Microinjection av Nasonia vitripennis embryo er en viktig metode for å generere arvelige genom endringene. Beskrevet her er en detaljert prosedyre for microinjection og transplantasjon av Nasonia vitripennis embryoer, som vil forenkle fremtidige genomet manipulasjon i denne organismen.
Juvelen veps Nasonia vitripennis har dukket opp som en effektiv modellsystem for studiet av prosesser inkludert kjønn målbevisstheten, haplo-diploide kjønn målbevisstheten, gift syntese og vert-symbiont vekselsvirkningene, blant andre. En stor begrensning av arbeider med denne organismen er mangel på effektiv protokoller utføre regissert genom endringene. En viktig del av genomet modifisering er redigering reagenser, inkludert CRISPR/Cas9 molekyler, i embryo gjennom microinjection. Mens microinjection er godt etablert i mange modell organismer, denne teknikken er spesielt utfordrende å utføre i N. vitripennis hovedsakelig på grunn av liten embryoet størrelsen, og det faktum at embryonale utvikling skjer utelukkende innenfor en parasitter larvestadiene puppe. Følgende overvinner disse betydelige utfordringer mens demonstrere en strømlinjeformet, og prosedyre for å effektivt fjerne veps embryoer fra parasitter vert pupae, microinjecting dem, og nøye transplanting dem tilbake til verten for videreføring og gjennomføring av utvikling. Denne protokollen vil sterkt forbedre evnen til forskning holdene å utføre avanserte genom endringene i denne organismen.
Juvelen veps, N. vitripennis, er en av fire arter i slekten Nasonia som er ectoparasitoids av kjøtt spiser fluer som Sarcophaga bullata1. På grunn av deres raske generasjonene perioder, enkel oppdrett i laboratoriet, og et utvalg av unike og viktige biologiske attributter, har N. vitripennis vært et fokus for utvikling av flere eksperimentelle verktøy som finnes i tradisjonelle modellen organismer . For eksempel inkluderer noen unike biologiske egenskaper en haplo-diploide reproduksjon system2, et forhold til mikrobiologiske og genetiske parasitter3,4og supernumary (B) kromosom5,6 ,7. Sammen gjør disse N. vitripennis en betydelig eksperimentelle system for eksperimenter sikte på Klargjørende de molekylære og mobilnettet aspektene av disse prosessene, i tillegg til andre inkludert gift produksjon8, 9, sex besluttsomhet10,11, og evolusjon og utvikling av aksen mønsteret formasjon12,13,14. Videre genetisk verktøysettet å studere biologi av N. vitripennis har dramatisk økt det siste tiåret eller så, med sekvensering av en høyoppløselig genomet15, flere genuttrykk studerer16,17,18, og muligheten til å avbryte funksjonelt genuttrykk avhengig RNA-interferens (RNAi)19,20, som sammen har forbedret tractability og evner til å utføre omvendt genetikk i denne organismen.
Til tross for de mange viktige vitenskapelige fremskritt og utvidet verktøy i denne organismen, i dagens kunnskap har bare én gruppe gjennomført embryonale microinjections å generere arvelige genom endringene21. Dette er hovedsakelig på grunn av vanskelighetene med å arbeide med embryoene til N. vitripennis som de er ganske skjør og små, blir ~2/3 størrelsen på Drosophila melanogaster embryoer, noe som gjør dem generelt vanskelig å manipulere. I tillegg innskudd N. vitripennis kvinner eggene til pre stukket larvestadiene pupae, som hele embryogenesis, larver, og pupal utvikling skjer. Derfor for vellykket microinjections, før blastoderm scenen, må embryo effektivt samles fra verten pupae, raskt microinjected og umiddelbart transplantert tilbake til sine verter for utvikling. Denne fremgangsmåten krever presisjon og behendighet å unngå skade på microinjected embryoer, eller pupal vertene, gjør teknikken svært utfordrende. Uansett, det er en kort protokoll publisert over et tiår siden som beskriver N. vitripennis fosteret microinjection22. Men denne fremgangsmåten krever at de nylig lagt embryoene være desiccated, bruker selvklebende tape for å forankre egg for microinjection, og inkluderer ikke en visuell demonstrasjon av teknikken. Derfor beskrevet her er en oppdatert og revidert protokollen, inkludert en visuell prosedyre, detaljering en forbedret trinnvise protokoll for N. vitripennis fosteret microinjections som kan følges av alle grunnleggende lab å generere arvelige genom endringer i denne viktig modell insekt.
Den siste sekvensering av N. vitripennis genomet har utløst et viktig behov for molekylære verktøy å funksjonelt karakterisere ukjent gener innenfor denne arter23. CRISPR-Cas9 systemet, og mange andre gene redigeringsverktøy, har vist seg for å være verdifulle i gransker genet funksjoner for en rekke organismer24. Vil generere arvelige mutasjoner, krever imidlertid disse verktøyene utfører fosteret microinjections. Derfor vist her er en detaljert visuell teknikk som inkluderer en rekke innovasjoner som tillater effektiv N. vitripennis fosteret microinjections.
Samlet denne detaljerte teknikken tilbyr en rekke viktige nyvinninger, med hensyn til eksisterende metoder23, som gir mulighet for effektiv N. vitripennis fosteret microinjections. For eksempel for å lette rask innsamling av embryo, en oviposition verktøyet (skum disables) opprettes og brukes til å begrense egglegging helt til den bakre enden av verten (figur 1), som sterkt forenkler samling av mange embryoer innen en kort periode. Teknikker for oppdrett veps kolonier med store tall å samle større antall egg er også forbedret og definert. I tillegg for å akselerere embryoet justering, er et embryo innretting enheten som tillater embryo effektivt justert og injisert uten å bruke dobbeltsidig selvklebende tape for å sikre embryoene på plass (Figur 3) utviklet.
Videre er det funnet at ved å holde embryoene fuktig med vann under injeksjon og ikke desiccating embryoene eller dekke dem med olje bedre overlevelse. I tillegg flere kapillær glasstypene er testet og parameterne for å sette de perfekte pinnene for N. vitripennis microinjection (tabell 1, Figur 4) bestemmes. Videre følgende microinjection, fosteret overlevelse priser er betydelig øke på grunn av rugende injisert egg i pre stukket verter plassert i svært høy luftfuktighet (70%) kamre. Disse nyvinningene gir en mer strømlinjeformet og vellykket microinjection prosedyre for N. vitripennis.
Mindre endringer injeksjon apparater samt rearing prosedyrer kan gjøres til denne protokollen, avhengig av brukerens preferanser. Men vil en rekke viktige trinn være avgjørende for å kunne generere mutanter i N. vitripennis. For eksempel arbeider raskt slik at injisert embryo > 1 h gamle, og at injeksjon nåler er skarpe nok til å minimere fosteret vil begge være avgjørende. Mens denne protokollen skal være effektive for å generere mutasjoner i mange (hvis ikke alle) gener, er ettall større begrensningen CRIPSR/Cas9 behovet å målrette en PAM (NGG)-sekvens som vil diktere målet sekvensen.
Avslutningsvis kan denne forbedret teknikken brukes til å generere mange typer Genova endringer, for eksempel mutasjoner, slettinger og muligens også innsettinger bruker CRIPSR/Cas9 teknologier21eller selv transgene innsettinger for å generere transgene N. vitripennis, som bør sterkt akselerere funksjonelle forskning i denne organismen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en sjenerøs University of California, Riverside (UCR) laboratorium oppstart fondet O.S.A, USDA National Institute of Food og landbruk (NIFA) Luke project (1009509) O.S.A.
Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |