Summary
망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.
Abstract
망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 높은 편광된 다기능 상피가 이다. Hexagonally 포장 및 단단한 접속점에 의해 연결 된 색소 세포의 단일 시트입니다. RPE의 주요 기능은 시각적 사이클에 빛, 창 고 포토 리셉터 외부 세그먼트의 식 균 작용, 이온의 공간 버퍼링, 영양분, 이온 물 뿐만 아니라 적극적인 참여의 전송의 흡수를 포함 합니다. 이러한 중요 하 고 다양 한 기능, RPE 세포의 생물학 연구에 매우 중요입니다. RPE 세포 선의 수 설립 되었습니다; 그러나, passaged와 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 일부를 잃고 자연 RPE 세포의 형태학 적 및 생리 적 특성의 알려져 있습니다. 따라서 1 차 셀은 RPE 세포 생물학 및 기능의 다양 한 측면을 공부 하는 데 더 적합. 그러나 마우스 기본 RPE 세포 배양 연구원에 게 유용 이후 마우스 모델 생물학 연구에서 널리 이용 된다, 마우스에서 세포 수집 RPE는 또한 그들의 작은 크기 때문에 매우 도전. 여기, 선물이 enucleation 및 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리를 포함 하는 기본 마우스 RPE 세포 배양을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 메서드는 효율적인 셀 복구를 수 있습니다. 두 쥐에서 얻은 RPE 세포 문화와 디스플레이 일부 선의의 RPE의 원래 속성의 6 각형 모양 및 2 후 착 색 등 세포의 1 주 후 문화 접시에 사전 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 confluency를 도달할 수 있다 문화의 주.
Introduction
망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 편광 된 상피 세포의 층 이다. RPE 세포의 기능과 RPE 단층의 무결성 비전에 대 한 중요 하다는 RPE 외부 혈액 망막 방 벽, 물과 망막 사이의 이온의 수송을 유지 등 여러 프로세스에서 중요 한 역할을 담당 하기 때문에 고 맥락 막, 빛 흡수, 산화 스트레스, retinoid 대사의 제어 및 대뇌1,2의 외부 세그먼트의 식 균 작용 으로부터 보호 유리 체를 혈액에서 통과에서 체계적으로 관리 하는 마약 방지의 장벽 기능 뿐 아니라, 눈 뒤쪽 RPE의 위치는 RPE 기능에서 vivo에서의 복잡성을 연구 하기 어려울. 따라서, 유연 하 고, 제어 환경3,4RPE 세포 연구 RPE 세포 배양의 설립에 대 한 중대 한 필요가 있다.
설립 RPE 세포 선의 수 존재, 및 셀; 저장의 간단 하 고 편리한 방법을 제공 그러나, passaged 세포 1 차 셀2,,34에 비해 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 그들은 종종 세포 형태학에 있는 변화에 의해 특징은. 예를 들어 기존 셀 라인의 셀 극성 표현 형의 손실 및 단단한 접속점4의 부분 실종 RPE 장벽 속성의 신뢰할 수 있는 연구에 대 한 적합을 발견 했다. 극성 및 적절 한 셀에 셀 연결의 손실 뿐만 아니라 RPE 세포 선을 신속 하 게 성인 RPE5키 melanogenesis 효소의 부재로 인해 그들의 착 색을 잃게됩니다. 색소를 복원할 수 있습니다, 하지만 다시 염색 전송 전자 현미경 검사 법의 조합 포함의 메커니즘의 포괄적인 분석, 멜 라 닌의 존재를 확인 하 진 식 분석, 화학 분석 적 되어 수행된6. 한 가지 더 한계는 RPE 세포 라인 확장된 셀 생활 (때로는-불멸) 있고, 특정 조건에서 양식 식민지7, 부동 고 기판에서 분리 하는 자기 갱신 multipotent 줄기 세포로 변형 시킬 수 있다 8.이 제한 이식 실험3셀 라인 사용을 불가능 하 게.
설립된 RPE 세포 라인의 단점을 고려 하면 신선한 조직에서 얻은 기본 RPE 세포 배양 수는 RPE 공부를 좀 더 생물학적으로 관련 모델 역할을 합니다. 뿐만 아니라와 같은 비타민 A 대사9, 먹어서 포토 리셉터 외부 세그먼트10 이온의 수송11, RPE 특정 기능을 공부 뿐만 아니라와 같은 기본적인 세포 생물학 공부 기본 RPE 세포 사용 된 상피 세포 극성2 , lysosomal 항상성 그리고 autophagy12,13.
지난 몇 년간 수의 기본 RPE 문화에 게시 되었습니다, 연구3,,1415의이 지역에 있는 성장 관심사를 나타내는. 인간의 RPE 세포와 비 인간 RPE 세포 소 및 돼지 RPE 세포 등 수많은 프로토콜 했다 게시 된16,17,,1819. 그러나, 그들의 매우 더 작은 크기 때문에 마우스 RPE 세포를 처리 하기 위해 더 어렵습니다. 비록 꽤 간행물의 수는 마우스14,,2021에서 RPE 세포 격리 프로토콜, 지금도 많은 연구 없이 RPE 세포를 분리 하 고 투 맥락 막 셀 또는 셀 신경 망막에서의 오염. 여기 선물이 기본 마우스 RPE 세포 배양, 마우스, 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리에서 눈을 얻는 등을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 비디오 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 작업 필요 해 부 기법에 대 한 지침을 시작 하는 연구자에 대 한 특히 유용할 것 이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 주제와 관련 된 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 피츠버그 대학에 의해 승인
1. 준비 솔루션
- 성장 매체에 의해 보충 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린/스, 2.5 m L-글루타민, m 및 1 x 메모리 불필요 한 아미노산이 포도 당을 준비 합니다. 미리 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 미디어 따뜻한.
- 2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션을 준비:
- 300 µ L HEPES 버퍼링 염 분 (50 mM HEPES/코 pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dispase II의 30 mg를 용 해 하 여 100mg/mL dispase II의 재고 솔루션을 준비 합니다. 이 볼륨은 3-4 마우스에 대 한, 그것은 최대 크기를 조정 하거나 아래 실험을 위해 쥐의 수에 따라 수). 이 주식은 4 ° c.에 적어도 1 주 동안 저장 될 수 있다
- 살 균 DMEM, 높은 포도 당 및 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링의 1.2 mL dispase II 재고 100 mg/mL의 300 µ L을 추가 하 여 2 %dispase 작업 솔루션을 준비 합니다. 이 단계는 층 류 살 균 조건 하에서 캐비닛에서 수행 되어야 합니다. 미리 준비 된 dispase II 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 따뜻한.
2. 취득 마우스 눈
- 모든 승인 된 방법을 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 흡수 성 패드에 두십시오.
- 장갑, 입고 엄지와 검지로 눈 주위 넣고 부드럽게 피부 proptose 안구에 밀어.
- 피부와 안구 사이 각도 위 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 눈을 잘라. 오염을 방지 하려면 70% 에탄올에 눈을 찍어 잠시.
- 즉시 눈에는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 페 트리 접시에 놓습니다.
- 2.2-2.4 두 번째 눈을 제거 하려면 단계를 반복 합니다.
3. 눈 해 부
- 조심 스럽게 해 현미경 눈에서 결합 조직 제거. 이것은 건조 배양 접시 또는 PBS에 행 해질 수 있다.
- 봉합 집게를 사용 하 여 안구에서 결합 조직 고 욕실이 위를 사용 하 여 밖으로 그들을 잘라. 그것은 거의 경우에 공 막 잘라 그대로 후부 eyecups를 얻을 수 있기 때문에 여 sclera를 자르지 않는다.
- 결합 조직, 청소 후 다음 세척 단계에 대 한 PBS에 결과 눈알을 유지.
참고: 모든 다음 단계는 캐비닛 무 균 조건 하에서 층 류에서 수행 되어야 합니다.
- 미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 두 번 눈을 씻으십시오. 신중 하 게 미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 눈알 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 새로운 요리에 신선한 매체 매체 및 전송 눈알 발음
- DMEM (높은 혈당) 매체를 발음 하 고 37 ° C 배양 기에서 45 분을 위한 미리 데워 진된 2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션에 눈을 품 어.
참고: 다음 단계에 놓고 눈 조직을 보호 하 고 해 부에 대 한 좋은 매체를 제공 하는 성장 매체에서 eyecups를 조작 합니다. - Dispase II 솔루션을 제거 하 고 오래 된 매체를 발음 하 고 새로운 37 ° C에 미리 데워 진된 성장 매체 (그림 1a)를 추가 하 여 성장 매체에 두 번 눈을 씻고.
참고: dispase II에 의해 분리, 후 시선 될 부드러운. - 집게와 눈을 누른 층 류 캐비닛 배치 해 현미경 욕실이 위를 사용 하 여 각 눈의 오 라 참나무 주위 절 개 합니다.
- 솔루션에 안구 유지, 조심 스럽게 ora 참나무 둘레 컷을 확장 하 고 컷 완료 후 멀리 앞쪽 막 당기 앞쪽 각 막 제거.
- 부드럽게 teethed 집게 (그림 1b, 1c)으로 아이피에서 그들을 당겨 렌즈 캡슐과 관련 된 홍 채 색소 상피를 제거 합니다.
- RPE 신경 망막의 분리를 촉진 하기 위하여 37 ° C에서 20 분에 대 한 성장 매체에 결과 후부 eyecups를 품 어.
- 층 류 캐비닛 배치 해 현미경 4 꽃잎에 후부 eyecups 잘라. 인하 충분히 짧은 만큼 꽃잎을 연결 (그림 1의 d)를 유지 하지만 아이피를 평평 하 게 해야 합니다.
- 아이피를 평평 하 게 하 고 나머지를 잡고 집게와 매우 부드럽게 당겨 신경 망막 분리 RPE 맥락 막 sclera 복합 다른 집게 (그림 1e). 가장자리에서 보다 중심에서 철수 시작.
- 새로운 메 마른 문화 접시에 4 등분된 모든 조직으로 가득 전송 사전 37 ° C 성장 매체를 따뜻하게 합니다.
4입니다. 기본 RPE 세포의 고립
- 함께 4 등분 RPE 맥락 막 sclera 단지 보유 한 꽃잎 집게 슈퍼 파인, 부드럽게 해 현미경 microsurgical 초승달 모양의 칼을 사용 하 여 기본 지하실 막 (Bruch의 막)에서 RPE의 그대로 시트를 벗기다 층 류 캐비닛 (그림 1 층)에 배치.
- RPE 시트 P200 micropipette를 사용 하 여 성장 매체를 포함 하는 새로운 메 마른 문화 접시에 전송 합니다. RPE 시트를 전송할 때 여러 번 pipetting으로 성장 매체와 피 펫 팁을 젖은 조직 팁 내부 고정 하지 않도록. RPE 맥락 막에서 명확 하 게 구별할 수 있을 것입니다: RPE 보이는 더 갈색, 맥락 막 어두운 보이는 끈 적 하 고 무성 한 하는 동안.
- 맥락 막14RPE 분리 효소 소화와 집게 없이 부드러운 분리 또는 사용.
- 2-3 번 사용 하 여 미리 데워 진된 37 ° C RPE 시트 세척 살 균 배양 접시에 성장 매체. 각 세척 단계 후 신중 하 게 다른 조직 파편 망막 또는 맥락 막 등을 피하는 동안 RPE 시트를 수집 합니다. 마지막 세척의 끝에 P200 micropipette RPE 시트를 수집 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어.
참고: 저기 RPE 시트 원심을 필요 없다: 그들은 1 분 이내 중력에 의해 침전 물 것 이다. - P200 micropipette를 사용 하 여 추가 성장 매체를 제거 합니다. 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 P200 micropipette를 사용 하 여 그들을 triturate. 거품의 형성을 하지 마십시오. 단일 세포 현 탁 액 이상적 이지만 또한 너무 많은 분쇄를 하지 마십시오, 그렇지 않으면 RPE 세포는 살아남을 수 없습니다. 좋습니다 매우 부드럽게 분쇄를 40-50 시간.
5. RPE 세포 배양
- 문화 접시에 셀 접시
- RPE 세포의 다운스트림 응용 프로그램 그들의 극성의 유지 필요, 접시는 RPE 12 잘 배양 배지에서 미리 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입 2 쥐에서 세포. 높은 밀도에서 셀 도금 경우 RPE 세포 6 각형 모양 및 착 색 등 원래 속성을 유지할 수 있기 때문에 원하는입니다.
- 접시를 이동 하거나 경작의 첫 번째 72 h에 대 한 성장 매체를 변경 마십시오. 3 일 후, 오래 된 매체를 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체 바꿉니다. 그 후 문화 매체를 매일 변경 합니다. 일단 RPE 세포 confluency, 2% 성장 매체에서 FBS를 줄일 수 있습니다.
참고: 셀 수 있는 분할 0.25 %trypsin 사용 하 여. 그러나, 분한 후 셀 그들의 6 각형 모양 및 다음 구절에 염색 잃을 수 있습니다. 우리는 셀 분할 하지 않는 것이 좋습니다 있지만 문화권의 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 경우 기본 셀 무기한 passaged 수 없습니다: 그들은 해제 후 5-7 구절 차별화 하는 데 알려져 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
마우스 기본 RPE 문화권 문화에 1 주 후 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 도달 90-95 %confluency 2 쥐에서 설립. 2 주 후 문화, 셀 100 %confluency 도달 하 고 6 각형, 안료, 및 이중 nucleated 세포의 모자이크를 형성 하기 시작 했다. 문화, 모양 및 착 색, 형성 하기 위하여 계속 하는 세포의 3 주, 4 주 후 셀의 일부 있어 hyperpigmented (그림 2).
기본 RPE 세포 배양의 순도 immunostaining RPE65 항 체 (retinoid isomerohydrolase, 11-시스-retinol 동안 모든-트랜스-아이리스 에스테 르의 변환할 수 있도록 척추 시각적 주기에서 중요 한 효소를 사용 하 여 평가할 수 있습니다. phototransduction) (그림 3, 레드) 셀 접합의 무결성과 6 각형 모양의 존재는 phalloinin 얼룩 (그림 3, 녹색)를 사용 하 여 설명할 수 있습니다. 또한, ZO-1 단백질, 단단한 접속점의 중요 한 분 대의 표현 서쪽 더 럽 히 (그림 4) 또는 immunostaining를 사용 하 여 유효성 수 있습니다.
우리의 결과 얻은 마우스 기본 RPE 문화 확산, 착 색, 6 각형 모양 및 꽉 접합, 유지 및 RPE65 같은 기능 마커 익스프레스 수 있습니다 보여 줍니다.
그림 1 . 기본 RPE를 해 부 눈의 다른 단계 세포 문화. (한) 2 %dispase 분리, 후 눈 성장 매체에 세척 된다. (b) 후부 아이피는 각 막과 렌즈를 제거 하 여 얻어진 다. (c) 결과 아이피 추가 관련된 아이리스를 제거 하 여 청소는 색소 상피. (d) 추가 성장 매체에 부 화, 후는 아이피는 잘라 광선 사분면을 생성. (e) 신경 망막은 나머지 RPE 맥락 막 sclera 복잡 한에서 벗 겨. (f)는 RPE 시트는 부드럽게 Bruch의 막에서 분리 됩니다. 참고 어둡고 매우 끈 적 거리는 RPE 더 갈색 (화살표), 맥락 막 동안 보인다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 기본 RPE 세포 배양에 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입 3 주 오래 된 마우스에서 미리 12-잘 배양 배지에서 로드. 마우스 기본 RPE 문화권 문화 (a)에서 1 주일에 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 도달 90-95% confluency 2 마우스에서 설립. 2 주 후 문화, 셀 100 %confluency 도달 하 고 6 각형, 안료 및 이중 nucleated 세포 (b)의 모자이크를 형성 하기 시작 했다. 그러나 셀 모양 및 착 색 (c)를 형성 하기 위하여 계속 하는 문화의 3 주,, 4 주 후에 세포의 부분가지고 hyperpigmented (d). 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . RPE 세포 마커, RPE65, 기본 마우스 RPE 세포에 감지 됩니다. 기본 마우스 RPE 세포 문화의 4 주 후 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 고정 되었고 부정적인 제어 (NC)로 RPE65 항 체 또는 차단 버퍼 인 큐베이 팅. Phalloidin (녹색) 및 (파란) DAPI 또한 세포 막과 핵 얼룩에 추가 되었습니다. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 마커 꽉 접합의 조로-1 기본 RPE 세포에 표현 됩니다. 기본 마우스 RPE 세포 (mRPE) 문화의 3 주 후 수확 했다 고 8 µ g 세포 lysate의 서쪽 오 점에 실행 했다. ARPE-19 셀 (상용 안정적인 RPE 세포 선)의 상응 하는 금액은 부정적인 제어로 사용 되었다. ZO-1 ARPE-19 셀에서 결 석 되는 동안 기본 RPE 세포에 높게 표현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
제시 상세한 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 1 주 후 confluency를 도달 6 각형 모양 및 2 주 후 착 색 등 주요 RPE 특성을 제시 하는 신뢰할 수 있는 설립을 수 있습니다. 얻은 RPE 세포 다양 한 비타민 A 대사9,10 의 포토 리셉터 외부 세그먼트 식 균 작용 및 이온 전송11, 상피 세포 극성2, lysosomal 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 항상성 그리고 autophagy12,13. 파생 문화 형태학 전송에 의해 유효성을 검사할 수 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 설명 된 대로 자세히 다른14다운스트림 응용 프로그램에 따라. RPE 세포의 극성을 보여주는 문화의 성숙 transepithelial 전기 저항 (TEER) 포함 될 수 있습니다 보여 주기 위해 추가 분석 실험 시험, 침투성 분석 실험4,22, 기능 테스트 (식 균 작용 23) 돔 형성 하 고.
우리의 경험, 잘, 더 나은 confluency 표현 형에 도금 하는 더 셀. 이 프로토콜에서 우리는 한 12 mm 인서트에 2 쥐에서 RPE 세포 시드. 그러나, 그것은 또한 투입 RPE 세포 2 마우스에서 더 나은 confluency 및 TEER 얻으려면 한 6.5 m m 삽입 가능. 많은 연구에서 RPE 세포 배양에 대 한 번호판 Matrigel 또는 laminin 코팅 됩니다. 우리는 하지 코팅의 유무에 관계 없이 이러한 선박 RPE 세포 부착에 상당한 차이 보았다. 또한, 문화 매체에서 FBS의 백분율 더 나은 결과 달성 하기 위해 수정 될 수 있습니다. 10 %FBS 일반적으로 confluency에 도달 하기 위한 좋은 하지만 덜 FBS 떨어지고 RPE 차별화/성숙14,17에 대 한 도움이 될 것으로 보인다.
이 방법의 주요 제한 다른 안구 조직에서 파생 된 세포와 교차 오염 없이 RPE 세포 회복의 최대 효율을 보장 하기 위해 정확한 훈련의 눈 해 수행 하는 사람에 대 한 필요는. 연구원 상호 오염을 피하기 위해,이 절차의 중요 한 단계를 지배 해야 한다: 뒤 벗 겨 망막에는 RPE의 정확한 분리 맥락 막에서 조심. 얻은 문화의 순수성 RPE 특정 immunostaining를 사용 하 여 유효성 수 있습니다. RPE 마커 수 시각적 사이클, 방 벽 및 전송 기능, 신진 대사, 먹어서, melanogenesis15에 관련 된 유전자를 포함 하 여 RPE 문화의 특성화에 대 한 사용할 수 있습니다.
또 다른 한계는 문화를 동시에 처리할 수 있는 눈의 수입니다. 일반적으로, 우리가 한 번에 2 개 이상의 마우스를 사용을 권장 하지 않습니다. RPE 세포의 생존을 보장 하기 위해, 눈 최대한 빨리 해 부 한다. 사용자가 더 실력, 후 부 화 시간을 대체 하 여 더 많은 쥐를 처리 가능 하다.
그러나 전반적으로, 방법의 수 출판 되었습니다에 기본 마우스 RPE 문화3,,1415,, 처음으로, 우리 제시 비디오 버전의 완전 한 프로토콜. 이 프로토콜은 눈 해 부 기법에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 높은 속도 정밀도 해 부에 필요한 사이 최적 균형 연습 만으로 얻을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DS는 연구 바이엘 헬스케어, 독일 및 F. 호프만-라 로슈, 스위스에서 자금을 받았다. 나머지 작가 아니 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 이 작품은 방지 실명 (무제한 보조금 Wilmer 눈 연구소와 피츠버그 대학교) 연구에 의해 지원 됩니다. 이 작품도 안과, 피츠버그 대학에서에서 DS 시작 자금에 의해 지원 됩니다.
Acknowledgments
이 연구는 BrightFocus 재단 (DS)에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
