Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.
Mücevher wasp Nasonia vitripennis seks belirlenmesi, haplo-diploid seks belirlenmesi, zehir sentezi ve ana bilgisayar-konukçunun etkileşimleri, diğerleri arasında gibi işlemlerin incelenmesi için bir etkili model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Bu organizma ile çalışmanın önemli bir sınırlama yönlendirilmiş genom değişiklikler gerçekleştirmek için etkili iletişim kurallarının olmaması. Reaktifler, CRISPR/Cas9 molekülleri, embriyo mikroenjeksiyon aracılığıyla da dahil düzenleme teslimat genom değişiklik önemli bir parçası olur. Mikroenjeksiyon birçok canlılar arasında iyi kurulmuş olsa da, bu teknik i. vitripennis içinde öncelikle küçük embriyo boyutuna ve embriyonik gelişme tamamen içinde oluşur gerçeği nedeniyle gerçekleştirmek için özellikle zor bir parasitized sineği pupa. Aşağıdaki yordamı bu önemli sorunlar süre etkili wasp embriyo kaldırmak için akıcı, görsel bir yordam gösteren parasitized ana bilgisayar pupa, onları, microinjecting ve dikkatle onları Dikim geri ev sahibi üstesinden gelir Devamı ve geliştirme tamamlanması için. Bu iletişim kuralı güçlü gelişmiş genom değişiklikler bu organizma olarak gerçekleştirmek için araştırma grupları yeteneğini artıracaktır.
Mücevher eşek arısı, N. vitripennis, cins Nasonia içinde ectoparasitoids Sarcophaga bullata1gibi sinekler yeme et olan dört türlerinden biridir. Hızlı kuşak dönemleri, laboratuvar ve biyolojik özellikleri, benzersiz ve önemli bir dizi yetiştirme kolaylığı nedeniyle i. vitripennis geleneksel canlılar arasında bulunan birden çok deneysel araçları geliştirilmesi için bir odak noktası olmuştur . Örneğin, bazı benzersiz biyolojik öznitelikler haplo-diploid üreme sistemi2, mikrobiyal ve genetik parazitler3,4ile bir ilişki ve bir supernumary (B) kromozom5,6 içerir ,7. Birlikte ele alındığında, bu zehir üretim8, dahil olmak üzere ek olarak bu işlemlerin moleküler ve hücresel yönlerini elucidating amaçlayan deneyler için önemli bir deneysel sistem i. vitripennis olun 9, cinsiyet belirlenmesi10,11ve evrim ve gelişme ekseni Desen oluşumu12,13,14. Ayrıca, NBiyoloji çalışmaya genetik araç seti. vitripennis son on yıl içinde önemli ölçüde artmıştır ya da çok, bir yüksek çözünürlüklü genom15sıralama ile çeşitli gen ekspresyonu16,17,18, çalışmalar ve yetenek işlevsel RNA müdahale (RNAi)19,20, hangi birlikte tractability ve ters genetik bu organizmada performans yetenekleri gelişmiş güvenerek gen ekspresyonu bozmaya.
Birçok önemli bilimsel gelişmeler ve bu canlı genişletilmiş araci rağmen mevcut bilgi aynı derecede-in tek bir grup başarıyla embriyonik microinjections kalıtsal genom değişiklikler21oluşturmak için sahne aldı. Onlar oldukça kırılgan ve küçük, Drosophila melanogaster embriyolar, onları işlemek genellikle zor hale boyutunu ~2/3 varlık olarak i. vitripennis embriyo ile çalışmanın zorlukları nedeniyle öncelikle bu. Ayrıca, i. vitripennis dişiler yumurtalarını embriyogenez, larva, Pupa geliştirme tamamı içinde oluştuğu önceden stung sineği pupa Kasası. Bu nedenle, başarılı microinjections, ön blastoderm sahne, embriyo ana bilgisayar pupa, hızlı bir şekilde microinjected ve hemen geri onların ana bilgisayarlar için geliştirme içine nakledilen üzerinden verimli bir şekilde toplanması gerekir. Aşağıdaki adımları hassas ve microinjected embriyo veya son derece zorlu tekniği yapım pupa ana zarar görmesini önlemek için el becerisi gerektirir. Rağmen i. vitripennis embriyo mikroenjeksiyon22açıklayan bir on yıl kadar önce yayınlanan bir kısa protokol vardır. Ancak, bu yordam için taze koydu embriyo kurumuş gerekir, yumurtaların mikroenjeksiyon için çapa için yapışkan bant kullanır ve bir görsel gösteri tekniği içermez. Bu nedenle, burada açıklanan geliştirilmiş adım adım iletişim kuralı kalıtsal genom oluşturmak için temel herhangi bir laboratuar tarafından takip edilebilir i. vitripennis embriyo microinjections için ayrıntılı bir görsel yordam da dahil olmak üzere bir güncelleştirilmiş ve gözden geçirilmiş protokoldür Bu önemli model böcek olarak değişiklikleri.
İ. vitripennis genom son sıralama işlevsel olarak bu tür23bilinmeyen genlerde karakterize etmek moleküler araçlar için önemli bir ihtiyaç unleashed vardır. CRISPR-Cas9 sistemi ve birçok diğer gen düzenleme araçları, gen fonksiyonları bir dizi organizmalar24için soruşturma değerli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, kalıtsal mutasyonları üretmek için bu araçlar embriyo microinjections performans gerektirir. Bu nedenle, burada izin vermek için verimli yenilikleri bir dizi içeren bir tekniktir detaylı görsel gösterdi i. vitripennis embriyo microinjections.
Genel olarak, bu ayrıntılı teknik sunar mevcut yöntemleri23, ile ilgili önemli yenilikler bir dizi izin veren için verimli i. vitripennis embriyo microinjections. Örneğin, embriyo hızlı toplama kolaylaştırmak için bir oviposition aracı (köpük tıpa) oluşturulur ve büyük ölçüde kolaylaştıran çok sayıda embriyo içinde topluluğu olan ana bilgisayarı (şekil 1), arka sonuna tamamen döşeme yumurta sınırlandırmak için kullanılır kısa bir süre. Yaban arısı kolonileri daha fazla sayıda yumurta toplamak için büyük sayılarla yetiştirme teknikleri de tanımlanan ve geliştirilmiş. Ayrıca, embriyo hizalama hızlandırmak için etkili bir şekilde hizalanmış ve embriyo yerde (şekil 3) güvenlik altına almak için çift taraflı yapışkan bant kullanmak zorunda kalmadan enjekte embriyolar için izin veren bir embriyo hizalama cihazı geliştirdi.
Ayrıca, bu embriyolar su ile nemli enjeksiyon ve embriyoların kurutulan ya da onları yağla kapsayan sırasında tutarak sağkalım oranları gelişmiş bulunur. Ayrıca, kapiller cam çeşitli test ve mükemmel iğneler i. vitripennis mikroenjeksiyon (Tablo 1, şekil 4) için oluşturmak için parametreleri belirlenir. Ayrıca, aşağıdaki mikroenjeksiyon, embriyo hayatta kalma oranları önemli ölçüde önceden stung ana enjekte yumurta kuluçka nedeniyle artış edebiliyoruz yüksek oranda nem içeren (% 70) odasında yerleştirilir. Bu yenilikler için bir daha akıcı ve başarılı mikroenjeksiyon yordam i. vitripennisiçin izin.
Enjeksiyon aparatı ve yordamlar yetiştirme açısından küçük değişiklikler bu iletişim kuralı, kullanıcı tercihlerine bağlı olarak yapılabilir. Ancak, bir dizi kritik adım mutantlar i. vitripennisiçinde başarıyla oluşturmak için gerekli olacak. Enjekte embriyo vardır örneğin, hızlı bir şekilde çalışmaya > 1 s eski ve enjeksiyon iğneler embriyo zarar en aza indirmek keskin sağlanması hem de olacak gerekli. Bu iletişim kuralı (hepsi değilse de) birçok genlerinde mutasyon için etkili gerekirken, bir büyük hedef sıra dikte edecek bir PAM (NGG) sürecini hedef için CRIPSR/Cas9 gereksinimi kısıtlamadır.
Sonuç olarak, bu gelişmiş teknik birçok türde mutasyonlar, silme gibi genom değişiklikleri oluşturmak ve transgenik oluşturmak için CRIPSR/Cas9 teknolojileri21veya hatta transgene eklemeleri kullanarak eklemeler hatta için kullanılabilir Hangi büyük ölçüde bu organizmanın fonksiyonel araştırma hızlandırmak i. vitripennis.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser bir cömert University of California, Riverside (UCR) laboratuvar start-up fon O.S.A, USDA Ulusal Enstitüsü gıda ve Tarım (NIFA) kapak projesine O.S.A. (1009509) tarafından desteklenmiştir
Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |