Summary
ظهارة صباغ الشبكية (RPE) ظهارة متعدد الوظائف للعين. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من RPE مورين.
Abstract
ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ظهارة متعددة الوظائف عالية استقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. أنها ورقة واحدة من الخلايا المصطبغة وجبات هاكسغنلي ومتصلة بواسطة تقاطعات ضيق. تشمل المهام الرئيسية ل RPE امتصاص الضوء، البلعمه من الجزء الخارجي مستقبله تسلط، التخزين المؤقت المكانية من أيونات، ونقل المواد الغذائية والايونات والماء، فضلا عن المشاركة النشطة في دورة البصرية. بهذه المهام الهامة والمتنوعة، أنها ذات أهمية حاسمة لدراسة بيولوجيا الخلايا RPE. وقد تم إنشاء عدد من خطوط الخلايا RPE؛ ومع ذلك، المعروف الخلايا باساجيد ومخلدة سرعان ما يفقد بعض الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية الطبيعية RPE الخلايا. وهكذا، الخلايا الأولية أكثر ملاءمة لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلايا RPE والدالة. الماوس الأساسي RPE خلية ثقافة مفيد جداً للباحثين نظراً لنماذج الماوس تستخدم على نطاق واسع في الدراسات البيولوجية، ومع ذلك جمع RPE الخلايا من الماوس أيضا صعبة للغاية بسبب صغر حجمها. نقدم هنا، بروتوكول لإنشاء الماوس الأساسي RPE خلية الثقافات التي تشمل انوكلييشن وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا الأسلوب يتيح استعادة كفاءة الخلية. RPE الخلايا التي تم الحصول عليها من اثنين من الفئران يمكن أن تصل إلى كونفلوينسي في أحد إدراج غشاء البوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحة الثقافة بعد أسبوع واحد من عرض بعض الخصائص الأصلية لحسن النية RPE الخلايا مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد سنتين والثقافة أسابيع للثقافة.
Introduction
ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هي طبقة واحدة من الخلايا الظهارية الاستقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. الأداء الوظيفي للخلايا RPE وسلامة أحادي الطبقة RPE حاسمة بالنسبة لرؤية سبب RPE دوراً رئيسيا في عمليات متعددة مثل الحفاظ على حاجز الدم-الشبكية الخارجي، نقل الماء والايونات بين الشبكية شرويد، على ضوء الاستيعاب، الحماية من الأكسدة، والسيطرة على عملية الأيض ريتينويد والبلعمه من الجزء الخارجي من1،فوتوريسيبتورس2. موقع RPE في الجزء الخلفي من العين، فضلا عن وظيفتها حاجز منع المخدرات تدار النظامية من المرور من الدم إلى الزجاجي، تجعل من الصعب على دراسة تعقيد RPE الدالة في فيفو. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لإنشاء RPE الثقافات الخلية لدراسة الخلايا RPE في بيئة مرنة، التي تسيطر عليها3،4.
ويوجد عدد من خطوط الخلايا RPE الراسخة، يوفر طريقة ملائمة وسهولة الحصول عليها وتخزينها في الخلايا؛ ومع ذلك، تحتوي الخلايا باساجيد بعض العيوب مقارنة بالخلايا الأولية2،،من34. أولاً، أنها غالباً ما تتسم بتغييرات في مورفولوجيا الخلايا. على سبيل المثال، لم يعثر أي من خطوط الخلايا الموجودة تكون مناسبة لدراسة موثوقة لخصائص RPE الحاجز بسبب فقدان الخلية القطبية النمط الظاهري واختفاء جزئي تقاطعات ضيق4. بالإضافة إلى فقدان قطبية والسليم خلية إلى خلية اتصالات، خطوط الخلايا RPE سرعان ما يفقد ما تصبغ نظراً للغياب الإنزيمات ميلانوجينيسيس الرئيسية في RPE الكبار5. يمكن استعادة التصبغ، ولكن التحليل الشامل لآلية إعادة تصبغ تشمل مزيجاً من مجهر إلكتروني، الجينات التعبير فحوصات التحليل والمواد الكيميائية للتأكد من وجود الميلانين قد ابدأ وقد أجرى6. القيد أكثر واحد هو أن خطوط الخلايا RPE الحياة الخلية الموسعة (في بعض الأحيان-الخلود) وفي ظل ظروف معينة، يمكن أن تتحول إلى تجديد الذاتي الخلايا الجذعية البالغة multipotent الذي فصل من الركازة وشكل عائم المستعمرات7، 8-هذا القيد يجعل من المستحيل استخدام خطوط الخلية لزرع الأعضاء والتجارب3.
قد RPE الابتدائي خلية الثقافات التي تم الحصول عليها من أنسجة جديدة نظراً لمساوئ خطوط الخلايا RPE المنشأة، بمثابة نموذج ذات صلة أكثر بيولوجيا للدراسة RPE. خلايا أولية RPE قد استخدمت ليس فقط لدراسة مهام محددة RPE مثل الأيض فيتامين (أ)9، البلعمه مستقبله شرائح الخارجي10 وأيون النقل11، ولكن أيضا لدراسة بيولوجيا الخلية الأساسية مثل طلائي قطبية الخلية2 والتوازن الليزوزومية أوتوفاجي،من1213.
في اليومين الماضيين من سنوات كان هناك عدد من المنشورات بشأن إنشاء الأولية RPE الثقافات، مما يشير إلى اهتمام متزايد في هذا المجال من البحوث3،،من1415. البروتوكولات العديدة للخلايا RPE البشرية وغير البشرية RPE الخلايا مثل الخلايا RPE البقر والخنزير وقد نشرت16،17،،من1819. ومع ذلك، أنها أكثر صعوبة في التعامل مع الماوس RPE الخلايا بسبب حجمها أصغر بكثير. على الرغم من أن عددا كبيرا من المنشورات وصف بروتوكولات لعزل الخلايا RPE من الماوس14،،من2021، لا تزال هناك العديد من الباحثين تكافح من أجل عزل الخلايا RPE دون تلوث شرويد الخلايا أو الخلايا من الحطام الشبكية العصبية. وهنا يقدم البروتوكول المتعلق بوضع الماوس الأساسي RPE ثقافة الخلية، بما في ذلك الحصول على العيون من الماوس، وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا البروتوكول الفيديو سيكون مفيداً بشكل خاص للباحثين الذين بدأوا العمل مع الماوس الأساسي RPE الثقافات وتحتاج إلى إرشادات بشأن تقنيات التشريح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة بيتسبرغ الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان
1. إعداد الحلول
- يعد النمو المتوسطة بالمكملين دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، وارتفاع الجلوكوز مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 2.5 مم L-الجلوتامين و 1 الأحماض MEM x الأمينية غير الأساسية. قبل الحارة وسائط الإعلام في حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- إعداد حل العامل الثاني ديسباسي 2 ٪ (wt/المجلد):
- تحضير حلاً أسهم من 100 مغ/مل ديسباسي الثاني بتذويب 30 ملغ ديسباسي الثاني في 300 ميليلتر حبيس مخزنة المالحة (50 مم حبيس/كوه الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم). وحدة التخزين هذه للفئران 3-4، ويمكن زيادتها أو أسفل استناداً إلى العدد الفئران للتجربة). ويمكن تخزين هذا المخزون لمدة أسبوع واحد على الأقل في 4 درجات مئوية.
- إعداد حل العامل ديسباسي 2% بإضافة 300 ميليلتر من 100 مغ/مل ديسباسي الثاني الأسهم إلى 1.2 مل دميم العقيمة والجلوكوز عالية وتصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة في التدفق الصفحي مجلس الوزراء تحت ظروف معقمة. قبل الحارة ديسباسي استعداد الثاني في حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2-الحصول على عيون الفأر
- Euthanize الماوس باستخدام أي أسلوب المعتمدة ووضعه على منصة ماصة.
- ارتداء القفازات، وضع الإبهام والسبابة حول العين ودفع الجلد بلطف إلى برتوس مقلة العين.
- إدراج غيض مقص الزاوية بين مقلة العين والجلد وقطع بعناية في العين. لتجنب التلوث، بإيجاز وتراجع العين في الإيثانول 70%.
- فورا مكان العين في مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني) في طبق بتري.
- كرر الخطوات من 2.2-2.4 لإزالة العين الثانية.
3. تشريح العين
- بعناية إزالة النسيج الضام من العين تحت مجهر تشريح. يمكن أن يتم ذلك في برنامج تلفزيوني أو في طبق بتري الجافة.
- استخدام الملقط خياطة لرفع الأنسجة الضامة من مقلة العين، وقطع منها باستخدام مقص فاناس. لا تقطع الصلبة العينية لأنه من المستحيل عمليا الحصول على eyecups الخلفي سليمة إذا تم قطع الصلبة العينية.
- بعد تنظيف النسيج الضام، تبقى مقل العيون الناتجة عن ذلك في برنامج تلفزيوني للغسيل والخطوة التالية.
ملاحظة: يجب إجراء كافة الخطوات التالية في التدفق الصفحي مجلس الوزراء تحت ظروف معقمة.
- غسل العينين مرتين في حرارة قبل 37 درجة مئوية دميم (ارتفاع السكر). نقل مقل العيون في حرارة قبل 37 درجة مئوية دميم (ارتفاع السكر) باستخدام الملقط بعناية. نضح مقل العيون المتوسطة ونقل إلى متوسطة الطازجة في طبق جديد.
- نضح المتوسطة (ارتفاع السكر) دميم واحتضان العيون في الحل العامل الثاني قبل حرارة 2% (wt/المجلد) ديسباسي لمدة 45 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في جميع الخطوات التالية، ضع والتلاعب بعيون أو eyecups في الأجلين المتوسط والنمو، التي سوف تحمي الأنسجة وتوفير وسيلة جيدة للتشريح. - إزالة الحل الثاني ديسباسي وغسل العينين مرتين في المتوسط النمو يسفط المتوسطة القديمة وإضافة الجديدة المتوسطة النمو قبل حرارة 37 درجة مئوية (الشكل 1a).
ملاحظة: بعد الانفصال من جانب ديسباسي الثاني، مقل العيون تصبح لينة. - عقد العين بالملقط وجعل شق حول سيراتا أورا من كل العين باستخدام مقص فانس تحت مجهر تشريح توضع في التدفق الصفحي مجلس الوزراء.
- حفظ مقلة العين في الحل، بعناية إزالة القرنية الأمامي بتمديد قص حول محيط سيراتا أورا وسحب القرنية الأمامي بعيداً بعد أن تم القطع كاملة.
- إزالة كبسولة العدسة وظهاره قزحية المرتبطة مصطبغة بلطف سحبهم من فنجان العين مع الملقط التقليديهاستخدام (الشكل 1b، ج 1).
- احتضان eyecups الخلفي الناتجة في نمو متوسطة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لتسهيل انفصال الشبكية العصبية RPE.
- قطع eyecups الخلفي إلى 4 بتلات تحت مجهر تشريح توضع في التدفق الصفحي مجلس الوزراء. التخفيضات التي ينبغي أن تكون طويلة بما يكفي لشد فنجان العين، لكن قصيرة بما فيه الكفاية للاحتفاظ بتلات متصلة (الشكل 1 د).
- تسطيح فنجان العين وإزالة الشبكية العصبية عن طريق سحب بلطف جداً مع الملقط أثناء الضغط المتبقية مجمع RPE-المشيمية-الصلبة مع الملقط آخر (الشكل 1e). بدء سحب من الحواف بدلاً من المركز.
- نقل جميع الأنسجة الذين تم إيواؤهم في طبق ثقافة عقيمة جديدة مليئة بحرارة قبل المتوسطة النمو 37 درجة مئوية.
4-عزل خلايا RPE أولية
- تلة واحدة عقد المجمع RPE-المشيمية-الصلبة الذين تم إيواؤهم مع غرامة سوبر الملقط، تقشر بلطف أوراق سليمة من RPE من الغشاء الركيزة الأساسية (غشاء بروخ 's) باستخدام سكين هلال microsurgical تحت مجهر تشريح وضعت في مجلس الوزراء الاندفاق الصفحي (الشكل 1f).
- نقل الأوراق RPE إلى الطبق ثقافة عقيمة جديدة تحتوي على متوسط النمو باستخدام ميكروبيبيتي P200. عند نقل أوراق RPE، الرطب نصائح ماصة مع متوسط النمو من بيبيتينج عدة مرات لمنع الأنسجة من الخلاف داخل الحافة. RPE سوف يكون واضحا يمكن تمييزها عن المشيمية: RPE تبدو أكثر البنى، بينما المشيمية أغمق وتبدو لزجة ورقيق.
- وبدلاً من ذلك، استخدم الهضم الأنزيمي وتفكك لطيف دون الملقط لفصل RPE من شرويد14.
- تغسل الأوراق RPE باستخدام 2-3 مرات قبل حرارة 37 درجة مئوية متوسط النمو في الطبق الثقافة العقيمة. بعد كل خطوة الغسيل، بعناية جمع أوراق RPE مع تجنب الأنسجة الأخرى مثل الحطام الشبكية أو المشيمية. في نهاية الغسيل الماضي جمع أوراق RPE مع ميكروبيبيتي P200 ووضعها في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
ملاحظة: ليس هناك حاجة الطرد المركزي الأوراق RPE: أنهم سوف الرواسب بالجاذبية داخل 1 دقيقة. - إزالة متوسط نمو إضافي استخدام ميكروبيبيتي P200. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة النمو قبل حرارة جديدة وتريتوراتي عليها باستخدام ميكروبيبيتي P200 لطف. تجنب تشكيل الفقاعات. تعليق خلية واحدة مثالية، ولكن أيضا تجنب الكثير من تريتوريشن، وإلا RPE الخلايا غير قادرة على البقاء على قيد الحياة. ونحن نوصي بلطف جداً تريتوريشن عن 40-50 مرة.
5-استزراع الخلايا RPE
- لوحة الخلايا على طبق من ثقافة.
- إذا تتطلب التطبيقات المتلقين للمعلومات من الخلايا RPE الاحتفاظ بهم القطبية، لوحة RPE الخلايا من الفئران 2 في أحد إدراج غشاء البوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحات الثقافة 12-جيدا. طلاء الخلايا في الكثافة العالية هو المطلوب لأنه في هذه الحالة قادرة على الحفاظ على الخصائص الأصلية، مثل سداسية الشكل وتصبغ الخلايا RPE.
- لا نقل اللوحة أو تغيير متوسط النمو ح 72 الأولى من استزراع. بعد 3 أيام، تحل محل المتوسطة القديمة مع متوسط النمو قبل حرارة الطازجة. بعد ذلك تغيير ثقافة المتوسط كل يوم. وبمجرد الحصول على خلايا RPE كونفلوينسي، تقليل FBS في المتوسطة النمو إلى 2 في المائة.
ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا باستخدام التربسين 0.25%. ومع ذلك، بعد تقسيم قد تفقد الخلايا سداسية الشكل وتصبغ في الفقرات اللاحقة. ونحن لا ننصح بتقسيم الخلايا، ولكن إذا كان مطلوب من قبل تطبيقات المصب الثقافة، ونضع في اعتبارنا أن الخلايا الأولية لا يمكن أن باساجيد إلى أجل غير مسمى: هي معروفة لإزالة التمييز بعد الفقرات 5-7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الماوس الأساسي RPE ثقافة المنشأة من الفئران 2 في 12 مم غشاء البوليستر إدراج يصل إلى 90-95% كونفلوينسي بعد أسبوع واحد في الثقافة. بعد أسبوعين ثقافة، وصلت إلى 100% كونفلوينسي الخلايا وبدأ بتشكيل فسيفساء خلايا سداسية والمصطبغة والمنبسطة ثنائية. قبل 3 أسابيع ثقافة، والخلايا تابع لتشكيل الشكل ولون البشرة، ومع ذلك، حصلت جزء من الخلايا بعد 4 أسابيع الصباغ (الشكل 2).
يمكن تقييم نقاء ثقافة الخلية RPE الأولية باستخدام جسم RPE65 (ريتينويد إيسوميروهيدرولاسي، وإنزيم حرجة في دورة الفقارية البصرية التي تمكن من تحويل اﻻسترات كل-ترانس-ريتينيل إلى 11-رابطة الدول المستقلة-الريتينول خلال إيمونوستاينينج فوتوترانسدوكشن) (الشكل 3، الأحمر). سلامة الوصلات خلية إلى خلية، ووجود سداسية الشكل يمكن البرهنة باستخدام فالوينين تلطيخ (الشكل 3، الأخضر). وباﻹضافة إلى ذلك، التعبير عن زوي-1 البروتين، عنصرا هاما في تقاطعات ضيقة، يمكن التحقق من صحة استخدام الغربية النشاف (الشكل 4) أو إيمونوستينينج.
النتائج التي توصلنا إليها تبين أن الثقافات RPE الابتدائي الماوس التي يتم الحصول عليها قادرة على تتكاثر واستبقاء تصبغ وسداسية الشكل وتقاطعات ضيقة، والتعبير عن علامات وظيفية مثل RPE65.
الشكل 1 . الخطوات المختلفة لتشريح العين للحصول على RPE الرئيسية الخلية الثقافات. () بعد الانفصال في ديسباسي 2%، يتم غسلها العين في المتوسطة النمو. (ب) فنجان العين الخلفي يتم الحصول عليها عن طريق إزالة القرنية والعدسة. (ج) كذلك يتم تنظيف فنجان العين الناتجة عن طريق إزالة القزحية يرتبط مصطبغة ظهارة. (د) بعد زيادة الاحتضان في المتوسطة النمو، فنجان العين هو قطع إشعاعيا لتوليد الأرباع. (ه) هو انشقت الشبكية العصبية من المجمع RPE-المشيمية-الصلبة المتبقية. (و) مفصولة RPE أوراق بلطف من غشاء بروخ. علما بأن RPE تبدو أكثر البنى (الأسهم)، بينما المشيمية أكثر قتامة ولزجة جداً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . خلايا أولية RPE من ماوس 3-أسبوع قديمة مثقف على إدراج غشاء بوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحات الثقافة 12-جيدا- الماوس الأساسي RPE ثقافة المنشأة من الفئران 2 في 12 مم غشاء البوليستر إدراج يصل إلى 90-95% كونفلوينسي بعد أسبوع واحد في الثقافة (أ). بعد أسبوعين ثقافة، وصلت إلى 100% كونفلوينسي الخلايا وبدأ بتشكيل فسيفساء خلايا سداسية والمصطبغة والمنبسطة ثنائية (ب). قبل 3 أسابيع ثقافة واصل الخلايا لتشكيل الشكل وتصبغ (ج)، ومع ذلك، حصلت جزء من الخلايا بعد 4 أسابيع الصباغ (د). شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . علامة الخلية RPE، RPE65، قابلاً للاكتشاف في الخلايا RPE الماوس الرئيسي- كانت ثابتة في بارافورمالدهيد 4% (PFA) الماوس الأساسي RPE الخلايا بعد 4 أسابيع ثقافة والمحتضنة مع جسم RPE65 أو المخزن المؤقت حظر كعنصر سلبي (NC). كما أضيف إلى وصمة عار في أغشية الخلية ونوى فالويدين (الأخضر) و DAPI (أزرق). شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . العلامة من تقاطعات ضيق، هو أعرب عن زوي-1 في الخلايا الأولية RPE. كانت تحصد الماوس الأساسي RPE الخلايا (مربي) بعد 3 أسابيع ثقافة وتم تشغيل 8 ميكروغرام للخلية ليستي على وصمة عار غربية. المبلغ المعادل بالخلايا ARPE-19 (متوفرة تجارياً مستقرا RPE الخلية خط) استخدمت كعنصر سلبي. وأعرب زوي-1 عالية في الخلايا RPE الأولية بينما يجري غائبة من الخلايا ARPE--19. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح البروتوكول مفصلاً قدم إنشاء موثوق بها الماوس الثقافات RPE الأولية التي تصل إلى كونفلوينسي بعد أسبوع واحد، وعرض الخصائص RPE الرئيسية مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد أسبوعين. يمكن استخدام خلايا RPE التي تم الحصول عليها لعدد من التطبيقات المصب مثل فيتامين (أ) الأيض9، البلعمه من قطاعات الخارجي مستقبله10 وايون النقل11، الخلايا الظهارية قطبية2، الليزوزومية التوازن، وأوتوفاجي،من1213. اعتماداً على التطبيق المصب، يمكن التحقق من صحة مورفولوجية ثقافات المشتقة من انتقال والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني كما هو موضح بالتفصيل في أماكن أخرى14. فحوصات إضافية لإثبات نضوج الثقافات يمكن أن تشمل المقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال (طير) الاعتداء لإثبات قطبية الخلايا RPE، فحوصات النفاذية4،22، الاختبارات الوظيفية (البلعمه 23) وقبة تشكيل.
في تجربتنا، المزيد من الخلايا التي يتم مطلي في بئر وأفضل كونفلوينسي وفي النمط الظاهري. في هذا البروتوكول، ونحن المصنف الخلايا RPE من الفئران 2 في واحد من إدراج 12 مم. ومع ذلك، كما أنها مجدية لوضع الخلايا RPE من الفئران 2 في إدراج 6.5 مم واحدة للحصول على أفضل كونفلوينسي وطير. في العديد من الدراسات، المغلفة لوحات للثقافات الخلية RPE مع ماتريجيل أو لامينين. لم نر فرقا كبيرا في مرفق RPE خلية لهذه السفن مع أو بدون طلاء. وبالإضافة إلى ذلك، قد يمكن تعديل النسبة المئوية ل FBS في الأجلين المتوسط والثقافة لتحقيق نتائج أفضل. FBS عادة جيدة للوصول إلى كونفلوينسي 10%، لكن يبدو أن إسقاط لأقل FBS مفيدة ل RPE التمايز/نضج14،17.
القيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو الحاجة إلى تدريب دقيق للشخص الذي يقوم بتشريح العين لضمان أقصى قدر من الكفاءة الانتعاش خلية RPE دون التلوث عبر مع الخلايا المشتقة من أنسجة العين الأخرى. لتجنب التلوث المتبادل، ينبغي إتقان الباحث أن الخطوة الحاسمة لهذا الإجراء: تقشير قبالة الشبكية متبوعاً بالفصل الدقيق بين RPE من المشيمية عناية. يمكن التحقق من نقاء الثقافات التي تم الحصول عليها باستخدام immunostaining RPE على حدة. عدد من علامات RPE متاحة لتحديد خصائص الثقافات RPE، بما في ذلك الجينات المشاركة في دورة البصرية والحاجز ووظيفة النقل، والايض، البلعمه، وميلانوجينيسيس15.
قيد آخر هو عدد العيون التي يمكن معالجتها في نفس الوقت للحصول على الثقافات. وبصفة عامة، لا نوصي بالعمل مع الفئران أكثر من 2 في وقت واحد. لضمان بقاء الخلايا RPE، ينبغي أن تشريح العيون بأقصى سرعة ممكنة. بعد المستخدم يصبح أكثر كفاءة، فمن الممكن التعامل مع الفئران أكثر من مرة الحضانة بالتناوب.
عموما، قد نشرت عددا من الأساليب في وضع الماوس الأساسي RPE ثقافتين3،،من1415، ومع ذلك، للمرة الأولى، نقدم نسخة فيديو من البروتوكول بكامله. يمكن استخدام هذا البروتوكول كإرشادات بشأن تقنيات تشريح العين. ومع ذلك، يمكن تحقيق التوازن الأمثل بين عالية السرعة والدقة المطلوبة للتشريح إلا بالممارسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
س تلقي التمويل من الرعاية الصحية باير ف. هوفمان-لاروش، ألمانيا وسويسرا للبحث. يعلن المؤلفون المتبقية لا تضارب المصالح المالية. ويدعم هذا العمل البحوث "منع العمى" (المنح غير مقيد إلى معهد ويلمر العين وجامعة بيتسبرغ). ويدعم هذا العمل أيضا أموال بدء التشغيل إلى DS من طب العيون، جامعة بيتسبرغ.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة جزئيا بالمؤسسة برايتفوكوس (إلى DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
