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Biology

माउस रेटिना वर्णक उपकला से प्राथमिक सेल संस्कृतियों

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56997
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

रेटिना वर्णक उपकला (RPE) आँख का एक बहु-कार्यात्मक उपकला है. यहां हम प्राथमिक कोशिका murine RPE से व्युत्पंन संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

रेटिना वर्णक उपकला (RPE) तंत्रिका रेटिना और आँख की धमनियां के बीच स्थित है कि एक अत्यधिक ध्रुवीकरण बहु-कार्यात्मक उपकला है. यह pigmented कोशिकाओं है कि षट्कोण पैक और तंग जंक्शनों से जुड़े रहे हैं की एक एकल पत्रक है । RPE के मुख्य कार्य प्रकाश का अवशोषण शामिल हैं, शेड के phagocytosis photoreceptor बाहरी क्षेत्रों, आयनों के स्थानिक बफ़रिंग, पोषक तत्वों, आयनों और पानी के परिवहन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दृश्य चक्र में सक्रिय भागीदारी. इस तरह के महत्वपूर्ण और विविध कार्यों के साथ, यह गंभीर रूप से RPE कोशिकाओं के जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । RPE सेल लाइनों की एक संख्या स्थापित किया गया है; हालांकि, पारित और अमर कोशिकाओं को जल्दी से प्राकृतिक RPE कोशिकाओं के रूपात्मक और शारीरिक विशेषताओं में से कुछ खोने के लिए जाना जाता है । इस प्रकार, प्राथमिक कोशिकाओं RPE सेल जीवविज्ञान और समारोह के विभिंन पहलुओं का अध्ययन करने के लिए और अधिक उपयुक्त हैं । माउस प्राथमिक RPE सेल संस्कृति शोधकर्ताओं के लिए बहुत उपयोगी है के बाद से माउस मॉडल व्यापक रूप से जैविक अध्ययन में उपयोग किया जाता है, लेकिन माउस से RPE कोशिकाओं का संग्रह भी बहुत उनके छोटे आकार के कारण चुनौतीपूर्ण है । यहां, हम प्राथमिक माउस RPE सेल संस्कृतियों जो enucleation और आंखों और RPE शीट के अलगाव के संवर्धन के लिए कोशिकाओं को उपज शामिल है की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । इस विधि कुशल सेल वसूली सक्षम बनाता है । दो चूहों से प्राप्त RPE कोशिकाओं १ १२ मिमी पॉलिएस्टर झिल्ली पर प्रवाह में पहुंच सकते हैं संस्कृति के एक सप्ताह के बाद संस्कृति प्लेट में पूर्व लोड डालने और दो के बाद इस तरह के षट्कोण आकार और रंजकता के रूप में बोनाी RPE कोशिकाओं के मूल गुण के कुछ प्रदर्शन संस्कृति के सप्ताह ।

Introduction

रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के तंत्रिका रेटिना और आँख की धमनियां के बीच स्थित है कि ध्रुवीकरण उपकला कोशिकाओं की एक एकल परत है. RPE कोशिकाओं की कार्यक्षमता और RPE monolayer की अखंडता दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि RPE कई प्रक्रियाओं में एक प्रमुख भूमिका निभाता है जैसे बाहरी रक्त रेटिना बाधा, पानी और रेटिना और आयनों के बीच परिवहन को बनाए रखने के रूप में रंजित, प्रकाश अवशोषण, ऑक्सीडेटिव तनाव से संरक्षण, रेटिनॉइड चयापचय के नियंत्रण, और photoreceptors के बाहरी क्षेत्रों के phagocytosis1,2. आंखों के पीछे RPE के स्थान, साथ ही साथ अपनी बाधा समारोह को रोकने दवाओं अवलेह हास्य को रक्त से गुजर से प्रणालीबद्ध प्रशासित, यह मुश्किल vivo मेंRPE समारोह की जटिलता का अध्ययन करने के लिए करते हैं । इस प्रकार, एक लचीला, नियंत्रित पर्यावरण3,4में RPE कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए RPE सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक बड़ी जरूरत है ।

स्थापित RPE सेल लाइनों के एक नंबर मौजूद हैं, प्राप्त करने और कोशिकाओं को भंडारण का एक आसान और सुविधाजनक तरीका प्रदान; हालांकि, मार्गीय कोशिकाओं को प्राथमिक कोशिकाओं2,3,4की तुलना में कुछ नुकसान है । सबसे पहले, वे अक्सर कक्ष आकृति विज्ञान में परिवर्तन की विशेषता है । उदाहरण के लिए, मौजूदा सेल लाइनों में से कोई भी सेल ध्रुवीकरण phenotype और तंग जंक्शनों के आंशिक गायब होने के नुकसान के कारण RPE बाधा संपत्तियों के एक विश्वसनीय अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं पाए गए4। ध्रुवीकरण और उचित सेल-टू-सेल कनेक्शन के नुकसान के अलावा, RPE सेल लाइनों जल्दी से वयस्क RPE में कुंजी melanogenesis एंजाइमों के अभाव के कारण उनके रंजकता खो5। रंजकता बहाल किया जा सकता है, लेकिन पुनः के तंत्र के व्यापक विश्लेषण-रंजकता जो संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और रासायनिक परख के लिए मेलेनिन की उपस्थिति की पुष्टि शामिल होगा कभी नहीं 6प्रदर्शन किया गया । एक और सीमा है कि RPE सेल लाइनों सेल जीवन बढ़ाया है (कभी-अमरता) और कुछ शर्तों के तहत स्वयं में बदल सकते है multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि सब्सट्रेट और फार्म फ्लोटिंग कालोनियों से अलग है7-नवीकरण, 8. यह सीमा प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए असंभव बना देता है3.

स्थापित RPE सेल लाइनों के नुकसान को ध्यान में रखते हुए, प्राथमिक RPE कोशिका संस्कृतियों ताजा ऊतकों से प्राप्त एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक मॉडल के रूप में सेवा के लिए RPE का अध्ययन कर सकते हैं । प्राथमिक RPE कोशिकाओं न केवल विटामिन ए चयापचय के रूप में RPE-विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है9, photoreceptor बाहरी क्षेत्रों की10 और आयन परिवहन11, लेकिन यह भी उपकला जैसे बुनियादी कोशिका जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए phagocytosis सेल ध्रुवीयता2 , lysosomal homeostasis, और autophagy12,13।

पिछले कुछ वर्षों में वहां प्राथमिक RPE संस्कृतियों की स्थापना पर प्रकाशनों के एक नंबर रहे हैं, अनुसंधान के इस क्षेत्र में एक बढ़ती रुचि का संकेत है3,14,15। मानव RPE कोशिकाओं और गोजातीय और सुअर का RPE कोशिकाओं के रूप में गैर मानव RPE कोशिकाओं के लिए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए थे 16, 17, 18, 19. हालांकि, यह उनके बहुत छोटे आकार के कारण माउस RPE कक्षों को हैंडल करने के लिए अधिक कठिन है । हालांकि प्रकाशनों की काफी संख्या के लिए माउस14,20,21से RPE कोशिकाओं को अलग प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, वहां अभी भी कई के बिना RPE कोशिकाओं को अलग करने के लिए संघर्ष कर रहे है शोधकर्ताओं रंजित कोशिकाओं या तंत्रिका रेटिना मलबे से कोशिकाओं की संदूषण । यहां हम प्राथमिक माउस RPE सेल संस्कृति की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान, माउस से आंखें प्राप्त करने, आंखों के विच्छेदन और RPE शीट के अलगाव के लिए संवर्धन के लिए कोशिकाओं उपज शामिल है । इस वीडियो प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो माउस प्राथमिक RPE संस्कृतियों के साथ काम शुरू कर रहे है और विच्छेदन तकनीक पर मार्गदर्शन की जरूरत के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा ।

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Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है

1. समाधान तैयार करें

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 2.5 mM L-glutamine, और 1x मेम अनावश्यक अमीनो एसिड के साथ उच्च ग्लूकोज का सप्लीमेंट द्वारा विकास माध्यम तैयार करें । पूर्व का उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में मीडिया गर्म ।
  2. 2% (wt/vol) dispase द्वितीय कार्य समाधान तैयार करें:
    1. dispase द्वितीय के 300 µ l HEPES में 30 मिलीग्राम भंग करके 100 मिलीग्राम/एमएल dispase द्वितीय के शेयर समाधान तैयार (50 मिमी HEPES/कोह पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl) । यह मात्रा 3-4 चूहों के लिए है, इसे प्रयोग के लिए चूहों की संख्या के आधार पर ऊपर या नीचे स्केल किया जा सकता है) । इस शेयर को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम 1 हफ्ते के लिए स्टोर किया जा सकता है ।
    2. 100 मिलीग्राम/एमएल dispase द्वितीय शेयर की 1.2 मिलीलीटर बाँझ DMEM, उच्च ग्लूकोज और एक 0.22 µm फिल्टर के माध्यम से समाधान छानने के लिए 300 µ एल जोड़कर 2% dispase के काम समाधान तैयार करें । यह कदम बाँझ शर्तों के तहत लामिना फ्लो कैबिनेट में किया जाना चाहिए । पूर्व का उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में तैयार dispase द्वितीय गर्म ।

2. माउस आंखें प्राप्त करना

  1. Euthanize किसी भी अनुमोदित विधि का उपयोग कर माउस और यह एक शोषक पैड पर जगह है ।
  2. दस्ताने पहने हुए, आंख के चारों ओर अंगूठे और तर्जनी उंगली रखो और धीरे से त्वचा को धक्का गोलक proptose ।
  3. त्वचा और आंखों के बीच angled कैंची की नोक डालें और ध्यान से बाहर आंख में कटौती । संक्रमण से बचने के लिए, संक्षेप में 70% इथेनॉल में आंख डुबकी ।
  4. तुरंत एक पेट्री डिश में फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में आंख जगह है ।
  5. दोहराएं कदम 2.2-2.4 दूसरी आंख को हटाने के लिए ।

3. नेत्र विच्छेदन

  1. ध्यान से संयोजी ऊतक को हटाने के लिए आंख के नीचे के रूप में । यह या तो पंजाब में या सूखी पेट्री डिश पर किया जा सकता है ।
    1. का प्रयोग करें suturing संदंश गोलक से संयोजी ऊतक उठा और उंहें काट बाहर Vannas कैंची का उपयोग कर । क्योंकि यह व्यावहारिक रूप से बरकरार पीछे eyecups अगर श्वेतपटल काट रहा है प्राप्त करने के लिए असंभव है श्वेतपटल कटौती मत करो ।
    2. संयोजी ऊतक सफाई के बाद, अगले धुलाई कदम के लिए पंजाब में आने वाली आंखों रखने के लिए ।
      नोट: सभी निम्न चरणों बाँझ शर्तों के तहत लामिना प्रवाह कैबिनेट में किया जाना चाहिए.
  2. पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस DMEM (उच्च ग्लूकोज) में दो बार आंखों को धो लें । ध्यान से पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस DMEM (उच्च ग्लूकोज) संदंश का उपयोग में आंखों का हस्तांतरण । महाप्राण को एक नई डिश में ताजा माध्यम के लिए मध्यम और हस्तांतरण आंखों ।
  3. महाप्राण DMEM (उच्च ग्लूकोज) मध्यम और पूर्व में आंखें गर्म 2% (wt/vol) dispase द्वितीय 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में 45 मिनट के लिए काम समाधान ।
    नोट: सभी निंनलिखित चरणों में, जगह और वृद्धि के माध्यम में आंखें या eyecups में हेरफेर, जो ऊतक की रक्षा और विच्छेदन के लिए एक अच्छा माध्यम प्रदान करेगा ।
  4. dispase II समाधान निकालें और पुराने माध्यमों को aspirating करके और नए पूर्व-उष्ण 37 ° c वृद्धि मध्यम (चित्र 1a) को जोड़ते हुए, विकास माध्यमों में दो बार आंखों को धोएं ।
    नोट: dispase द्वितीय द्वारा पृथक्करण के बाद, आंखों नरम हो जाते हैं ।
  5. संदंश के साथ आँख पकड़ो और एक चीरा लामिना प्रवाह कैबिनेट में रखा विदारक माइक्रोस्कोप के तहत Vannas कैंची का उपयोग कर प्रत्येक आँख के ora serrata के आसपास बना ।
    1. गोलक को हल में रखते हुए, ध्यान से पूर्वकाल कॉर्निया को ora serrata परिधि के चारों ओर काट कर दूर कर दें और कटौती पूर्ण होने के बाद पूर्वकालिक कॉर्निया खींच कर चले जायें ।
    2. लेंस कैप्सूल और संबद्ध आईरिस pigmented उपकला निकालें धीरे से उन्हें बाहर खींच द्वारा eyecup के साथ दांतों संदंश (चित्र 1b, 1c).
  6. RPE से तंत्रिका रेटिना की जुदाई की सुविधा के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए विकास माध्यम में जिसके परिणामस्वरूप पीछे eyecups की मशीन ।
  7. लामिना फ्लो कैबिनेट में रखा विदारक माइक्रोस्कोप के तहत 4 पंखुड़ियों में पीछे eyecups कट. कटौती eyecup समतल करने के लिए काफी लंबा होना चाहिए, लेकिन काफी कम पंखुड़ियों (चित्रा 1 डी) जुड़ा रखने के लिए ।
    1. eyecup समतल और तंत्रिका रेटिना को दूर बहुत धीरे से यह संदंश के साथ खींच जबकि शेष RPE-रंजित-श्वेतपटल एक और संदंश (चित्रा 1e) के साथ जटिल पकड़ । केंद्र से बजाय किनारों से खींच शुरू करते हैं ।
  8. एक नया बाँझ संस्कृति पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस विकास माध्यम से भरा पकवान में सभी चौथाई ऊतकों स्थानांतरण ।

4. प्राथमिक RPE कोशिकाओं का अलगाव

  1. सुपर ठीक संदंश के साथ क्वार्टर RPE-रंजित-श्वेतपटल परिसर की एक पत्ती होल्डिंग, धीरे से अंतर्निहित तहखाने झिल्ली (Bruch की झिल्ली) विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक microsurgical वर्धमान चाकू का उपयोग करके से RPE की बरकरार चादरें छील लामिना फ्लो कैबिनेट (फिगर 1f) में रखा गया है.
    1. एक P200 micropipette का उपयोग करके विकास माध्यम युक्त नए बाँझ संस्कृति पकवान में RPE शीट स्थानांतरण. जब RPE चादरें स्थानांतरित, गीला विकास माध्यम के साथ पिपेट सुझावों को कई बार pipetting द्वारा टिप के अंदर चिपके से ऊतक को रोकने के लिए । RPE रंजित से स्पष्ट रूप से अलग हो जाएगा: RPE अधिक भूरा लग रहा है, जबकि धमनियां गहरा है और चिपचिपा और शराबी लग रहा है ।
    2. वैकल्पिक रूप से, एंजाइमी पाचन और कोमल पृथक्करण संदंश के बिना उपयोग करने के लिए RPE से रंजित14अलग ।
  2. RPE शीट धो 2-3 बार बाँझ संस्कृति पकवान में पूर्व गर्म 37 ° c विकास माध्यम का उपयोग कर । प्रत्येक धोने के कदम के बाद, ध्यान से RPE शीट इकट्ठा जबकि अंय ऊतकों जैसे रेटिना मलबे या धमनियां से परहेज । पिछले धोने के अंत में एक P200 micropipette के साथ RPE शीट इकट्ठा और उंहें एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है ।
    नोट: कोई जरूरत नहीं है RPE चादरें केंद्रापसारक: वे 1 मिनट के भीतर गुरुत्वाकर्षण द्वारा तलछट होगा ।
  3. अतिरिक्त विकास मध्यम एक P200 micropipette का उपयोग कर निकालें । ताजा पूर्व गर्म विकास माध्यम में कोशिकाओं reसस्पेंड और धीरे उन्हें एक P200 micropipette का उपयोग कर triturate. बुलबुले के गठन से बचें । एक सिंगल सेल सस्पेंशन आदर्श होता है, लेकिन इसके अलावा बहुत ज्यादा trituration से भी बचना चाहिए, वरना RPE कोशिकाएं जीवित नहीं रह पाती हैं । हम बहुत धीरे 40 के लिए trituration-50 बार सलाह देते हैं ।

5. संवर्धन RPE कोशिकाओं

  1. थाली एक संस्कृति की थाली पर कोशिकाओं ।
    1. RPE कोशिकाओं के बहाव अनुप्रयोगों उनके ध्रुवीयता के बनाए रखने की आवश्यकता होती है, तो १ १२ मिमी पॉलिएस्टर झिल्ली में 2 चूहों से RPE कोशिकाओं प्लेट डालने पूर्व 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में भरी हुई । उच्च घनत्व पर कोशिकाओं चढ़ाना वांछित है क्योंकि उस मामले में RPE कोशिकाओं षट्कोण आकार और रंजकता के रूप में मूल गुण, रखने में सक्षम हैं ।
  2. संवर्धन के पहले 72 ज के लिए प्लेट न ले जाएं या ग्रोथ मीडियम को बदल कर रखें । 3 दिनों के बाद, पुराने माध्यम को ताजा पूर्व गर्म विकास माध्यम के साथ बदलें । उसके बाद संस्कृति माध्यम हर दूसरे दिन बदल जाते हैं. एक बार RPE कोशिकाओं को प्रभावित हो, विकास मध्यम में FBS को कम करने के लिए 2% ।
    नोट: कक्ष 0.25% trypsin का उपयोग कर विभाजित किया जा सकता है । हालांकि, बंटवारे के बाद कोशिकाओं को बाद के मार्ग में अपने षट्कोण आकार और रंजकता खो सकते हैं । हम विभाजन कोशिकाओं की सिफारिश नहीं है, लेकिन अगर यह संस्कृति के बहाव अनुप्रयोगों द्वारा की आवश्यकता है, ध्यान रखें कि प्राथमिक कोशिकाओं को अनिश्चित काल के पारित नहीं किया जा सकता है: वे de-5-7 मार्ग के बाद अंतर करने के लिए जाना जाता है ।

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Representative Results

माउस प्राथमिक RPE संस्कृति 12 मिमी पॉलिएस्टर झिल्ली डालने में 2 चूहों से स्थापित 90-95% संस्कृति में 1 सप्ताह के बाद प्रवाह तक पहुँचता है. संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को 100% प्रवाह तक पहुंच और षट्कोण, pigmented, और द्वि-nucleated कोशिकाओं के एक मोज़ेक बनाने के लिए शुरू कर दिया । संस्कृति के 3 सप्ताह तक, कोशिकाओं को आकार और रंजकता के रूप में जारी रखा है, तथापि, 4 सप्ताह के बाद कोशिकाओं के एक हिस्से hyperpigmented (चित्रा 2) मिला है ।

प्राथमिक RPE कोशिका संस्कृति की पवित्रता RPE65 एंटीबॉडी (रेटिनॉइड isomerohydrolase, हड्डीवाला दृश्य चक्र है कि सभी ट्रांस-retinyl एस्टर के रूपांतरण के लिए सक्षम बनाता है में एक महत्वपूर्ण एंजाइम का उपयोग कर immunostaining द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता 11-सीआईएस-retinol के दौरान phototransduction) (चित्र 3, लाल) । सेल के लिए सेल जंक्शनों की अखंडता और षट्कोण आकार की उपस्थिति phalloinin धुंधला (चित्रा 3, हरा) का उपयोग करके प्रदर्शन किया जा सकता है । इसके अलावा, ZO-1 प्रोटीन, तंग जंक्शनों के एक महत्वपूर्ण घटक की अभिव्यक्ति, पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 4) या immunostaining का उपयोग कर मान्य किया जा सकता है ।

हमारे परिणाम प्रदर्शित करता है कि प्राप्त माउस प्राथमिक RPE संस्कृतियों पैदा करना करने में सक्षम हैं, रंजकता, षट्कोण आकार और तंग जंक्शनों बनाए रखने, और RPE65 के रूप में कार्यात्मक मार्करों व्यक्त करते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 . नेत्र विच्छेदन के विभिंन चरणों प्राथमिक RPE सेल संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए । (क) 2% dispase में पृथक्करण के बाद, आंख विकास माध्यम में धुल जाती है । (ख) पीछे eyecup कॉर्निया और लेंस को हटाने के द्वारा प्राप्त की है । (ग) परिणामी eyecup आगे संबंधित आईरिस pigmented उपकला निकाल कर साफ किया जाता है । (घ) विकास माध्यम में आगे की मशीनीकरण के बाद, eyecup का चक्र उत्पन्न करने के लिए रेडियल कट है । (ङ) तंत्रिका रेटिना बंद शेष RPE-रंजित-श्वेतपटल परिसर से खुली है । (च) RPE चादरें धीरे Bruch की झिल्ली से अलग कर रहे हैं । ध्यान दें कि RPE अधिक भूरा (तीर) लग रहा है, जबकि रंजित गहरा और बहुत चिपचिपा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . एक 3 सप्ताह पुराने माउस से प्राथमिक RPE कोशिकाओं एक 12 मिमी पॉलिएस्टर झिल्ली पर कल्चरित सम्मिलित पूर्व 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में भरी हुई. माउस प्राथमिक RPE संस्कृति 12 मिमी पॉलिएस्टर झिल्ली डालने में 2 चूहों से स्थापित 90-95% संस्कृति में 1 सप्ताह के बाद प्रवाह (a) तक पहुँचता है । संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को 100% प्रवाह तक पहुंच और षट्कोण, pigmented और द्वि-nucleated कोशिकाओं (बी) की एक मोज़ेक बनाने के लिए शुरू कर दिया । द्वारा 3 संस्कृति के सप्ताह कोशिकाओं को आकार और रंजकता (सी) के रूप में जारी रखा है, तथापि, 4 सप्ताह के बाद कोशिकाओं के एक हिस्से hyperpigmented (डी) मिला है । स्केल बार: 100 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . RPE सेल मार्कर, RPE65, प्राथमिक माउस RPE कोशिकाओं में detectable है । प्राथमिक माउस RPE कोशिकाओं संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद 4% paraformaldehyde (पीएफए) में तय किया गया और या तो RPE65 एंटीबॉडी या अवरुद्ध बफर के रूप में नकारात्मक नियंत्रण (नेकां) के साथ मशीन । कोशिका झिल्ली और नाभिक के दाग से Phalloidin (हरा) और DAPI (नीला) भी जुड़ गए । स्केल बार: 100 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . तंग जंक्शनों के मार्कर, ZO-1 प्राथमिक RPE कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है । प्राथमिक माउस RPE कोशिकाओं (mRPE) संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद काटा गया था और सेल lysate के 8 µ जी एक पश्चिमी दाग पर चला गया था । अॅपे-19 कक्षों (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्थिर RPE कक्ष पंक्ति) की समतुल्य मात्रा नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग की गई । ZO-1 अत्यधिक अॅपे-19 कोशिकाओं से अनुपस्थित होने के दौरान प्राथमिक RPE कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रस्तुत विस्तृत प्रोटोकॉल माउस प्राथमिक RPE संस्कृतियों की विश्वसनीय स्थापना है कि 1 सप्ताह के बाद प्रवाह तक पहुंचने और 2 सप्ताह के बाद षट्कोण आकार और रंजकता के रूप में मुख्य RPE विशेषताओं वर्तमान सक्षम बनाता है । प्राप्त RPE कोशिकाओं ऐसे विटामिन के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक चयापचय9, photoreceptor बाहरी खंडों के phagocytosis10 और आयन परिवहन11, उपकला कोशिका ध्रुवीकरण2, lysosomal homeostasis, और autophagy12,13. बहाव आवेदन पर निर्भर करता है, व्युत्पंन संस्कृतियों की आकृति विज्ञान संचरण और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में14कहीं विस्तार से वर्णित द्वारा मान्य किया जा सकता है । अतिरिक्त परख संस्कृतियों की परिपक्वता को प्रदर्शित करने के लिए transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) परख शामिल हो सकते है RPE कोशिकाओं के ध्रुवीकरण का प्रदर्शन, पारगम्यता परख4,22, कार्यात्मक परीक्षण (phagocytosis 23) और डोम गठन ।

हमारे अनुभव में, अधिक कोशिकाओं है कि एक अच्छी तरह से, बेहतर प्रवाह और phenotype में चढ़ाया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, हम १ १२ mm आवेषण पर 2 चूहों से RPE कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त । हालांकि, यह भी बेहतर प्रवाह और तीळ प्राप्त करने के लिए एक 6.5 mm डालने में 2 चूहों से RPE कोशिकाओं डाल करने के लिए व्यवहार्य है । कई अध्ययनों में, RPE सेल संस्कृतियों के लिए प्लेटें Matrigel या laminin के साथ लेपित हैं । हम के साथ या कोटिंग के बिना इन जहाजों के लिए RPE सेल लगाव में एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा है । इसके अलावा, संस्कृति माध्यम में FBS का प्रतिशत बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । 10% FBS प्रवाह तक पहुंचने के लिए आम तौर पर अच्छा है, लेकिन कम FBS को छोड़ने के लिए RPE भेदभाव के लिए फायदेमंद लगता है/14,17।

इस विधि की मुख्य सीमा के लिए आंख विच्छेदन प्रदर्शन व्यक्ति के सटीक प्रशिक्षण के लिए की जरूरत है RPE कोशिका वसूली की अधिकतम दक्षता अंय नेत्र ऊतकों से व्युत्पंन कोशिकाओं के साथ पार संक्रमण के बिना सुनिश्चित करने के लिए । पार से बचने के लिए संदूषण, शोधकर्ता इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम गुरु चाहिए: सावधान दूर रंजित से RPE की सटीक जुदाई के बाद रेटिना छीलने । प्राप्त संस्कृतियों की पवित्रता को RPE-विशिष्ट immunostaining का प्रयोग करके मान्य किया जा सकता है. RPE मार्करों के एक नंबर दृश्य चक्र, बैरियर और परिवहन समारोह, चयापचय, phagocytosis, और melanogenesis15में शामिल जीन सहित RPE संस्कृतियों, के लक्षण वर्णन के लिए उपलब्ध हैं ।

एक और सीमा आंखों की संख्या है कि एक साथ संसाधित किया जा सकता है संस्कृतियों प्राप्त है । सामांय में, हम एक समय में 2 से अधिक चूहों के साथ काम करने की सिफारिश नहीं है । RPE कोशिकाओं की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, आंखों के रूप में जल्दी संभव के रूप में विच्छेदित किया जाना चाहिए । उपयोगकर्ता अधिक कुशल बनने के बाद, यह मशीन बार बारी से अधिक चूहों को संभालने के लिए संभव है.

कुल मिलाकर, तरीकों की एक संख्या प्राथमिक माउस RPE संस्कृतियों3,14,15की स्थापना पर प्रकाशित किया गया है, तथापि, पहली बार के लिए, हम पूरा प्रोटोकॉल का एक वीडियो संस्करण प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल आंख विच्छेदन तकनीक पर मार्गदर्शन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, उच्च गति और विच्छेदन के लिए आवश्यक परिशुद्धता के बीच इष्टतम संतुलन केवल अभ्यास के साथ प्राप्त किया जा सकता है ।

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Disclosures

डीएस को बायर हेल्थकेयर, जर्मनी और एफ Hoffmann-ला Roche, स्विट्जरलैंड से रिसर्च फंडिंग मिली है । शेष लेखक कोई प्रतिस्पर्धा नहीं वित्तीय हितों की घोषणा । यह काम करने के लिए अंधापन को रोकने के अनुसंधान द्वारा समर्थित है (Wilmer नेत्र संस्थान और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय को अप्रतिबंधित अनुदान) ।  इस काम को भी शुरू से नेत्र विज्ञान, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय से डी एस के लिए धन का समर्थन किया है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में आंशिक रूप से BrightFocus फाउंडेशन (डी एस) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
2~3-week old wildtype mice
Name Company Catalog Number Comments
reagents
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose GIBCO 11965092
Dispase II Sigma D4693
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F4135
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) GIBCO 15140122
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) GIBCO 11140050
Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 GIBCO 10010023
HEPES Cellgro 61-034
KOH Sigma-Aldrich 1310-58-3
NaCl Ambion AM9759
L-Glutamine (200 mM) GIBCO 25030-081
Ethyl Alcohol Fisher Scientific 111000200
RPE65 antibody A gift from Dr. Michael Redmond
Fluorescein Phalloidin                                                            Invitrogen F432
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568                     Invitrogen A11011            
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Invitrogen D1306
Paraformaldehyde (PFA) Polysciences, Inc 00380
ZO-1 Polyclonal Antibody ThermoFisher Scientific 40-2200
Name Company Catalog Number Comments
instruments and equipments
Laminar flow cabinet Baker SterilGARD SG403A
Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) Nikon SMZ1500
CO2 incubator with hot air sterilization Binder C150
Centrifuge Eppendorf 5702
Petri dishes Fisher Scientific 0875712
12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile Corning Incorporated COR-3460
Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp STEPHENS instruments S7-1320
Castroviejo suturing forceps 0.12mm Stroz Ophthalmic Instruments E1796
Crescent straight knife Beaver-Visitec International 373808
Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar World Precision Instruments 500233
Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard World Precision Instruments 500260
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGL0250S
Syringe, 5 mL BD 309632
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED  Leica 
Pipette Gilson
Barrier and non-filtered pipette tips Thermo Scientific

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References

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Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose,… More

Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, Jr., J. S., Sinha, D. Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (133), e56997, doi:10.3791/56997 (2018).

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