Microiniezione di embrioni Nasonia vitripennis è un metodo essenziale per la generazione di modifiche del genoma ereditabile. Una procedura dettagliata per microiniezione e il trapianto di embrioni Nasonia vitripennis , che agevolerà notevolmente la manipolazione del genoma futuri in questo organismo è descritto qui.
La Vespa gioiello Nasonia vitripennis è emerso come un sistema efficace modello per lo studio dei processi tra cui la determinazione del sesso, determinazione del sesso aplo-diploide, sintesi di veleno e interazioni ospite-simbionte, tra gli altri. Una limitazione importante di lavorare con questo organismo è la mancanza di efficaci protocolli per eseguire le modifiche dirette del genoma. Una parte importante della modificazione del genoma è consegna di reagenti, tra cui molecole CRISPR/Cas9, negli embrioni attraverso microiniezioni di editing. Mentre microiniezione è ben consolidata in molti organismi di modello, questa tecnica è particolarmente difficile da eseguire in N. vitripennis principalmente a causa della sua dimensione di piccolo embrione e il fatto che lo sviluppo embrionale avviene interamente all’interno un pupa blowfly parassitati. La procedura seguente supera queste sfide significative mentre dimostrando una procedura snella, visual per rimuovere efficacemente gli embrioni della Vespa da parassitato pupe host, microinjecting li, e attentamente trapianto loro nuovamente dentro l’host per la continuazione e il completamento dello sviluppo. Questo protocollo aumenterà fortemente la capacità dei gruppi di ricerca di eseguire modifiche avanzate genoma in questo organismo.
La Vespa di gioiello, N. vitripennis, è una delle quattro specie del genere Nasonia che sono ectoparasitoids di carne mangiare mosche come Sarcophaga bullata1. A causa di loro periodi veloce-generazionale, facilità di allevamento in laboratorio e una gamma di attributi biologici unici e importante, N. vitripennis è stato un punto focale per lo sviluppo di molteplici strumenti sperimentali trovati in organismi modello tradizionale . Ad esempio, alcuni attributi biologici unici includono un sistema di riproduzione aplo-diploide2, una relazione con parassiti microbici e genetica3,4e un sovrannumero (B) del cromosoma5,6 ,7. Presi insieme, questi fanno N. vitripennis un importante sistema sperimentale per esperimenti volti a chiarire gli aspetti molecolari e cellulari di questi processi, oltre ad altri tra cui veleno produzione8, 9, sesso determinazione10,11ed evoluzione e sviluppo di asse modello formazione12,13,14. Inoltre, il toolkit genetico per studiare la biologia di N. vitripennis è aumentato drammaticamente negli ultimi dieci anni o così, con il sequenziamento di un genoma ad alta risoluzione15, espressione genica diversi studi16,17,18e il capacità di interferire funzionalmente basandosi su RNA interference (RNAi)19,20, che insieme hanno migliorato la trattabilità e la capacità di eseguire genetica inversa in questo organismo l’espressione genica.
Nonostante i molti importanti progressi scientifici e Toolkit espansa in questo organismo, a partire da conoscenze attuali solo un gruppo ha eseguito correttamente embrionali microiniezioni per generare ereditabile genoma modifiche21. Ciò è principalmente dovuto la difficoltà di operare con embrioni di N. vitripennis in quanto sono piuttosto fragile e piccola, essendo ~2/3 le dimensioni degli embrioni di Drosophila melanogaster , che li rende generalmente difficili da manipolare. Inoltre, N. vitripennis femmine depositano le loro uova in pupe blowfly pre-stung, all’interno del quale si verifica l’interezza dell’embriogenesi, larvale e sviluppo pupa. Pertanto, per successo microiniezioni, fase di pre-blastoderm, devono essere raccolti in modo efficiente il embrioni, da pupe host, microiniettati rapidamente e immediatamente trapiantato nel loro padroni di casa per lo sviluppo. Questi passaggi richiedono precisione e destrezza per evitare di danneggiare gli embrioni iniettati o i padroni di casa pupal, rendendo la tecnica estremamente impegnativo. Nonostante, c’è un protocollo a breve pubblicato oltre un decennio fa che descrive vitripennis N. embrione microiniezione22. Tuttavia, questa procedura richiede che gli embrioni appena deposte essere essiccata, usa il nastro adesivo per ancorare le uova per il microinjection e non include una dimostrazione visiva della tecnica. Pertanto, è descritto qui un protocollo aggiornato e riveduto, compresa una procedura visual, dettagliare un protocollo migliorato passo dopo passo per microiniezioni di embrione N. vitripennis che può essere seguito da qualsiasi base del laboratorio per generare ereditabile genoma modifiche a questo insetto importante modello.
Il recente sequenziamento del genoma di N. vitripennis ha scatenato un bisogno importante per strumenti molecolari per la caratterizzazione funzionale di geni sconosciuto all’interno di questa specie23. Il sistema di CRISPR-Cas9 e molti altri strumenti di editing gene, hanno dimostrato di essere utile per indagare le funzioni del gene per un certo numero di organismi24. Tuttavia, per generare mutazioni ereditabili, questi strumenti richiedono prestazioni microiniezioni di embrione. Pertanto, dimostrato qui è una tecnica visiva dettagliata che include una serie di innovazioni che consentono di efficiente microiniezioni embrione N. vitripennis .
Nel complesso, questa tecnica dettagliata offre una serie di innovazioni significative, rispetto alle attuali metodi23, che consentano di efficiente microiniezioni embrione N. vitripennis . Ad esempio, per facilitare la rapida raccolta degli embrioni, uno strumento di deposizione delle uova (tappo di gomma piuma) è creato e utilizzato per limitare la deposizione interamente all’estremità posteriore dell’host (Figura 1), che facilita notevolmente la raccolta di numerosi embrioni all’interno delle uova un breve periodo di tempo. Tecniche per l’allevamento di colonie di Vespa con un gran numero di raccogliere un numero maggiore di uova sono anche migliorati e definiti. Inoltre, per accelerare l’allineamento dell’embrione, è sviluppato un dispositivo di allineamento di embrione che consente per gli embrioni di essere allineati in modo efficiente e iniettato senza dover utilizzare nastro adesivo su due lati per proteggere gli embrioni in posizione (Figura 3).
Inoltre, si è accertato che mantenendo gli embrioni umido con acqua durante l’iniezione e non essiccare gli embrioni o coprendole con olio migliorato i tassi di sopravvivenza. Inoltre, diversi tipi di vetro capillare sono testati e sono determinati parametri per costruire gli aghi perfetti per il microinjection N. vitripennis (tabella 1, Figura 4). Inoltre, seguenti microiniezione, sopravvivenza dell’embrione tariffe sono in grado di aumentare in modo significativo a causa di incubazione uova iniettate in pre-stung host collocati in camere di alto-umidità (70%). Queste innovazioni consentono una procedura più snella e successo di microiniezione per N. vitripennis.
Piccole modifiche in termini di apparato di iniezione e procedure di allevamento possono essere fatto al presente protocollo, a seconda delle preferenze dell’utente. Tuttavia, un numero di passaggi critici sarà essenziale per la generazione di mutanti con successo in N. vitripennis. Ad esempio, lavorando rapidamente affinché embrioni iniettati sono > vecchio h 1 e assicurando che gli aghi per iniezione sono abbastanza nitide minimizzare i danni per l’embrione sia sarà essenziale. Mentre questo protocollo dovrebbe essere efficace per la generazione di mutazioni nei geni di molti (se non tutti), uno dei principali limiti è il requisito di CRIPSR/Cas9 di destinazione una sequenza di PAM (NGG) che detterà alla sequenza di destinazione.
In conclusione, questa tecnica migliorata può essere utilizzata per generare molti tipi di modificazioni del genoma, come mutazioni, delezioni e forse anche inserimenti utilizzando CRIPSR/Cas9 tecnologie21, o persino transgene inserimenti per generare transgenici N. vitripennis, che dovrebbe accelerare notevolmente la ricerca funzionale in questo organismo.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da generoso della University of California, fondo di avviamento di Riverside (UCR) laboratorio O.S.A, USDA National Institute of Food e del progetto di agricoltura (catino) Hatch (1009509) per o.s.a.
Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |