Summary
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...
Abstract
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי מקוטב מאוד הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. . זה גיליון אחד של תאי פיגמנט hexagonally ארוז, המחוברים באמצעות צמתי צר... הפונקציות העיקריות של RPE כוללים ספיגת אור, phagocytosis מקטעי החיצוני של קולט אור המחסן, אגירה המרחבי של יונים, הובלה של חומרים מזינים, יונים, מים, כמו גם מעורבות פעילה במחזור חזותי. עם כזה פונקציות חשובות ומגוונות, חשוב באורח קשה ללמוד את הביולוגיה של תאי RPE. מספר קווי תאי RPE הוקמו; עם זאת, תאים passaged מונצחים ידועים במהירות לאבד חלק מאפיינים פיזיולוגיים מורפולוגיים של תאי RPE טבעי. לפיכך, ראשי תאים מתאימים יותר ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של התא RPE ותפקוד. תרבית תאים RPE העיקרי של העכבר הוא שימושי מאוד עבור חוקרים מאז מודלים העכבר נמצאים בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים, אולם איסוף RPE תאים מן העכבר גם מאתגר מאוד בשל גודלם הקטן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת תרביות תאים RPE העכבר הראשי הכוללת העקירה, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. שיטה זו מאפשרת שחזור היעילה תא. תאי RPE המתקבל שני עכברים יכולים להגיע confluency על אחד הוספה ממברנה פוליאסטר של 12 מ מ, טעון מראש בצלחת תרבות לאחר שבוע של תרבות להציג חלק מהמאפיינים המקוריים של RPE בתום תאים כגון צורת משושה, פיגמנטציה לאחר שני שבועות של תרבות.
Introduction
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) היא שכבה אחת של תאי אפיתל מקוטב הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. הפונקציונליות של תאי RPE ויושר טפט RPE הם קריטיים עבור חזון כי RPE ממלא תפקיד חשוב בתהליכים מרובים כגון שמירה על המחסום דם-רשתית החיצוני, הובלת מים, יונים בין הרשתית ו מקלעת דמית העין, אור הקליטה, הגנה מפני סטרס חמצוני, שליטה על חילוף החומרים retinoid, phagocytosis המקטעים החיצוני של1,photoreceptors2. המיקום של RPE מאחורי העין, וכן תפקידה מחסום מניעת סמים מנוהל מערכתית עובר מהדם אל נוזל, להקשות ללמוד את המורכבות של ה RPE פונקציה ויוו. לפיכך, יש צורך גדול להקמתה של תרביות תאים RPE ללמוד תאי RPE גמיש, בסביבה מבוקרת3,4.
מספר קווי תאי RPE הוקמה קיימות, מתן דרך קלה ונוחה של קבלת ואחסון של התאים; עם זאת, תאים passaged יש כמה חסרונות לעומת תאים ראשי-2,-3,-4. ראשית, הם לעיתים קרובות מאופיינים על ידי שינויים מורפולוגיה תאים. לדוגמה, אף אחד ממחקרי התא הקיימים נמצאו בהכשרת מחקר אמין של המאפיינים מכשול RPE בשל האובדן של פנוטיפ קוטביות תא והעלמות חלקית של צמתי צר4. בנוסף אובדן קוטביות והתקשרויות לתא המתאים, הקווים תאי RPE לאבד במהירות שלהם פיגמנטציה בשל היעדרם של אנזימים melanogenesis מפתח ב RPE למבוגרים5. ניתן לשחזר את הפיגמנטציה, אבל ניתוח מקיף של המנגנון של פיגמנטציה מחדש אשר כוללים שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, ג'ין ביטוי מבחני ניתוח וכימיקלים לאשר הנוכחות של מלנין מעולם כבר בביצוע6. מגבלה אחת יותר הוא הקווים תאי RPE חיי תאים המורחבת (לפעמים - אלמוות), בתנאים מסוימים יכול להפוך עצמי המתחדש תאי גזע multipotent כי ניתוק מן המצע טופס צף מושבות7, 8. מגבלה זו עושה את זה בלתי אפשרי להשתמש הקווים תא עבור השתלת ניסויים3.
בהתחשב החסרונות של הקווים תאי RPE הוקמה העיקרי תרביות תאים RPE המתקבל רקמות טרי עשוי לשמש מודל יותר ביולוגית רלוונטית ללמוד את RPE. ראשי תאי RPE שימשו לא רק ללמוד פונקציות ייחודיות RPE כגון ויטמין A חילוף החומרים9, phagocytosis של קולט אור מקטעי החיצוני10 ויון תחבורה11, אלא גם ללמוד ביולוגיה של התא בסיסיים כגון אפיתל התא קוטביות2 , הומאוסטזיס lysosomal autophagy12,13.
בחודשיים האחרונים של שנים היו מספר פרסומים על ביסוס ראשוני RPE תרבויות, המציין עניין הולך וגובר באזור זה של מחקר3,14,15. פרוטוקולים רבים עבור תאי RPE אדם ותאים RPE אנושיות כגון תאי RPE שור וחזירי היו שפורסמו16,17,18,19. עם זאת, קשה יותר להתמודד עם תאי RPE העכבר בשל גודלם קטן בהרבה. אף-על-פי מספר פרסומים תיארו פרוטוקולים בידוד תאי RPE העכבר14,20,21, עדיין ישנם חוקרים רבים נאבקים לבודד תאי RPE ללא זיהום של תאים דמית העין או תאים מפני פסולת עצבי הרשתית. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול להקמת העכבר הראשי RPE תרבית תאים, לרבות קבלת העיניים של העכבר, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. פרוטוקול וידאו זה יהיה שימושי במיוחד עבור חוקרים שמתחילים לעבוד עם העכבר הראשי RPE תרבויות, צריכים הדרכה על הטכניקות לנתיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת פיטסבורג
1. מכינים פתרונות
- להכין את מדיום הגידול על ידי וחדשניות Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), גלוקוז גבוהות עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מ מגלוטמין ו 1 x MEM שאינן חיוניות חומצות אמינו. לחמם את המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס החממה לפני השימוש.
- להכין 2% (wt/כרך) dispase II הפתרון עובד:
- להכין פתרון מניות של 100 מ"ג/מ"ל dispase השני על ידי המסת 30 מ"ג של dispase השני בתוך 300 µL HEPES באגירה תמיסת מלח (50 מ מ HEPES/קו pH 7.4, 150 מ מ NaCl). אמצעי אחסון זה עבור 3-4 עכברים, שניתן יהיה גודלו או למטה בהתבסס על מספר עכברים לניסוי). מלאי זה ניתן לאחסן לפחות שבוע 1-4 מעלות צלזיוס.
- להכין הפתרון עובד של 2% dispase על-ידי הוספת µL 300 של 100 מ"ג/מ"ל dispase II המניה 1.2 מ של DMEM סטרילי, גלוקוז גבוה וסינון הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.22. שלב זה יש לבצעו בזרם שכבתית ארון בתנאים סטריליים. לחמם את dispase מוכן II ב- 37 מעלות צלזיוס החממה לפני השימוש.
2. קבלת בעיניים העכבר
- המתת חסד העכבר באמצעות כל שיטה שאושרו ומניחים אותו על רכיב pad סופג.
- לבש כפפות, לשים באגודל ובאצבע סביב העין, דחף בעדינות את העור כדי proptose גלגל העין.
- הוסף את קצה מספריים בזווית שבין העור של גלגל העין, בזהירות לחתוך את העין. כדי למנוע זיהום, בקצרה לטבול את העין ב-70% אתנול.
- מיד במקום העין ב באגירה פוספט מלוחים (מגניב) בצלחת פטרי.
- חזור על שלבים 2.2-2.4 כדי להסיר את העין השנייה.
3. עין לנתיחה
- בזהירות הסר רקמת העין תחת המיקרוסקופ ויבתר. זה יכול להיעשות PBS או על הפטרי יבש.
- להשתמש מלקחיים הפתולוגיים כדי להרים את רקמות החיבור של גלגל העין, לגזור אותם באמצעות מספריים Vannas. Not גזור את sclera כי זה כמעט בלתי אפשרי להשיג את eyecups האחורי שלם אם חותכים את sclera.
- לאחר ניקוי רקמת חיבור, לשמור את העיניים וכתוצאה מכך ב- PBS לשלב הכביסה הבא.
הערה: כל השלבים הבאים יש לבצעו בזרם שכבתית ארון בתנאים סטריליים.
- לשטוף את העיניים פעמיים ב מראש ומחוממת 37 ° C DMEM (גלוקוז גבוהה). להעביר בזהירות את העיניים לתוך ומחוממת מראש 37 ° C DMEM (גלוקוז גבוהה) באמצעות מלקחיים. מחוק לגמרי את העיניים בינוני והעברת לבינונית טריים בקערה חדשה.
- האחות DMEM (גלוקוז גבוהה) בינוני, דגירה העיניים שבה הפתרון עובד II ומחוממת מראש dispase 2% (wt/כרך) למשך 45 דקות בחממה 37 º C.
הערה: בתוך כל השלבים הבאים, במקום ולטפל עיניים או eyecups במצע הגידול, אשר להגן על הרקמות, לספק מדיום טוב הקרע. - הסר את הפתרון השני dispase, לשטוף את העיניים פעמיים בתוך מדיום הגידול על-ידי כ רפה בעברית המדיום הישן והוספת מדיום הגידול מראש ומחוממת-37 ° C החדשה (איור 1 א').
הערה: לאחר דיסוציאציה מאת dispase II, העיניים הופכים רכים. - . תחזיק את העין עם מלקחיים, בחתך סביב serrata אורה של כל עין בעזרת מספריים Vannas תחת המיקרוסקופ ויבתר להציב את זרימה שכבתית בארון.
- שמירה על גלגל העין בפתרון, הסר בזהירות הקרנית הקדמי על ידי הרחבת החתך סביב המעגל serrata אורה ומושך הקרנית הקדמי משם אחרי החתך כבר מלאה.
- הסר עדשה כמוסה של איריס המשויך פיגמנט האפיתל על ידי בעדינות משיכתן אל מחוץ עיינית עם מלקחיים teethed (איור 1b, 1 c).
- דגירה של eyecups אחורי שנוצר במצע הגידול למשך 20 דקות ב 37 ° C כדי להקל על הפרידה של הרשתית עצבית RPE.
- חותכים את eyecups אחורי 4 עלי כותרת מתחת למיקרוסקופ ויבתר להציב את זרימה שכבתית בארון. החתכים צריך להיות מספיק זמן לשטח את עיינית, אבל קצר מספיק כדי לשמור על הכותרת מחוברים (איור 1 d).
- לרדד את עיינית ולהסיר את הרשתית עצבית על ידי בעדינות משיכתו עם מלקחיים תוך החזקת הנותרים RPE-שכבה דמית-בסקלרה מתחם עם מלקחיים אחר (איור 1e). התחילו למשוך מהקצוות, ולא מן המרכז.
- העברת שכל רקמות חתוכות לרבעים לתוך תבשיל תרבות סטרילי חדש מלא מראש חימם מדיום הגידול 37 º C.
4. בידוד תאי RPE ראשי
- מחזיקים עלה כותרת אחד של המתחם RPE-שכבה דמית-בסקלרה חתוכות לרבעים עם בסדר סופר מלקחיים, לקלף בעדינות בין יריעות RPE. ללא פגע מן קרום המרתף המשמש כבסיס (הממברנה של ברוך) באמצעות סכין סהרון המיקרוכירורגית תחת המיקרוסקופ ויבתר להציב אותם זרימה שכבתית cabinet (איור 1f).
- להעביר את הסדינים RPE לתוך המנה סטרילי תרבות חדשה המכילה מדיום הגידול על-ידי שימוש micropipette P200. בעת העברת גליונות RPE, להרטיב את הטיפים פיפטה עם מדיום הגידול על-ידי pipetting מספר פעמים כדי למנוע רקמת נשאר בפנים הטיפ. RPE יהיה ניתן להבחנה ברורה מן דמית העין: RPE נראה יותר חום, בעוד שכבה דמית כהה יותר, נראה דביק ורך.
- לחלופין, השתמש עיכול אנזימטי דיסוציאציה עדין ללא מלקחיים כדי לנתק את RPE מן דמית העין14.
- לכבס את המצעים RPE 2 - 3 פעמים באמצעות מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס מדיום הגידול בצלחת תרבות סטרילי. לאחר כל שלב כביסה, בזהירות לאסוף את הסדינים RPE תוך הימנעות לרקמות אחרות כגון פסולת הרשתית או דמית העין. בסוף בכביסה האחרונה לאסוף את הסדינים RPE עם micropipette P200 ולמקם אותם בצינור microcentrifuge של 1.5 mL החדש.
הערה: יש צורך centrifuge את הסדינים RPE: הם יהיו משקעים על ידי הכבידה בתוך 1 דקות. - הסר את מדיום הגידול הנוסף באמצעות micropipette P200. Resuspend התאים מדיום הגידול מראש ומחוממת טריים, בעדינות triturate אותם באמצעות micropipette P200. למנוע היווצרות בועות. השעיה תא בודד הוא אידיאלי, אך גם להימנע trituration מדי, אחרת תאי RPE אינם מסוגלים לשרוד. אנו ממליצים מאוד בעדינות trituration 40 - 50 פעמים.
5. culturing תאי RPE
- צלחת את התאים על צלחת תרבות.
- אם יישומים במורד הזרם של תאי RPE דרוש לשמירת הקוטביות שלהן, צלחת RPE תאים של עכברים 2 ב 12 מ מ אחד ממברנה פוליאסטר הוספה טעון מראש ב 12-ובכן תרבות צלחות. ציפוי התאים-צפיפות גבוהה רצוי כי במקרה זה תאי RPE מסוגלים לשמור את המאפיינים המקוריים, כגון צורת משושה פיגמנטציה.
- אין להעביר את הצלחת או לשנות את מדיום הגידול עבור ה 72 הראשון של culturing. לאחר 3 ימים, החלף את המדיום הישן עם מדיום הגידול מראש ומחוממת טריים. לאחר מכן לשנות את המדיום תרבות בכל יום אחר. ברגע תאי RPE confluency, להפחית את FBS במדיום גידול ל- 2%.
הערה: התאים ניתן לפצל באמצעות טריפסין 0.25%. עם זאת, לאחר פיצול התאים עלול לאבד שלהם צורת משושה, פיגמנטציה, הקטעים הבאים. אנו לא ממליצים פיצול התאים, אך אם הדבר נדרש על-ידי היישומים במורד הזרם של התרבות, עליך לזכור כי התאים ראשי לא יכול להיות passaged ללא הגבלת זמן: הם ידועים דה-להבדיל לאחר 5-7 קטעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העכבר הראשי RPE התרבות נוצרו מ- 2 עכברים ב 12 מ מ ממברנה פוליאסטר הוספה מגיע ל 90-95% confluency לאחר שבוע 1 בתרבות. לאחר 2 שבועות של תרבות, התאים הגיעו 100% confluency והתחלתי ליצור פסיפס של תאים משושה, פיגמנט ו- bi-nucleated. על ידי 3 שבועות של תרבות, התאים המשיך כדי ליצור את הצורה והסגנון של פיגמנטציה, עם זאת, לאחר 4 שבועות חלק התאים יש hyperpigmented (איור 2).
טוהר התרבות תאי RPE ראשי יכול להיות מוערך על ידי immunostaining באמצעות נוגדן RPE65 (retinoid isomerohydrolase, אנזים חיוני במחזור חזותי חוליות המאפשרת את ההמרה של כל-טרנס-retinyl אסטרים 11-cis-רטינול במהלך phototransduction) (איור 3, אדום). ניתן להדגים את תקינות צמתי לתא ואת נוכחותם של צורת משושה באמצעות phalloinin מכתים (איור 3, ירוק). בנוסף, ביטוי של זואי-1 חלבון, מרכיב חשוב של צמתי צר, הניתנים לאימות באמצעות המערבי סופג (איור 4) או immunostaining.
התוצאות שלנו להפגין כי התרבויות RPE העיקרי שהושג העכבר מסוגלים להתרבות, שומרים על פיגמנטציה, צורת משושה, צמתי צר, ולבטא את סמני פונקציונליים כגון RPE65.
איור 1 . שלבים שונים של העין ביתור להשיג RPE ראשי תא תרבויות. () לאחר דיסוציאציה ב 2% dispase, רוחץ את העין מדיום הגידול. (b) עיינית האחורי מתקבל על ידי הסרת את הקרנית ואת העדשה. (ג) עיינית וכתוצאה מכך מנוקה עוד יותר על-ידי הסרת הקשתית המשויך פיגמנט האפיתל. (ד) לאחר נוסף הדגירה במדיום הגידול, עיינית נחתך בצורה רדיאלית ליצירת הגזרות. (ה) הרשתית עצבית קולפה מהמתחם RPE-שכבה דמית-בסקלרה הנותרים. (נ) RPE הסדינים מופרדים בעדינות הממברנה של ברוך. שים לב כי RPE נראה יותר חום (חיצים), בעוד דמית העין הוא כהה יותר ודביק מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . תאי RPE העיקרי של עכבר 3 - בן שבועיים תרבותי על הוספה ממברנה פוליאסטר 12 מ מ טעון מראש ב 12-ובכן תרבות צלחות. העכבר הראשי RPE התרבות נוצרו מ- 2 עכברים ב 12 מ מ ממברנה פוליאסטר הוספה מגיע ל 90-95% confluency לאחר שבוע 1 בתרבות (א). לאחר 2 שבועות של תרבות, התאים הגיעו confluency 100% והחל ליצור פסיפס של תאים משושה, פיגמנט, דו-nucleated (b). על ידי 3 שבועות של התרבות התאים המשיך כדי ליצור את הצורה והסגנון של פיגמנטציה (c), עם זאת, לאחר 4 שבועות חלק של תאים יש hyperpigmented (d). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . סמן תאי RPE, RPE65, הוא לזיהוי תאי RPE העכבר הראשי. תאי RPE העכבר הראשי לאחר 4 שבועות של תרבות קבוע ב- 4% paraformaldehyde (PFA), מודגרות עם נוגדנים RPE65 או מאגר חסימה של הפקד שלילי (NC). Phalloidin (ירוק) ודאפי (כחול) נוספו גם מכתים את קרום התא ואת הגרעינים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . דה מרקר של צמתי צר, זואי-1 מתבטאת תאי RPE העיקרית. תאי RPE העכבר הראשי (mRPE) נבצרו לאחר 3 שבועות של התרבות, µg 8 של התא lysate היה לרוץ על אבן חשופה המערבי. הסכום המקביל של תאי ARPE-19 (זמינים מסחרית יציב RPE תא קו) שימשו כפקד שלילי. זואי-1 היה ביטוי מאוד תאי RPE העיקרי בזמן שנעדרתי, מתאי ARPE-19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול מפורט הציג מאפשרת הקמת אמין של העכבר הראשי תרבויות RPE להגיע confluency לאחר שבוע 1, להציג את מאפייני RPE העיקריים כגון צורת משושה פיגמנטציה לאחר 2 שבועות. תאי RPE שהושג יכול לשמש עבור מספר יישומים במורד הזרם כגון חילוף החומרים ויטמין A9, phagocytosis של מקטעי החיצוני קולט אור10 ו- תחבורה יון11, תאים אפיתל קוטביות2, lysosomal הומאוסטזיס, autophagy12,13. בהתאם ליישום במורד הזרם, המורפולוגיה של התרבויות נגזר הניתנים לאימות על ידי שידור, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כפי שמתואר פירוט במקום14. מבחני נוספים כדי להדגים ההבשלה של התרבויות עשויים לכלול את ההתנגדות החשמלית transepithelial (TEER) assay להפגין קוטביות של תאי RPE, מבחני חדירות4,22, בדיקות פונקציונליות (phagocytosis 23), כיפה היווצרות.
. מניסיוננו, התאים יותר הם מצופים היטב, טוב יותר confluency את, את גן # מושגים בסיסיים ב פרוטוקול זה, אנחנו נזרע תאי RPE מ שני עברים על אחד מוסיף 12 מ מ. עם זאת, זה גם אפשרי להכניס תאי RPE של עכברים 2 הוספה 6.5 מ מ אחד כדי לקבל יותר confluency ו- TEER. במחקרים רבים, הצלחות על תרביות תאים RPE הם מצופים Matrigel או laminin. לא ראינו הבדל משמעותי ב RPE תא הקובץ המצורף אלו כלי עם או בלי ציפוי. בנוסף, אחוז FBS במדיום תרבות עשוי להיות שונה כדי להשיג תוצאות טובות יותר. 10% FBS בדרך כלל טוב להגעה confluency, אבל יורד. ל פחות FBS נראה להיות מועיל עבור RPE בידול/התבגרות14,17.
המגבלה העיקרית של שיטה זו הוא הצורך בהכשרה מדויק של האדם לבצע את ניתוח העין על מנת להבטיח יעילות מרבית ההתאוששות תא RPE ללא זיהום צולב עם תאים שמקורם לרקמות אחרות עינית. למניעת זיהום צולב, החוקר צריך להתמחות השלב הקריטי של הליך זה: זהירות מתקלפת הרשתית ואחריה הפרדה מדויקת RPE דמית. הניתנים לאימות הטוהר של התרבויות שהושג באמצעות immunostaining RPE ספציפיים. מספר סמנים RPE זמינים עבור אפיון של התרבויות RPE, כולל גנים המעורבים ב מחזור חזותיים, מכשול, התחבורה פונקציה, חילוף החומרים, phagocytosis, ו melanogenesis15.
מגבלה נוספת הוא המספר של עיניים ניתן לעבד בו זמנית כדי להשיג את התרבויות. באופן כללי, לא מומלץ לעבוד עם יותר מ-2 עכברים בכל פעם. כדי להבטיח יכולת הקיום של תאי RPE, העיניים צריך להיות גזור מהר ככל האפשר. לאחר שהמשתמש להפוך למיומן יותר, זה אפשרי להתמודד עם עכברים יותר, לסירוגין הדגירה פעמים.
בסך הכל, פורסמו מספר שיטות לבסס העכבר הראשי RPE תרבויות3,14,15, עם זאת, בפעם הראשונה, אנו מציגים גירסה וידאו של הפרוטוקול המלא. פרוטוקול זה יכול לשמש הדרכה על טכניקות ניתוח עיניים. עם זאת, האיזון האופטימלי בין מהירות גבוהה דיוק נדרש רוברט יכולה להיות מושגת רק עם תרגול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DS קיבל מחקר מימון Bayer HealthCare, גרמניה ו פ הופמן-La Roche, שוויץ. המחברים הנותרים להכריז אין אינטרסים כלכליים מתחרים. עבודה זו נתמכת על ידי מחקר כדי למנוע עיוורון (מוגבל מענקים וילמר העין המכון, אוניברסיטת פיטסבורג). עבודה זו נתמכת גם כספים סטארט-אפ ל DS עיניים, אוניברסיטת פיטסבורג.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן BrightFocus (ל- DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
