Summary
Microinjection الأجنة فيتريبينيس ناسونيا أسلوب أساسي لتوليد التعديلات الجينوم الموروثة. الموصوفة هنا هو إجراء مفصل ل microinjection وزرع الأجنة فيتريبينيس ناسونيا ، الذي سوف يسهل إلى حد كبير التلاعب الجينوم مستقبلا في هذا الحي.
Abstract
دبور جوهره فيتريبينيس ناسونيا نشأ كنظام نموذج فعال لدراسة العمليات بما في ذلك تحديد نوع الجنس وتحديد جنس هابلو مثنوية وتوليف السم والتفاعلات المضيف-سيمبيونت، من بين آخرين. قيداً رئيسيا للعمل مع هذا الكائن هو عدم وجود بروتوكولات فعالة لإجراء تعديلات الجينوم الموجهة. جزء هام من تعديل الجينوم هو التسليم لتحرير المواد الكاشفة، بما في ذلك جزيئات كريسبر/Cas9، إلى الأجنة عن طريق microinjection. بينما microinjection بشكل جيد في العديد من نموذج الكائنات، هذا الأسلوب يشكل تحديا كبيرا لأداء في فيتريبينيس أ أساسا بسبب حجم الجنين صغير به، وحقيقة أن التنمية الجنينية يحدث تماما داخل عذراء الذبابة الطفيل. الإجراء التالي يتغلب على هذه التحديات الكبيرة في حين تثبت إجراء مبسط والبصرية لفعالية إزالة الأجنة دبور من الطفيل الخوادر المضيف، ميكروينجيكتينج لهم، وزرع بعناية لهم بالعودة إلى البلد المضيف لمواصلة وإنجاز التنمية. وسيعزز هذا البروتوكول بشدة قدرة المجموعات البحثية لإجراء تعديلات متقدمة الجينوم في هذا الحي.
Introduction
دبور جوهره، أ. فيتريبينيس، هو واحد من الأنواع الأربعة داخل جنس ناسونيا التي يتم اكتوباراسيتويدس من الذباب مثل ساركوفاجا bullata1أكل اللحم. بسبب فترات سريعة الأجيال، تيسيرا لتربية في المختبر، ومجموعة من السمات البيولوجية الفريدة والهامة، فيتريبينيس أ تم تركيز لتطوير العديد من الأدوات التجريبية الموجودة في الكائنات النموذج التقليدي . على سبيل المثال، تتضمن بعض السمات البيولوجية الفريدة نظام استنساخ هابلو ضعفاني2وعلاقة مع الطفيليات الميكروبية والوراثية3،4سوبيرنوماري (ب) كروموسوم5،6 ،7. مجتمعة، وهذه تجعل فيتريبينيس أ. نظام تجريبي مهم لإجراء تجارب تهدف إلى توضيح الجوانب الجزيئية والخلوية لهذه العمليات، بالإضافة إلى الآخرين بما في ذلك إنتاج السم8، 9والجنس عزم10،11، والتطور والتنمية محور نمط تشكيل12،،من1314. وعلاوة على ذلك، مجموعة الأدوات الوراثية لدراسة بيولوجيا N. فيتريبينيس زاد زيادة كبيرة على مدى العقد الماضي أو حتى، مع تسلسل الجينوم عالية الدقة15، التعبير الجيني عدة دراسات16،،من1718، القدرة على تعطيل وظيفيا التعبير الجيني الاعتماد على تدخل الجيش الملكي النيبالي19،([رني])20, الذي معا قد تحسنت الصوبة وقدرات أداء عكس علم الوراثة في هذا الحي.
على الرغم من العديد من التطورات العلمية الهامة وأدوات العمل الموسع في هذا الحي، اعتبارا من المعارف الحالية مجموعة واحدة فقط قد بنجاح أداء ميكروينجيكشنز الجنينية لتوليد الجينوم الموروثة التعديلات21. وهذا يرجع أساسا إلى الصعوبات التي تكتنف العمل مع الأجنة من فيتريبينيس أ أنها هشة جداً وصغيرة، يجري ~2/3 حجم الأجنة melanogaster المورفولوجية ، يجعلها عموما من الصعب التعامل. بالإضافة إلى ذلك، إيداع فيتريبينيس أ الإناث بيضها في الذبابة قبل اكتوى الخوادر، الذي يحدث بأكملها embryogenesis، اليرقات، والتنمية الخوادر. ولذلك، لنجاح ميكروينجيكشنز، مرحلة ما قبل بلاستوديرم، الأجنة يجب كفاءة جمع من المضيف الخوادر، ميكروينجيكتيد بسرعة، وزرع فورا إلى مضيفيهم للتنمية. هذه الخطوات تتطلب الدقة والمهارة لتجنب إتلاف الأجنة ميكروينجيكتيد، أو المضيفين الخوادر، مما يجعل أسلوب الطعن في حالات استثنائية. على الرغم من، هناك بروتوكول قصيرة واحدة نشرت أكثر من عقد قبل أن تصف فيتريبينيس أ الجنين microinjection22. ومع ذلك، يتطلب هذا الإجراء أن يكون مبشور الأجنة المزروعة حديثا، ويستخدم الشريط مثبت تثبيتاً للبيض ل microinjection، ولا تشمل مظاهرة مرئية تقنية. ولذلك، الموصوفة هنا هو وضع بروتوكول المستكملة والمنقحة، بما في ذلك إجراء visual، يبين بالتفصيل على بروتوكول خطوة بخطوة محسنة فيتريبينيس أ. ميكروينجيكتيونس الأجنة التي يمكن اتباعها من قبل أي مختبر الأساسية لتوليد الجينوم الموروثة تعديلات في هذه الحشرة نموذجا هاما.
Protocol
1-تربية مستعمرة فيتريبينيس ن.
- قم بإعداد عدة مستعمرات (~ 3-5) بوضع 200-500 أ. فيتريبينيس الكبار (بنسبة 3:1 من الإناث: الذكور) في أقفاص المبنى المكون من الشوائب.
ملاحظة: بديل لاستخدام الشوائب مساكن الطلبة، الزنابير يمكن أيضا نشر في أنابيب الاختبار زجاجية صغيرة متعددة، موصولة بالقطن بحوالي 15-20 الزنابير/قنينة.- الحفاظ على الدبابير في 25 ± 1 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 30% ودورة الظلام خفيفة 12:12، اطعامهم يوميا مع قطرات صغيرة من 01:10 (v/v) حل السكروز والمياه.
ملاحظة: يمكن أيضا إجراء نشر المستعمرات دبور ومجموعات في درجة حرارة الغرفة دون الرطوبة الخاضعة للرقابة؛ ومع ذلك، درجات حرارة أقل من 25 درجة مئوية ستكون أقل قليلاً توقيت التنموية للأجنة.
- الحفاظ على الدبابير في 25 ± 1 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 30% ودورة الظلام خفيفة 12:12، اطعامهم يوميا مع قطرات صغيرة من 01:10 (v/v) حل السكروز والمياه.
- تسمح الدبابير رفيقه لمدة 4 أيام على الأقل قبل الحقن.
- لليومين الأول والثاني، السماح بتفعيل الإناث تغذية جديدة الخوادر س. بولاتا ، فضلا عن قطرات صغيرة من 01:10 (v/v) حل السكروز والمياه.
- لليومين التاليين، إزالة الخوادر الذبابة لحرمان الزنابير الإناث من موقع أوفيبوسيشن، يجعلها جرابيد جداً.
2-جمع والمحاذاة للأجنة مرحلة ما قبل بلاستوديرم فيتريبينيس ن.
- تسمح الزنابير الإناث شوش (أوفيبوسيت الأجنة) إلى المضيفين الشباب (بلاطة س. الخوادر). للحفاظ على المضيفين الطازجة، تخزين المضيفين في 4 درجات مئوية فور الحصول عليها وإزالة فقط عند الحاجة.
ملاحظة: يمكن تحديد المضيفين الشباب بوجود بوباريوم ملونة أحمر في حين تستضيف كبار السن بوباريوم ملونة من قتامة (الشكل 1A).- ضع العذبة فرادى bullata س. الخوادر في سداده رغوة مع حفرة الخوادر الحجم مقطعة إلى المركز. يعرض فقط ~ 0.2 سم نهاية الأمامي (موقع أوفيبوسيشن المفضل) المضيف للتركيز الأقصى باراسيتيزيشن وجمع الجنين أسهل.
ملاحظة: يتم تقريب نهاية الأمامي، بينما نهاية الخلفي هو أكثر سمكا ويحتوي فتح 'تشبه الحفرة' (الشكل 1B). - ضع المضيف الخوادر (تقريبا 5 المضيف الخوادر لكل 100 الزنابير) في هذا الترتيب في القفص وانتظر حوالي 45 دقيقة للسماح للدبابير شوش لهم (الشكل 2- ثانيا).
ملاحظة: من المهم جداً أن الأجنة الشباب، قدر الإمكان، من الناحية المثالية خلال الساعة الأولى من يجري أوفيبوسيتيد، التأكد من أنها في مرحلة ما قبل بلاستوديرم. الأجنة القديمة (> ح 1.5) ينبغي أن لا يكون حقن. - إزالة الطفيل المضيفين باستردادها من جهة ولطف بالفرشاة/تهب قبالة أي الزنابير يقيمون. يستعاض عنها بالمضيفين جديدة بعد كل ~ 15 دقيقة لمواصلة جمع نظموا أوائل البيض أثناء الحقن.
- ضع العذبة فرادى bullata س. الخوادر في سداده رغوة مع حفرة الخوادر الحجم مقطعة إلى المركز. يعرض فقط ~ 0.2 سم نهاية الأمامي (موقع أوفيبوسيشن المفضل) المضيف للتركيز الأقصى باراسيتيزيشن وجمع الجنين أسهل.
- إزالة المضيفين الطفيل طازجة من القفص باليد. تحت مجهر تشريح، استخدام الملقط، قشر بعيداً بعناية نهاية الخلفي (0.4 سم) بوباريوم الخارجي (شل الخوادر) للكشف عن البيض أ. فيتريبينيس (الشكل 2- ثالثا).
ملاحظة: يجب أن يكون الحرص على تجنب ثقب الجلد الخوادر؛ إذا حدث هذا، سوف ترطيب hemolymph الأجنة دبور، التي سيكون من الصعب جداً لإزالة ل microinjection. - استخدام لاصق سائل اللصق ساترة على شريحة زجاجية نظيفة لإعداد شريحة محاذاة جنين (الشكل 3).
ملاحظة: يتم استخدام مادة لاصقة عالية أداء فوري لزيادة قوة السندات والتجفيف السرعة، لكن أي الغراء الذي يمكن أن تبقى ساترة من يتحرك على الشريحة مقبول. - بروشوف الأجنة من المضيفة بعناية مع الرسام الجميلة-نصيحة رطب، مع التأكد من عدم تلف الجلد الخوادر لينة للبلد المضيف.
ملاحظة: تكون 'اختيار الأجنة،' الذي هو أساسا نصف زوج من الملقط أظهرت، يمكن استخدامها بدلاً من الرسام. - نقل ~ الأجنة 20 واحداً تلو الآخر على الشريحة، المتاخمة مباشرة إلى جانب ساترة مع الرسام رطب. توجيه نهاية الجنين ضد حافة الشريحة الغطاء الأمامي حيث أن نهاية الخلفي للأجنة وهو أشار في نفس الاتجاه (الشكل 2- رابعا). هذا سوف يسمح للدقة العالية للحقن في نفس الموضع بين جميع الأجنة.
ملاحظة: لا تتطلب هذه التقنية المحسنة الشريط الملصقة على الوجهين لإصلاح الأجنة للشريحة كما هو موضح سابقا21،22. بالإضافة إلى ذلك، لا ديسيككاتي الأجنة، أو تغطية البيض بزيت الهالوكربون أثناء الحقن كما هو موضح مسبقاً لفيتريبينيس أ الجنين microinjection22.
3-إبرة التحضير ميكروينجيكشنز
- ضع مكبرة شعرية ألومينوسيليكات إلى ساحبة إبرة.
ملاحظة: إبرة جيدة أمر حاسم لنجاح فيتريبينيس أ حقن الأجنة. ينبغي أن يكون إبر الحقن حادة وغرامة-تلميح للسماح سهلة الاختراق من خلال المشيمة. أيضا يمكن أن تكون الإبر الشعرية الكوارتز والبورسليكات المستخدمة (الشكل 4). - تعيين الحرارة إلى 605، السرعة إلى 130، تأخير إلى 80، و سحب إلى 70، و الضغط من أجل 500 على ساحبة إبرة.
ملاحظة: يمكن رؤية إعدادات ساحبة إبرة إضافية لسحب الكوارتز والإبر البورسليكات في الجدول 1؛ قد تختلف المعلمات لجر مختلفة وخيوط. - تنشيط ساحبة إبرة لإنشاء الإبرة الصحيح. كرر حسب الحاجة لإنتاج الإبر متعددة.
ملاحظة: يمكن تخزين الإبر سحبت بوضعها في طبق بتري يحتوي على التوازي عدة لفات من طين التجارية التماثيل. - مجسم مشطوف الحواف نصيحة إبرة بلمس قليلاً في تلميح إلى لوحة كشط الماس حوالي 10 s عند 25 درجة مئوية (الشكل 2- ثالثا).
ملاحظة: إبر الحقن تستفيد من والنتؤات بتشجيع دخول الأجنة مع الحد الأدنى من الضرر بينما في الوقت نفسه تعزيز تدفق الحكام عن طريق الإبرة.
4-الجنين Microinjection
- إعداد حقن خليط يتكون من الكواشف تعديل الجينوم (مثلاً، ينقول + ترانسبوساسي مساعد، أو الكواشف كريبسر، إلخ.)، وتبقى على الجليد.
- تحميل إبرة حقن مع 2 ميليلتر من حقن الخليط باستخدام النصائح ميكرولوادير.
ملاحظة: الخليط حقن تظاهروا في البروتوكول يتكون من واحد-دليل الحمض النووي الريبي (سجرنا) (s) والمؤتلف Cas9 البروتين مختلطة في ح2o. - مكان الشريحة الزجاجية مع الأجنة واصطف على خشبة المسرح من المجهر المركب.
- عناية إدراج الإبرة في نهاية مؤخرة الجنين بزاوية عمودية من 25-35 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كان يتم حقن خليط الحقن أكثر من اللازم في الجنين قد انفجر تبديد السيتوبلازم من الجنين. بالإضافة إلى ذلك، شكل خاطئ مشطوف أو كسر الإبر مع كبير جداً من فتح أيضا قد يسبب تمزق الجنين.
- حاول إعادة الشطف الإبر في حالة انسداد يحدث. السيتوبلازم الأجنة فيتريبينيس أ عادي لزج ولزجة، مما يؤدي إلى كثرة إبرة انسداد (حقن 1/25).
ملاحظة: من المهم إبقاء الأجنة رطبة خلال فترة الحقن بانتظام إضافة الماء المتأين إلغاء استخدام في الرسام. كمية المياه على الفرشاة هو المفتاح لنقل الأجنة محاذاة مع سهولة. نتائج الكثير من المياه في أجنة المياه العائمة والقليل جداً يجعل من الصعب على التحرك. - حقن ~ 20-40 بيضة في كل مرة (وينبغي أن تأخذ حوالي 10 دقيقة)، ثم تتوقف. نقل البيض حقن مع الرسام رطب باستخفاف لمس البيض المحقون ووضعها في مجموعة. ثم يستمر الحقن مرة أخرى باستخدام طازجة حديثا وضعت دفعة بيض (> 1 ح القديمة).
ملاحظة: من الناحية المثالية هذا البروتوكول الأكثر فعالية إذا كان شخص واحد جمع بشكل مستمر ويصطفون البيض، بينما شخص آخر تعديل مكونات الجينوم بالحقن وزرع الأجنة حقن للمضيف الخوادر.
5-زرع الأجنة فيتريبينيس أ على "المضيف بريستونج" إينجيكتيد ز0
- بدقة مكان حقن الأجنة0 ز على اكتوى سابقا bullata س. الخوادر (الشكل 2- السادس) مع الرسام رطب بعد microinjection.
ملاحظة: سوف تعمل الخوادر المضيف يستخدم لجمع الأجنة ل microinjection لهذا الغرض. أيضا، على الرغم من بذل جهد كبير، يوجد حاليا لا يوجد نظام غذائي الاصطناعية المتاحة التي يمكن أن تستخدم22.- وضع الأجنة يصل إلى 40 حقنه واحدة في وقت واحد على مضيف واحد اكتوى مسبقاً لتجنب المنافسة الاكتظاظ واليرقات.
ملاحظة: حقن سوف تسبب ضررا على الأجنة؛ مهمل زرع الأجنة حقن إلى الخوادر المضيف قد ضغط المكون حقن أو صفار البيض خارجاً، ويؤدي إلى موت الأجنة.
- وضع الأجنة يصل إلى 40 حقنه واحدة في وقت واحد على مضيف واحد اكتوى مسبقاً لتجنب المنافسة الاكتظاظ واليرقات.
- ضع الخوادر المضيف إلى طبق بتري مع ورق الترشيح المبلل وكرات القطن، واحتضان لهم عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 70% تقريبا حتى حقن الأجنة هاتش (حوالي 1-2 أيام) (الشكل 2- سابعا).
ملاحظة: الأهم من ذلك، تستضيف يمكن ترك مع مقشرة قبالة بوباريوم أ. فيتريبينيس البيض وستضع عادة طالما أنها هي المحتضنة في دائرة هوميديفيد (طبق بيتري مع ورق الترشيح المبلل وكرات القطن) لمنع جفاف. حضانة في درجة حرارة الغرفة والرطوبة من كرات القطن المبلل غير كافية في حالة لا يمكن التحكم في الرطوبة. - نقل الخوادر المضيف إلى طبق بتري جديد في 25درجةمئوية والرطوبة 70% بعد ز0 الأجنة هاتش.
- رصد المضيف الخوادر وحقن اليرقات0 غ يوميا. إذا الخوادر المضيفة لها رائحة كريهة، نقل اليرقات حقن الخوادر المضيف صحية جديدة.
6-الكشف عن التعديلات الجينوم
- إزالة الخوادر فيتريبينيس أ كل من البلد المضيف باستخدام الرسام غرامة أو اختيار الأجنة. وينبغي أن بوبات اليرقات0 ز حقن حوالي 8 أيام بعد الحقن.
- ضع كل عذراء تمت إزالتها في قنينة زجاجية معزولة توصيله مع القطن والسماح لهم بالظهور كالبالغين0 ز، وضمان أن تكون الإناث مظلل العذراء الذي سيساعد مع الصلبان المتلقين للمعلومات الوراثية.
ملاحظة: يمكن فرز الإناث عن الذكور بطول الجناح: الإناث لها أجنحة أطول تمتد في الماضي الشخصية الجسم عند تشغيل على الجانب. جميع الخوادر الإناث ميكروينجيكتيد يمكن وضعها معا في قنينة توصيله، وينطبق نفس الشيء على الخوادر للذكور. - شاشة ز0 الأفراد، بعد اكلوسيون، أما بكر أو بصريا (إذا كان تعطيل جين المظهرية). على سبيل المثال، إذا تم استخدام كريسبر لإنشاء عمليات الحذف في جين معين والجينات تعطل يضفي النمط الظاهري مرئية، ثم فرز وإبقاء الأفراد مع نسخة متحولة من النمط الظاهري المتأثرة (الشكل 2- الثامن)21. إذا كان، مع ذلك، ترميز الجينات المتأثرة للنمط الظاهري غير مرئية، مثل متحولة من الجينات الأساسية، تنفيذ نظام عبور (عبر ز0 الذكور مع الإناث نوع البرية، أو عبر ز0 أنثى مع ذكر نوع البرية) استرداد والحصول على الشاشة طفرات الموروثة عن طريق المعايرة الفتك أو العقم.
ملاحظة: شبيه ميلانوجاستير دال، البالغين فيتريبينيس أ يمكن أن تكون معطلة بالتعرض إلى CO2 السماح للتلاعب واضحة. وعلاوة على ذلك، الإناث المجنحات ستؤدي إلى 100% فرداني broods الذكور، ولذلك أنثى المجنحات المسخ يمكن أن تؤدي إلى عدد كبير من الذكور المسخ التي يمكن استخدامها لتحليل اللاحقة.
ملاحظة: سوف تحتاج إلى الطفرات في الجينات الأساسية الاحتفاظ بالتزاوج الباقين على قيد الحياة ز0 حقن الإناث (يفترض أن متخالف لطفرة) إلى نوع البرية الذكور؛ في هذه الحالة بالذات، نصف ذرية الذكور1 ز يجب أن يموتون بسبب ميراث الطفرات المميتة، بينما نصف1 ز ذرية الإناث سوف تكون حاملة لقاتله. - التهجين ز0 الكبار والشاشة ز1 ذرية للتحوير عمليات الإدراج باستخدام علامات ترانسجينيسيس إذا كان الهدف ترانسجينيسيس. حاليا لا يزال ترانسجينيسيس ثبت في فيتريبينيس أ.
Representative Results
هذا البروتوكول يوفر مبادئ توجيهية مفصلة لتربية مستعمرة، وجمع الجنين بلاستوديرم قبل والمحاذاة، microinjection وزرع اللاحقة بعد الحقن ويمكن استخدامها لهندسة الجينوم الكفاءة في فيتريبينيس أ. كما هو مبين في الشكل 2، تشمل التسلسل العام لخطوات microinjection ناجح في فيتريبينيس أ : (ط) السماح للبالغين الذكور والإناث رفيقه (~ 4 أيام)، (ثانيا) تزويد المضيف الطازجة يطير الخوادر (س. بلاطة) وضعت في التوصيل الرغاوي المعدلة لتفعيل الإناث والسماح أوفيبوسيتيون (~ 45 دقيقة)، (ثالثا) تقشير بعيداً بعناية بشرة الخوادر المضيف الطفيل فضح وجمع الأجنة دبور بلاستوديرم قبل مرحلة (~ 15 دقيقة)، (رابعا) مواءمة جمع الأجنة (~ 15 دقيقة)، (v) ميكروينجيكتينج الجينوم تعديل المكونات في الأجنة (~ 15 دقيقة)، (سادسا) بعناية وضع حقن الأجنة بالعودة إلى مضيفي اكتوى قبل السماح للتنمية السليمة (~ 15 دقيقة)، و (السابع) منع التجفاف حقن الأجنة/المضيفة عن طريق نقل منهم إلى غرفة هوميديفيد مع ما يقرب من 70% رطوبة نسبية (~ 15 دقيقة). ثم هي المحتضنة تستضيف الطفيل لمدة 14 يوما تقريبا للسماح باستكمال تطوير الأجنة فيتريبينيس أ . بمجرد حقنها، الكبار الخروج من البلد المضيف (الثامن) وعزل ورفيقه والشاشة منهم على حدة لوجود الطفرات المتوقعة.
لاختراق الإبرة الفعال و microinjection في الأجنة فيتريبينيس أ ، يتم اختبار عدة أنواع من الإبر الزجاجية الشعرية مع الشعيرة بما في ذلك أنواع الكوارتز والومينوسيليكات البورسليكات. أنها وجدت أن نوعية الإبرة أمر حاسم لتجنب الكسر/انسداد أثناء الحقن، وتحقيق معدلات عالية من كلا الجنين البقاء على قيد الحياة والتحول الكفاءة. لكل نوع من أنواع الزجاج، تم وضع بروتوكول فعال لسحب الإبر كي يكون المطلوب مثل إبر طويلة تلميح فعالة ل microinjection الجنين فيتريبينيس أ جر ميكروبيبيتي مختلفة (P-1000 و P-2000) باستخدام (الجدول 1 ، الشكل 4).
لتحسين الإجراءات، يتم قياس معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الحقن بكميات متفاوتة من مكونات تعديل الجينوم. وكانت العناصر تعديل الجينوم المستخدمة هنا مختلطة دليل الكشف والبروتين Cas9 للجينوم بوساطة كريسبر التحرير، التي أظهرت سابقا للعمل جيدا في فيتريبينيس أ.21. وأفادت مشابهة لما كان في السابق، هنا سجرنا استهداف الجين cinnabar تم تصميمه وتصنيعه. باستهداف ويعطل هذا الجين، يعتبر إجراء تغيير المظهرية التعرف عليها بسهولة في لون العين الكائن الحي19،21. أن حقن خليط يجمع بين مجموعة متنوعة من تركيزات سجرنا (0، 20، 40، 80، 160 و 320 نانوغرام/ميليلتر) مع البروتين Cas9 (0، 20، 40، 80، 160 و 320 نانوغرام/ميليلتر) تم إنشاؤها ويتم حقن أجنة نوع البرية فيتريبينيس أ. معدل البقاء على قيد الحياة من حقن الأجنة وجد أن تعتمد على الجرعة (الجدول 2)21. زيادة تركيز سجرنا و Cas9 البروتين تؤدي إلى بقاء انخفاض معدلات (الجدول 2)، ربما بسبب الآثار المضافة خارج الهدف. الرطوبة العالية (~ 70 في المائة) يوجد أيضا مهمة لبقاء الجنين بعد الزرع للمضيفين، كانخفاض الرطوبة (~ 10%) أسفرت عن وفاة 100% لجميع حقن الأجنة.
الشكل 1 . إعداد المضيف الخوادر (S. بلاطة) فيتريبينيس أ. الجنين أوفيبوسيشن. (A) الشباب والقديمة بلاطة س. الخوادر. لدى الخوادر لكبار السن بشرة داكنة بينما الخوادر الأصغر لها صبغة أكثر محمر لبشرة بهم. الخوادر الأصغر المفضلة لتحقيق أقصى قدر من أوفيبوسيشن. يمكن أيضا تمييز نهايات الأمامي والخلفي الخوادر "حفرة تشبه فتح في النهاية الخلفية، حين تأتي النهاية الأمامية إلى نقطة دائرية. (ب) إعداد عذراء المضيف (س. بلاطة) للجنين فيتريبينيس أ. أوفيبوسيشن. إدراج الخوادر المضيف في المكونات الرغوية التي تعين الخوادر الحجم منحوتة من ثقب. يكون على الجانب الخلفي من الوجه الخوادر المضيف داخل المكونات بينما تعرض 0.2 سم النهاية الأمامية للسماح بتركيز أوفيبوسيشن في المنطقة الأمامية بحد أقصى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . الجدول الزمني لإنشاء فيتريبينيس أ طفرات من microinjection. التسلسل الزمني لجمع الجنين فيتريبينيس أ ، microinjection كريسبر/Cas9 وإجراءات ما بعد الحقن. الكبار فيتريبينيس أ سمح لرفيقه في غياب موقع أوفيبوسيتيون لمدة 4 أيام (أنا). عقب، عرض طازجة، ذبابة اللحم مضيف الخوادر، س. بولاتا، وضعت داخل سداده رغوة فيما يتعلق بفضح فقط 0.5 سم الجهة الخلفية، للإناث جرافيد لمدة 45 دقيقة للسماح باراسيتيزيشن (ثانيا). وفي الوقت نفسه أعدت مواد الحقن، بما في ذلك الإبر microinjection ومكونات كريسبر/Cas9 (ثالثا). الأجنة التي تم جمعها من المضيف (رابعا)، والانحياز (v)، وحقن مع مكونات كريسبر/Cas9 (سادسا). حقن الأجنة بعناية تحويلها مرة أخرى إلى مضيف قبل اكتوى (السابع) والمحتضنة حتى نمواً كاملا (14 يوما) (ثامنا). عندما ظهرت الكبار، تم فحص طفرات لتعمل من المتوقع كريسبر/Cas9 الناجم عن الطفرات في الجينات المستهدفة (تاسعا). يأخذ الإجراء بأكمله عموما 19 يوما لإكمال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . شريحة مجهر معدلة لبطانة الأجنة. (A) A ساترة. (ب) المجهر الشريحة. (ج) جهاز محاذاة جنين.يمكنك لصقها ساترة إلى شريحة مجهر ستستخدم للأجنة خط للحقن. والغرض من ساترة بمثابة ميزة للسماح للتلاعب السهل وبطانة من الأجنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . إعداد إبرة حقن. (أ) أمثلة للابر الزجاج ألومينوسيليكات الجيدة والسيئة. (ب) النصائح من إبرة مشطوف أونبيفيليد ومشطوف الحواف بشكل صحيح، وسيئة. تم انتشال ألومينوسيليكات أنابيب شعرية زجاجية باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي. نصائح إبرة المنتجة ثم فتحت بلطف والمكررة باستخدام بيفيلير. إبرة مشطوف جيدة تلميح حادة جداً، والإبرة مشطوف سيئة تلميح غير حادة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| نوع الزجاج الشعرية | سوتير إبرة ساحبة النموذجي | الحرارة | خيوط | السرعة | تأخير | سحب | الضغط |
| مرو | P-2000 | 750 | 4 | 40 | 150 | 165 | - |
| ألومينوسيليكات | P-1000 | 605 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
| البورسليكات | P-1000 | 450 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
الجدول 1. إعدادات ساحبة الإبرة.
ملاحظة: الإعداد ساحبة إبرة تختلف من الجهاز إلى الجهاز حيث سيقوم كل مختبر بحاجة إلى تحسين إعدادات ساحبة إبرة الخاصة بهم. وقد تم تعديل هذا الجدول من لي et al. 21
| سجرنا-1 | Cas9 | مجموع الأجنة | زرع (10% رطوبة) | زرع (70% رطوبة) | |||
| الناجين من اليرقات | الناجين من اليرقات | الكبار الباقين على قيد الحياة | |||||
| الإجمالي (%) | الإجمالي (%) | ♂ | ♀ | الإجمالي (%) | |||
| لا يوجد حقن | لا يوجد حقن | 100 | 94 (94) | 96 (96) | 66 | 26 | 92 (92) |
| المياه | المياه | 100 | 0 (0) | 78 (78) | 44 | 32 | 76 (76) |
| 20 نانوغرام/ميليلتر | 20 نانوغرام/ميليلتر | 100 | 0 (0) | 74 (74) | 34 | 34 | 68 (68) |
| 40 نانوغرام/ميليلتر | 40 نانوغرام/ميليلتر | 100 | 0 (0) | 67 (67) | 30 | 32 | 62 (62) |
| 80 نانوغرام/ميليلتر | 80 نانوغرام/ميليلتر | 100 | 0 (0) | 53 (53) | 24 | 22 | 46 (46) |
| 160 ng/ميليلتر | 160 ng/ميليلتر | 100 | 0 (0) | 41 (41) | 16 | 22 | 38 (38) |
| 320 نانوغرام/ميليلتر | 320 نانوغرام/ميليلتر | 100 | 0 (0) | 25 (25) | 10 | 10 | 20 (20) |
الجدول 2. الحقن وزرع حالة البقاء على الحياة، والطفرات معدلات استناداً إلى حقن تركيزات مختلفة من سجرنا و Cas9. وقد تم تعديل هذا الجدول من لي et al. 21
Discussion
تسلسل الجينوم فيتريبينيس أ الأخيرة قد أطلقت العنان ضرورة هامة للأدوات الجزيئية لتوصيف وظيفيا الجينات غير معروف داخل هذه الأنواع23. النظام كريسبر-Cas9، والعديد من الجينات تحرير أدوات أخرى، ثبت أن تكون مفيدة في التحقيق في وظائف الجينات لعدد من الكائنات الحية24. ومع ذلك، تتطلب هذه الأدوات تولد الطفرات الموروثة، أداء ميكروينجيكشنز الجنين. ولذلك، أظهرت هنا هي تقنية بصرية مفصلة تتضمن عددا من الابتكارات التي تسمح بكفاءة فيتريبينيس أ. ميكروينجيكشنز الجنين.
عموما، هذا الأسلوب مفصلة يوفر عددا من الابتكارات الهامة، فيما يتعلق ب الأساليب الحالية23، التي تسمح بكفاءة فيتريبينيس أ. ميكروينجيكشنز الجنين. على سبيل المثال، إنشاء أداة أوفيبوسيتيون (رغوة سداده) لتيسير جمع السريع للأجنة، وتستخدم لتقييد زرع تماما إلى نهاية الخلفي للمضيف (الشكل 1)، والذي يسهل إلى حد كبير جمع العديد من الأجنة داخل البيض فترة قصيرة من الزمن. أيضا تحسين تقنيات تربية مستعمرات دبور بإعداد كبيرة لجمع أكبر عدد من البيض وتعريفها. بالإضافة إلى ذلك، للتعجيل بمحاذاة الجنين، هو تطوير جهاز محاذاة جنين الذي يسمح للأجنة ليكون الانحياز بكفاءة وحقن دون الحاجة إلى استخدام الأشرطة اللاصقة على الوجهين لتأمين الأجنة في مكان (الشكل 3).
وعلاوة على ذلك، وجد أن حفظ الأجنة رطبة بالماء أثناء الحقن ولا ديسيككاتينج الأجنة أو تغطيتها بالنفط تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة. بالإضافة إلى ذلك، يتم اختبار العديد من أنواع الزجاج الشعرية ويتم تحديد معلمات لتشييد الإبر مثالية ل microinjection أ. فيتريبينيس (الجدول 1، الرقم 4). وعلاوة على ذلك، وضعت التالية microinjection، بقاء الجنين معدلات قادرون على زيادة كبيرة بسبب حضانة البيض المحقون في اكتوى قبل المضيفين في الدوائر العليا-الرطوبة (70 في المائة). تسمح هذه الابتكارات لإجراء microinjection أكثر تبسيطا والناجح فيتريبينيس أ.
يمكن جعل تعديلات طفيفة فيما يتعلق بأجهزة الحقن، وتربية إجراءات هذا البروتوكول، وفقا لتفضيلات المستخدم. بيد أن عددا من الخطوات الحاسمة سيكون أساسيا لنجاح توليد طفرات في فيتريبينيس أ.. على سبيل المثال، تعمل بسرعة حتى يتم حقن الأجنة > القديمة ح 1، وضمان أن الحقن بالإبر حادة بما يكفي للتقليل من الضرر الذي يلحق الجنين على حد سواء سيكون أساسيا. بينما هذا البروتوكول يجب أن تكون فعالة لتوليد الطفرات في جينات كثيرة (أن لم يكن كلها)، هو القيد الرئيسي واحد شرط كريبسر/Cas9 لاستهداف تسلسل "بام" (نج) التي ستحدد تسلسل الهدف.
وفي الختام، يمكن استخدام هذه التقنية المحسنة إنشاء أنواع عديدة من التعديلات الجينوم، مثل الطفرات، الحذف، وربما حتى الملاحق استخدام التكنولوجيات Cas9 كريبسر/21، أو التحوير حتى الملاحق لتوليد المحورة وراثيا أ. فيتريبينيس، التي ينبغي أن تعجل إلى حد كبير البحوث الفنية في هذا الحي.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل جامعة كاليفورنيا سخية، مختبر (ريفرسايد) بدء الصندوق إلى O.S.A، معهد الأغذية الوطنية وزارة الزراعة والمشروع هاتش الزراعة (NIFA) (1009509) إلى O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
