निर्माण करने के लिए निर्धारित कर रहे हैं. इसके अलावा, microinjection निंनलिखित, भ्रूण जीवित रहने की दरों में काफी पूर्व में अंडे इंजेक्शन की वजह से वृद्धि करने में सक्षम है नीतिश उच्च आर्द्रता में रखा मेजबान (७०%) मंडलों । ये नवाचार N. vitripennisके लिए अधिक सुव्यवस्थित और सफल microinjection प्रक्रिया के लिए अनुमति देते हैं ।
इंजेक्शन तंत्र के मामले में मामूली संशोधन, और पालन प्रक्रियाओं उपयोगकर्ता वरीयताओं पर निर्भर करता है, इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है । हालांकि, N. vitripennisमें सफलतापूर्वक म्यूटेंट जनरेट करने के लिए कई महत्वपूर्ण चरण आवश्यक होंगे । उदाहरण के लिए, जल्दी से काम इतना है कि इंजेक्शन भ्रूण कर रहे हैं & #62; 1 एच पुराने, और सुनिश्चित करना है कि इंजेक्शन सुई पर्याप्त तेज करने के लिए भ्रूण को नुकसान कम कर रहे हैं दोनों आवश्यक हो जाएगा. हालांकि इस प्रोटोकॉल कई में उत्परिवर्तनों पैदा करने के लिए प्रभावी होना चाहिए (यदि नहीं सभी) जीन, एक प्रमुख सीमा CRIPSR/Cas9 आवश्यकता के लिए एक पाम (NGG) अनुक्रम जो लक्ष्य अनुक्रम हुक्म होगा लक्ष्य है ।
अंत में, इस तकनीक में सुधार इस तरह के उत्परिवर्तनों, विलोपन के रूप में जीनोम संशोधनों के कई प्रकार उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संभवतः भी CRIPSR/Cas9 टेक्नोलॉजीज21का उपयोग कर, या यहां तक कि सम्मिलन transgene ट्रांसजेनिक उत्पन्न करने के लिए एन. vitripennis, जो बहुत इस जीव में कार्यात्मक अनुसंधान में तेजी लाने चाहिए ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम कैलिफोर्निया के एक उदार विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, नदी के किनारे (UCR) प्रयोगशाला शुरू करने के लिए निधि ओ. एस. ए, एक USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान (निफा) हैच परियोजना (१००९५०९) को O.S.A.
Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |