Mikroinjektion af Nasonia vitripennis embryoner er en vigtig metode til at generere arvelige genom ændringer. Beskrevet her er en detaljeret procedure for mikroinjektion og transplantation af Nasonia vitripennis embryoner, som vil i høj grad lette fremtidige genom manipulation i denne organisme.
Juvel hveps Nasonia vitripennis har vist sig som en effektiv modelsystem for studiet af processer, herunder sex bestemmelse, haplo-diploid sex beslutsomhed, venom syntese og vært-symbiont interaktioner, blandt andre. En stor begrænsning af arbejde med denne organisme er manglen på effektive protokoller til at udføre styret genom ændringer. En vigtig del af genom ændring er levering af redigering reagenser, herunder CRISPR/Cas9 molekyler, i embryoner gennem mikroinjektion. Mens mikroinjektion er veletableret i mange modelorganismer, denne teknik er særligt udfordrende at udføre i N. vitripennis primært på grund af sin lille embryon, og det faktum, at embryonale udvikling forekommer helt inden for en parasitized blowfly puppe. Følgende procedure overvinder disse betydelige udfordringer, mens demonstrere en strømlinet visuel procedure til effektivt at fjerne hveps embryoner fra parasitized vært pupper, microinjecting dem, og omhyggeligt omplantning dem tilbage til værten for fortsættelsen og afslutningen af udvikling. Denne protokol vil kraftigt øge forskningsgrupper evne til at udføre avancerede genom ændringer i denne organisme.
Juvel hveps, N. vitripennis, er en af de fire arter inden for slægten Nasonia , som er ectoparasitoids af kød at spise fluer som Sarcophaga bullata1. På grund af deres hurtige-generationsskifte perioder, lethed af opdræt i laboratoriet, og et udvalg af unikke og vigtige biologiske attributter, har N. vitripennis været i fokus for udviklingen af flere eksperimentelle værktøjer findes i traditionelle modelorganismer . For eksempel, omfatte nogle unikke biologiske egenskaber en haplo-diploid reproduktion system2, et forhold med mikrobielle og genetiske parasitter3,4, og en overtallige (B) kromosom5,6 ,7. Taget sammen, gør disse N. vitripennis en vigtig eksperimentel system for eksperimenter med henblik på at belyse de molekylære og cellulære aspekter af disse processer, ud over andre herunder venom produktion8, 9, sex bestemmelse10,11, og evolution og udvikling af akse mønster dannelse12,13,14. Desuden, den genetiske toolkit at studere biologi af N. vitripennis er vokset dramatisk i det sidste årti eller så, med sekventering af en høj opløsning genom15, flere genekspression undersøgelser16,17,18, og den evnen til at funktionelt forstyrre genekspression afhængige RNA-interferens (RNAi)19,20, som sammen har forbedret sporbarhed og kapaciteter til at udføre reverse genetik i denne organisme.
Trods de mange vigtige videnskabelige fremskridt og udvidet toolkits i denne organisme, som i den nuværende viden har kun én gruppe med held udført embryonale microinjections for at generere arvelige genom ændringer21. Dette er primært på grund af vanskeligheder med at arbejde med embryoner af N. vitripennis , som de er ganske skrøbelig og små, bliver ~2/3 størrelsen af Drosophila melanogaster embryoner, hvilket gør dem generelt vanskeligt at manipulere. Derudover deponere N. vitripennis hunner deres æg i pre stukket blowfly pupper, inden for hvilken helhed af embryogenese, larver, og puppe udvikling opstår. Derfor, for vellykket microinjections, før blastoderm stadium, embryoner skal effektivt indsamles fra værten pupper, hurtigt microinjected, og straks transplanteres tilbage til deres værter for udvikling. Disse trin kræver præcision og smidighed til at undgå at beskadige de microinjected embryoner eller de puppe værter, gør den teknik undtagelsesvis udfordrende. Uanset, der er en kort protokol udgivet over et årti siden, der beskriver N. vitripennis embryo mikroinjektion22. Men denne procedure kræver, at de frisk lagt embryoner blive udtørret, det bruger klistret tape til at forankre æg til mikroinjektion, og omfatter ikke en visuel demonstration af teknikken. Derfor beskrevet her er en opdateret og revideret protokol, herunder en visuel procedure, detaljering en forbedret trinvise protokol for N. vitripennis embryo microinjections, der kan følges af enhver grundlæggende lab til at generere arvelige genom ændringer i denne vigtige model insekt.
Den seneste sekventering af N. vitripennis genom har udløst et vigtigt behov for Molekylær værktøjer til funktionelt karakterisere ukendt gener inden for denne art23. CRISPR-Cas9 system, og mange andre gen redigeringsværktøjer, har vist sig for at være værdifuld i efterforskningen af genet funktioner for en række af organismer24. Men for at generere arvelige mutationer, disse værktøjer kræver udfører embryo microinjections. Derfor viste her er en detaljeret visuel teknik, der omfatter en række nyskabelser, der giver mulighed for effektiv N. vitripennis embryo microinjections.
Samlet set denne detaljerede teknik tilbyder en række væsentlige nyskabelser med hensyn til eksisterende metoder23, der giver mulighed effektiv N. vitripennis embryo microinjections. For eksempel, for at lette en hurtig indsamling af embryoner, oprettes og bruges til at begrænse æglægning helt til den bageste ende af værten (figur 1), som i høj grad letter samling af talrige embryoner i en oviposition værktøj (skum prop) en kort periode. Teknikker for opdræt hveps kolonier i stort tal til at indsamle større antal æg er også forbedret og defineret. Derudover for at fremskynde embryo justering, er et embryo justering enhed, som giver mulighed for embryoner skal effektivt justeret og sprøjtes uden at skulle bruge dobbeltsidet klistret tape til at sikre embryoner på plads (figur 3) udviklet.
Det er også konstateret, at ved at holde embryonerne fugtig med vand under injektion og ikke tørrende embryoner eller dækker dem med olie forbedret overlevelsesrate. Derudover flere kapillær glas typer er testet og parametre til at konstruere de perfekte nåle til N. vitripennis mikroinjektion (tabel 1, figur 4) bestemmes. Desuden følgende mikroinjektion, embryo overlevelse priser er i stand til at stige betydeligt på grund af inkubere injiceres æg i pre stukket værter placeret i høj fugtighed (70%) kamre. Disse nyskabelser giver mulighed for en mere strømlinet og vellykket mikroinjektion procedure for N. vitripennis.
Kan foretages mindre ændringer i form af indsprøjtning apparater, og opdræt procedurer til denne protokol, afhængigt af brugerens præferencer. Imidlertid bliver en række vigtige skridt afgørende for korrekt generere mutanter i N. vitripennis. For eksempel arbejder hurtigt så at injiceres embryoner er > 1 h gamle, og sikre, at injektion nåle er skarpe nok til at minimere skader fosteret vil både være afgørende. Mens denne protokol skal være effektiv til at generere mutationer i gener, mange (hvis ikke alle), er en stor begrænsning CRIPSR/Cas9 krav til at målrette en PAM (NGG) sekvens, som vil diktere target sekvens.
Afslutningsvis, kan dette forbedret teknik bruges til at generere mange slags genom ændringer, såsom mutationer, sletninger og måske endda indrykninger ved hjælp af CRIPSR/Cas9 teknologier21, eller endda transgen indsættelser til at generere transgene N. vitripennis, som kraftigt bør fremskynde funktionelle forskning i denne organisme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en generøs University of California, Riverside (UCR) laboratorium start-up fonden til O.S.A, en USDA National Institute for fødevarer og landbrug (NIFA) Hatch projekt (1009509) til O.S.A.
Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |