Mikroskop Nasonia vitripennis embryon är en viktig metod för att generera ärftliga genomet ändringar. Beskrivs här är ett detaljerat förfarande för Mikroskop och transplantation av Nasonia vitripennis embryon, som kommer att underlätta framtida genomet manipulation i denna organism.
Juvel getingen Nasonia vitripennis har vuxit fram som en effektiv modellsystem för att studera processer inklusive sex bestämning, haplo-diploida kön beslutsamhet, venom syntes och värd-symbiont interaktioner, bland andra. En stor begränsning av att arbeta med denna organism är bristen på effektiva protokoll att utföra riktad genomet ändringar. En viktig del av genomet modifiering är leverans av redigering reagenser, inklusive CRISPR/Cas9 molekylar, in embryon genom Mikroskop. Mikroskop är väl etablerad i många modellorganismer, denna teknik är särskilt utmanande att utföra i N. vitripennis främst på grund av sin lilla embryo storlek, och det faktum att embryonal utveckling sker helt inom en parasiterade spyfluga puppa. Följande procedur övervinner dessa betydande utmaningar medan demonstrerar en strömlinjeformad, visuella förfarande för effektivt avlägsnande geting embryon från parasiterade värd puppor, microinjecting dem, och noggrant transplantera dem tillbaka in i mottagande för fortsättning och slutförande av utveckling. Detta protokoll kommer att starkt förbättra forskargrupper förmåga att utföra avancerade genomet ändringar i denna organism.
Juvel getingen, N. vitripennis, är en av de fyra arterna inom släktet Nasonia som är ektoparasitoider av kött äter flugor såsom Sarcophaga bullata1. På grund av deras snabba-generationsskifte perioder, användarvänlighet uppfödning i laboratoriet, och en rad unika och viktiga biologiska attribut, har N. vitripennis varit fokus för utvecklingen av flera experimentella verktyg som finns i traditionella modellorganismer . Till exempel inkluderar vissa unika biologiska attribut en haplo-diploida reproduktion system2, en relation med mikrobiell och genetiska parasiter3,4och en vitrobefruktning (B) kromosom5,6 ,7. Sammantaget göra dessa N. vitripennis en viktig experimentella system för experiment som syftar till att klarlägga de molekylära och cellulära aspekterna av dessa processer, förutom andra inklusive venom produktion8, 9, sex beslutsamhet10,11, och evolution och utveckling av axis mönster bildas12,13,14. Dessutom den genetiska toolkit att studera biologi N. vitripennis har ökat dramatiskt det senaste decenniet eller så, med sekvenseringen av en högupplöst genomet15, flera genuttryck studier16,17,18, och förmåga att funktionellt störa genuttryck som förlitar sig på RNA-interferens (RNAi)19,20, som tillsammans har förbättrat tractability och kapacitet att utföra omvänd genetik i denna organism.
Trots många viktiga vetenskapliga framsteg och utökade verktygslådor i denna organism, per nuvarande kunskap har bara en grupp framgångsrikt utfört embryonala microinjections för att generera ärftliga genomet ändringar21. Detta beror främst på svårigheterna med att arbeta med embryon av N. vitripennis eftersom de är ganska sköra och små, är ~2/3 storleken på Drosophila melanogaster embryon, vilket gör dem generellt svåra att manipulera. Dessutom, in N. vitripennis honor sina ägg på pre stucken spyfluga puppor, inom vilken hela embryogenes, larver, och Pupp utveckling uppstår. Därför, för framgångsrik microinjections, före blastoderm scenen, embryon måste effektivt samlas från värd puppor, snabbt microinjected och omedelbart transplanteras tillbaka i deras värdar för utveckling. Dessa steg kräver precision och skicklighet att undvika att skada microinjected embryon eller Pupp värdar, vilket gör tekniken exceptionellt utmanande. Trots detta finns det en kort protokoll publicerade över ett decennium sedan som beskriver N. vitripennis embryo Mikroskop22. Dock denna procedur kräver att nymalen laid embryon vara uttorkad, det använder tejp för att förankra äggen för Mikroskop, och inkluderar inte en visuell demonstration av tekniken. Därför beskrivs här är en uppdaterad och reviderad protokoll, inklusive visuella förfarande detailing ett förbättrat stegvisa protokoll för N. vitripennis embryo microinjections som kan följas av någon grundläggande lab att generera ärftliga genomet ändringar i denna viktiga modell insekt.
Den senaste sekvenseringen av N. vitripennis genomet har utlöst ett viktigt behov för molekylära verktyg att funktionellt karakterisera okända gener inom denna art23. CRISPR-Cas9 systemet, och många andra gen redigeringsverktyg, har visat sig vara värdefull i undersöker gen funktioner för ett antal organismer24. Dessa verktyg kräver dock generera ärftliga mutationer, utför embryo microinjections. Därför visade här är en detaljerad visuell teknik som inkluderar ett antal innovationer som möjliggör effektiv N. vitripennis embryo microinjections.
Sammantaget denna detaljerade teknik erbjuder ett antal viktiga innovationer, med avseende på befintliga metoder23, som möjliggör effektiv N. vitripennis embryo microinjections. Till exempel för att underlätta snabb insamling av embryon, ett ovipositionen verktyg (skum propp) skapas och används för att begränsa ägg om helt till bakre ände värden (figur 1), vilket avsevärt underlättar insamling av talrikt embryon inom en kort tidsperiod. Tekniker för uppfödning av wasp kolonier med ett stort antal att samla större antal ägg är också förbättrat och definieras. För att påskynda embryo justering, utvecklas dessutom ett embryo justering enhet som tillåter för embryon effektivt anpassas och injiceras utan att behöva använda dubbelhäftande tejp för att säkra embryona på plats (figur 3).
Det finns dessutom att genom att hålla embryon fuktiga med vatten under injektion och inte desiccating embryon eller täcka dem med olja förbättrat överlevnaden. Dessutom flera kapillär glas typer är testade och parametrar för att konstruera de perfekta nålarna för N. vitripennis Mikroskop (tabell 1, figur 4) bestäms. Dessutom följande Mikroskop, embryo överlevnad skattesatserna kunna öka betydligt på grund av ruvning injicerade ägg i förväg stucken värdar placeras i hög luftfuktighet (70%) kammare. Dessa innovationer tillåter en mer strömlinjeformad och framgångsrika Mikroskop förfarande för N. vitripennis.
Mindre ändringar i form av injektion apparater och uppfödning förfaranden kan göras till detta protokoll, beroende på användarens preferenser. Dock kommer att ett antal kritiska steg vara avgörande för att framgångsrikt skapa mutanter i N. vitripennis. Exempelvis arbeta snabbt så att injicerade embryon är > 1 h gammal, och att säkerställa att injektionsnålar är tillräckligt skarp för att minimera skador på embryot kommer båda vara väsentliga. Medan detta protokoll ska vara effektiv för att skapa mutationer i gener som många (om inte alla), är en stor begränsning CRIPSR/Cas9 kravet att rikta en PAM (NGG) sekvens som kommer att diktera sekvensen mål.
Avslutningsvis kan denna förbättrade teknik användas för att generera många typer av genomet modifieringar, såsom mutationer, borttagningar, och eventuellt även infogningar för att generera transgena i CRIPSR/Cas9 teknik21eller ens transgenens infogningar Subst. vitripennis, som bör kraftigt påskynda funktionell forskning i denna organism.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av en generös University of California, Riverside (UCR) laboratorium startfonden O.S.A, en USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk (NIFA) Hatch-projektet (1009509) till O.S.A.
Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |