Summary
O epithelium retinal do pigment (RPE) é um epitélio multi-funcional do olho. Aqui nós apresentamos um protocolo para estabelecer culturas de célula primária derivadas o RPE murino.
Abstract
O epithelium retinal do pigment (RPE) é um altamente polarizado epitélio multi-funcional que se localiza entre a retina neural e a coroide do olho. É uma única folha de células pigmentadas que são embaladas hexagonalmente e conectadas por junções apertadas. As principais funções do RPE incluem a absorção da luz, fagocitose dos segmentos exteriores galpão fotoreceptor, buffer espacial dos íons, transporte de nutrientes, íons e água, bem como participação activa no ciclo visual. Com tais funções importantes e diversas, é criticamente importante estudar a biologia das células RPE. Um número de linhas de células RPE foram estabelecido; no entanto, passadas e imortalizadas células são conhecidas para perder rapidamente algumas das características morfológicas e fisiológicas das células RPE naturais. Assim, as células primárias são mais adequadas para estudar diferentes aspectos da biologia de pilha RPE e função. Cultura de células RPE primária mouse é muito útil para pesquisadores, desde modelos de mouse são amplamente utilizados em estudos biológicos, no entanto, coletar RPE células de rato também é muito difícil devido ao seu pequeno tamanho. Aqui, apresentamos um protocolo para o estabelecimento de culturas de células RPE mouse principal que inclui Enucleação e dissecção dos olhos e isolamento das folhas de RPE para produzir as células para cultivo. Este método permite a recuperação eficiente da célula. As células RPE obtidas de dois ratos podem chegar a confluência em uma inserção de membrana de poliéster 12mm pré-carregado em placa de cultura, depois de uma semana de cultura e mostrar algumas das propriedades originais de boa-fé RPE células como forma hexagonal e pigmentação após dois semanas de cultura.
Introduction
O epithelium retinal do pigment (RPE) é uma única camada de células epiteliais polarizadas que se localiza entre a retina neural e a coroide do olho. A funcionalidade das células RPE e a integridade da monocamada RPE são críticos para a visão porque o RPE desempenha um papel importante em vários processos, tais como a manutenção da barreira hemato-retiniana exterior, transporte de água e íons entre a retina e o absorção de coroide, luz, proteção contra o estresse oxidativo, controle do metabolismo de retinoide e fagocitose dos segmentos exteriores dos FOTORRECEPTORES1,2. A localização do RPE na parte de trás do olho, bem como sua função de barreira impedindo medicamentos administrados sistemicamente da passagem do sangue para o humor vítreo, tornam difícil estudar a complexidade do RPE função na vivo. Assim, há uma grande necessidade para o estabelecimento de culturas de células RPE para estudar as células RPE em um ambiente flexível e controlado3,4.
Existem várias linhas de células RPE estabelecidas, fornecendo uma maneira fácil e conveniente de obter e armazenar as células; no entanto, passadas as células têm algumas desvantagens em comparação com as células primárias2,3,4. Primeiro, eles são frequentemente caracterizados por alterações na morfologia celular. Por exemplo, nenhuma das linhas celulares existentes foram encontradas para ser adequado para um estudo confiável das propriedades de barreira de RPE devido a perda do fenótipo de polaridade celular e desaparecimento parcial das junções apertadas4. Além da perda de polaridade e ligações de celular para celular adequadas, as linhas de células RPE rapidamente perdem sua pigmentação devido à ausência das enzimas chave melanogênese no adulto RPE5. A pigmentação pode ser restaurada, mas a análise abrangente do mecanismo de re-pigmentação que inclua uma combinação de microscopia eletrônica de transmissão, gene expressão ensaios análise e químico para confirmar a presença de melanina tem nunca foram realizados6. Uma limitação mais é que as linhas de células RPE tem vida estendida da célula (às vezes - imortalidade) e sob certas condições podem se transformar em células-tronco multipotentes auto renovadora que desanexar do substrato e forma flutuante colônias7, 8. essa limitação torna impossível usar as linhas de células para transplante de experiências3.
Tendo em conta as desvantagens das linhas celulares RPE estabelecidas, culturas de células RPE primárias obtidas de tecidos frescos podem servir como um modelo mais biologicamente relevante para estudar o RPE. Células RPE primárias foram usadas não só para estudar funções específicas do RPE, tais como vitamina A metabolismo9, fagocitose do fotoreceptor segmentos exterior10 e íon transporte11, mas também para estudar Biologia celular básica tais como epiteliais polaridade de célula2 , homeostase dos lisossomos e autofagia12,13.
Nos últimos anos tem havido um número de publicações sobre o estabelecimento de culturas primárias de RPE, indicando um crescente interesse nesta área de pesquisa de14,3,15. Inúmeros protocolos para células humanas RPE e células RPE não-humanos como as células RPE de bovinos e suínas foram publicados16,17,18,19. No entanto, é mais difícil de manipular as células RPE rato devido ao seu tamanho muito menor. Apesar de um grande número de publicações tem descrito protocolos para isolar as células RPE do rato14,20,21, ainda existem muitos pesquisadores lutando para isolar as células RPE sem contaminação de coroide células ou células de detritos de retina neural. Aqui nós apresentamos o protocolo para o estabelecimento de mouse principal cultura de células RPE, incluindo a obtenção dos olhos do rato, dissecção dos olhos e isolamento das folhas de RPE para produzir as células para cultivo. Este protocolo de vídeo seria especialmente útil para pesquisadores que estão começando a trabalhar com culturas primárias de RPE rato e precisa de orientação sobre as técnicas de dissecação.
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Protocol
Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de Pittsburgh e institucional Cuidado Animal
1. Preparar soluções
- Prepare o crescimento médio pela completa Dulbecco modificado águia médio (DMEM), glicose alta com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina, 2,5 mM L-glutamina e 1 x MEM não essenciais aminoácidos. Pré-aquecer a mídia na incubadora de 37 ° C antes do uso.
- Prepare a solução de trabalho 2% (wt/vol) dispase II:
- Prepare uma solução stock de dispase 100mg/mL II dissolvendo-se 30 mg de dispase II em 300 µ l HEPES salino (50mm KOH/HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl). Este volume é para 3-4 ratos, pode ser ajustado para cima ou para baixo com base no número de ratos para a experiência). Estas ações podem ser armazenadas pelo menos 1 semana a 4 ° C.
- Prepare a solução de trabalho de 2% dispase, juntando 300 µ l a 100 mg/ml estoque II dispase a 1,2 mL de DMEM estéril, glicose alta e filtrar a solução através de um filtro de 0,22 µm. Esta etapa deve ser executada no fluxo laminar em condições estéreis. Pré-aqueça o preparado dispase II em incubadora 37 ° C antes do uso.
2. obtenção dos olhos de rato
- Eutanásia o mouse usando qualquer método aprovado e colocá-lo em um absorvente.
- Usando luvas, colocar o polegar e o dedo indicador ao redor dos olhos e empurre suavemente a pele para proptose do globo ocular.
- Inserir a ponta da tesoura angulada entre a pele e o globo ocular e corte com cuidado para fora do olho. Para evitar contaminação, brevemente, mergulhe o olho em etanol a 70%.
- Coloca imediatamente o olho no tampão fosfato salino (PBS) em uma placa de Petri.
- Repita as etapas para remover o segundo olho da 2.2-2.4.
3. dissecação do olho
- Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo do olho no microscópio de dissecação. Isso pode ser feito em PBS ou sobre o prato de Petri a seco.
- Use pinça de sutura para levantar os tecidos conjuntivos do globo ocular e cortá-los com uma tesoura Vannas. Não corte a esclera porque é praticamente impossível obter as viseiras posteriores intactas se a esclera é cortada.
- Após a limpeza do tecido conjuntivo, mantenha os olhos resultantes em PBS para a próxima etapa de lavagem.
Nota: Todas as etapas a seguir devem ser executadas no fluxo laminar em condições estéreis.
- Lave os olhos duas vezes em previamente aquecido a 37 ° C DMEM (glicose alta). Transferi com cuidado os globos oculares para o pré-aquecido 37 ° C DMEM (glicose alta) usando fórceps. Aspire os globos oculares médio e transferência para meio fresco em um prato novo.
- Aspire médio DMEM (glicose alta) e incube-os olhos da solução de trabalho II dispase de 2% (wt/vol) pré-aquecido por 45 min em incubadora a 37 ° C.
Nota: Em todas as etapas a seguir, coloque e manipular os olhos ou viseiras no meio de crescimento, que vão proteger o tecido e fornecer um meio bom para a dissecação. - Remover a solução II dispase e lavar os olhos duas vezes, no meio de crescimento por aspiração do meio velho e adicionando o novo meio de crescimento previamente aquecido a 37 ° C (Figura 1a).
Nota: Após a dissociação por dispase II, os globos oculares se tornam macios. - O olho com a pinça e fazer uma incisão ao redor da ora serrata de cada olho usando Tesoura Vannas sob o microscópio dissecação colocado no fluxo laminar do armário.
- Manter o globo ocular na solução, Retire cuidadosamente a córnea anterior estendendo o corte em torno da circunferência de serrata ora e se afastando da córnea anterior após o corte foi completo.
- Retire a cápsula da lente e epitélio associado íris pigmentada puxando suavemente-os fora a viseira com pinça teethed (Figura 1b, 1C).
- Incube as viseiras resultantes posteriores no meio de crescimento por 20 min a 37 ° C para facilitar a separação da retina neural o RPE.
- Corte as viseiras posteriores em 4 pétalas ao microscópio dissecação colocado no fluxo laminar do armário. Os cortes devem ser tempo suficiente para achatar a viseira, mas curto o suficiente para manter as pétalas conectadas (Figura 1D).
- Achate a viseira e remover a retina neural, muito delicadamente, puxando-o com pinça, mantendo o restante complexo RPE-coroide-esclera com outra pinça (Figura 1e). Comece a puxar das bordas, em vez do centro.
- Transferência de de que todos os tecidos esquartejados para uma nova placa de cultura estéril cheia pré aquecido médio de crescimento de 37 ° C.
4. isolamento de células primárias de RPE
- Segurando uma pétala do complexo coroide-RPE-esclera esquartejado com super fino pinça, retire suavemente as folhas intactas de RPE da membrana basal subjacente (membrana de Bruch) usando uma faca microcirúrgica crescente sob o microscópio de dissecação colocado no fluxo laminar (Figura 1f).
- Transfira as folhas RPE para a nova placa de cultura estéril contendo meio de cultura usando uma micropipeta P200. Quando a transferência de folhas RPE, molhar as pontas de pipeta com meio de cultura pipetando várias vezes para evita a aderência dentro a ponta do tecido. RPE será claramente distinguível de coroide: RPE parece mais amarronzado, enquanto coroide é mais escura e parece pegajoso e fofo.
- Como alternativa, use digestão enzimática e dissociação suave sem fórceps para desanexar o RPE a coroide14.
- Lavar os lençóis RPE 2 - 3 vezes usando previamente aquecido a 37 ° C médio de crescimento da placa de cultura estéril. Após cada etapa de lavagem, cuidadosamente recolha as folhas RPE, evitando outros tecidos como detritos de retina ou coroide. No final da última lavagem recolher as folhas RPE com uma micropipeta P200 e colocá-los em um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
Nota: Não há nenhuma necessidade para Centrifugar as folhas RPE: eles irão sedimentos pela gravidade dentro de 1 min. - Remova o meio de crescimento extra usando uma micropipeta P200. Ressuspender as células em um meio fresco pré-aquecido e suavemente, Triture-os com uma micropipeta P200. Evite a formação de bolhas. Uma suspensão de célula única é o ideal, mas também evitar demasiada trituração, caso contrário, as células RPE não são capazes de sobreviver. Recomendamos muito suavemente trituração por 40 - 50 vezes.
5. cultivo de células RPE
- As células numa placa de cultura da placa.
- Se as aplicações a jusante das células RPE exigem retenção de sua polaridade, placa o RPE células de 2 ratos em uma inserção de membrana de poliéster 12mm pré-carregado em placas de cultura 12-bem. Chapeamento as células em alta densidade é desejado porque nesse caso, as células RPE são capazes de manter as propriedades originais, tais como o formato hexagonal e pigmentação.
- Não mova a placa ou mudar o meio de crescimento para as primeiras 72 horas de cultivo. Depois de 3 dias, substitua o antigo médio com o meio fresco de crescimento previamente aquecido. Depois troque o meio de cultura todos os dias. Uma vez que as células RPE confluencia, reduza o FBS meio de crescimento de 2%.
Nota: As células podem ser divididas usando tripsina 0,25%. No entanto, após a divisão das células podem perder sua forma hexagonal e pigmentação nas passagens subsequentes. Nós não recomendamos a divisão das células, mas se isso for exigido pelas aplicações a jusante da cultura, tenha em mente que as células primárias não podem ser passadas por tempo indeterminado: eles são conhecidos para diferenciar eliminação após 5-7 passagens.
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Representative Results
A rato RPE cultura primária estabelecida de 2 ratos em 12mm membrana de poliéster inserção atinge 90-95% confluência após 1 semana na cultura. Depois de 2 semanas de cultura, as células alcançou a confluência de 100% e começaram a formar um mosaico de células hexagonais, pigmentadas e bi-nucleated. Por 3 semanas de cultura, as células continuou a formar a forma e pigmentação, no entanto, após 4 semanas uma parte das células tem hiperpigmentadas (Figura 2).
A pureza da cultura de pilha RPE primária pode ser avaliada por imunocoloração usando o anticorpo RPE65 (retinoide isomerohydrolase, uma enzima crítica no ciclo de vertebrados visual que permite a conversão de all-trans-retinil ésteres em 11-cis-retinol durante fototransdução) (Figura 3, vermelho). A integridade dos cruzamentos de célula para célula e a presença de formato hexagonal podem ser demonstradas usando phalloinin coloração (Figura 3, verde). Além disso, a expressão da proteína ZO-1, um importante componente das junções apertadas, pode ser validado usando mancha ocidental (Figura 4) ou immunostaining.
Nossos resultados demonstram que as culturas RPE primárias obtidos do mouse são capazes de proliferar, retêm pigmentação, formato hexagonal e junções apertadas e expressar marcadores funcionais tais como RPE65.
Figura 1 . Culturas de células de diferentes etapas de dissecação do olho para obter o RPE primária. (um) após a dissociação em dispase de 2%, o olho é lavado no meio de crescimento. (b) a posterior ocular é obtida através da remoção da córnea e a lente. (c) a viseira resultante é mais limpo, removendo a íris associada pigmentado epitélio. (d) após mais de incubação em meio de crescimento, a viseira é cortada radialmente para gerar quadrantes. (e) A retina neural é descascada fora do complexo coroide-RPE-esclera restante. (f) folhas o RPE suavemente são separadas da membrana de Bruch. Nota que o RPE parece mais amarronzadas (setas), enquanto a coroide é mais escura e muito pegajoso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Células RPE primárias de um rato 3 semana de idade, cultivadas em uma inserção de membrana de poliéster 12mm pré-carregado em placas de cultura de 12 poços. A rato RPE cultura primária estabelecida de 2 ratos em 12mm membrana de poliéster inserção atinge 90-95% confluência após 1 semana na cultura (a). Depois de 2 semanas de cultura, as células alcançou a confluência de 100% e começaram a formar um mosaico de células hexagonais, pigmentadas e bi-nucleated (b). Por 3 semanas de cultura, as células continuaram a formar a forma e pigmentação (c), no entanto, após 4 semanas uma parte das células tem hiperpigmentadas (d). Barra de escala: 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . O marcador de células RPE, RPE65, é detectável em células RPE mouse principal. As células RPE mouse principal após 4 semanas da cultura foram fixadas em paraformaldeído 4% (PFA) e incubadas com anticorpo RPE65 ou tampão de bloqueio como controlo negativo (NC). Faloidina (verde) e DAPI (azul) também foram adicionados para manchar as membranas celulares e núcleos. Barra de escala: 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . O marcador de junções apertadas, ZO-1 é expressa nas células RPE primárias. As células RPE mouse principal (mRPE) foram colhidas após 3 semanas de cultura e 8 µ g do lisado celular foi executado em um Western blot. A quantidade equivalente de células ARPE-19 (linha comercialmente disponível de celular estável RPE) foram utilizados como controle negativo. ZO-1 foi altamente expressa em células RPE primárias ao ser ausente das células ARPE-19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo detalhado apresentado permite estabelecimento confiável de rato primário RPE culturas que atingem a confluência após 1 semana e apresentar as principais características RPE como forma hexagonal e pigmentação após 2 semanas. As células RPE obtidas podem ser usadas para um número de aplicações a jusante, tais como vitamina A metabolismo9, fagocitose do fotoreceptor segmentos exterior10 e íon transporte11, células epiteliais polaridade2, dos lisossomos homeostase e autofagia12,13. Dependendo da aplicação a jusante, a morfologia das culturas derivadas pode ser validada pela transmissão e microscopia eletrônica conforme descrito em detalhe em outro lugar14. Ensaios adicionais para demonstrar a maturação das culturas pode incluir resistência elétrica transepitelial (TEER) do ensaio para demonstrar a polaridade das células RPE,4,22, testes funcionais (fagocitose de ensaios de permeabilidade 23) e formação de dome.
Em nossa experiência, as células mais que são banhados em um poço, melhor a confluência e o fenótipo. Neste protocolo, temos semeado as células RPE de 2 ratos em um inserções de 12 mm. No entanto, também é possível colocar as células RPE do 2 ratos para uma inserção de 6.5 mm para obter melhor confluência e TEER. Em muitos estudos, as placas para culturas de células RPE são revestidas com Matrigel ou laminina. Não vimos uma diferença significativa em anexo de célula RPE para estes vasos com ou sem revestimento. Além disso, a percentagem de FBS em meio de cultura pode ser modificada para alcançar melhores resultados. 10% FBS é geralmente bom para alcançar a confluência, mas caindo para menos FBS parece ser benéfica para o RPE diferenciação/maturação14,17.
A principal limitação deste método é a necessidade de formação precisa da pessoa realizando as dissecações de olho para garantir a máxima eficiência de recuperação de células RPE sem contaminação com células derivadas de outros tecidos oculares. Para evitar contaminação cruzada, o pesquisador deve dominar o passo crítico deste procedimento: cuidado descascando a retina seguido de separação precisa entre o RPE da coroide. A pureza das culturas obtidas pode ser validada usando immunostaining RPE-específicos. Um número de marcadores RPE está disponível para a caracterização das culturas RPE, incluindo genes envolvidos no ciclo visual, barreira e função de transporte, metabolismo, fagocitose e melanogênese15.
Outra limitação é o número de olhos que podem ser processados simultaneamente para obter as culturas. Em geral, não recomendamos trabalhar com mais de 2 ratos de cada vez. Para garantir a viabilidade das células RPE, os olhos devem ser dissecados tão rapidamente quanto possível. Depois que o usuário se tornar mais proficientes, é possível manipular mais ratos, alternando tempos de incubação.
Em geral, vários métodos têm sido publicados sobre o estabelecimento do mouse principal RPE culturas3,14,15, no entanto, pela primeira vez, apresentamos uma versão em vídeo do protocolo completo. Este protocolo pode ser usado como orientação sobre técnicas de dissecação a olho. No entanto, o equilíbrio ideal entre a alta velocidade e a precisão necessária para a dissecação pode ser alcançado apenas com a prática.
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Disclosures
DS recebeu pesquisa financiamento da Bayer HealthCare e F. Hoffmann-La Roche, Alemanha, Suíça. Os restantes autores declaram sem interesses financeiros concorrentes. Este trabalho é apoiado pela pesquisa para evitar cegueira (subvenções irrestritas para o Wilmer Eye Institute e Universidade de Pittsburgh). Este trabalho também é apoiado por fundos de start-up para DS de Oftalmologia, Universidade de Pittsburgh.
Acknowledgments
Este estudo foi parcialmente financiado pela Fundação de BrightFocus (para DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
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