Summary
El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio de múltiples funciones del ojo. Aquí presentamos un protocolo para establecer cultivos celulares primarios derivados del RPE murino.
Abstract
El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio multifuncional altamente polarizado que se encuentra entre la retina neural y la coroides del ojo. Es una sola hoja de células pigmentadas que es hexagonal embalado y conectadas por uniones estrechas. Las principales funciones del RPE incluyen la absorción de la luz, fagocitosis de los segmentos externo del fotorreceptor de vertiente, búfer espacial de iones, transporte de nutrientes, iones y agua, así como participación activa en el ciclo visual. Con tales funciones importantes y diversas, es críticamente importante para el estudio de la biología de las células RPE. Se han establecido una serie de líneas de células RPE; sin embargo, las células inmortalizadas y los conocen a perder rápidamente algunas de las características morfológicas y fisiológicas de las células RPE naturales. Así, células primarias son más adecuadas para el estudio de diferentes aspectos de la biología de la célula RPE y función. Cultivo de células RPE primaria de ratón es muy útil a los investigadores desde modelos de ratón son ampliamente utilizados en estudios de biología, sin embargo recoger RPE células de ratón también es muy difícil debido a su pequeño tamaño. Aquí, presentamos un protocolo para el establecimiento de cultivos de células primarias de ratón RPE que incluye enucleación y disección de los ojos y el aislamiento de las hojas RPE para producir las células de cultivo. Este método permite la recuperación eficiente de la célula. Las células RPE de dos ratones pueden llegar a la confluencia en una inserción de membrana poliéster 12 mm cargado en placa de cultivo después de una semana de la cultura y mostrar algunas de las propiedades originales de buena fe RPE células como forma hexagonal y pigmentación después de dos semanas de la cultura.
Introduction
El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es una sola capa de células epiteliales polarizadas que se encuentra entre la retina neural y la coroides del ojo. La funcionalidad de las células RPE y la integridad de la monocapa RPE son críticos para la visión porque del RPE desempeña un papel importante en varios procesos como el mantenimiento de la barrera sangre-retiniana externa, transporte de agua e iones entre la retina y el absorción de la coroide, luz, protección contra el estrés oxidativo, el control del metabolismo de los retinoides y fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores1,2. La ubicación de la ERP en la parte posterior del ojo, así como su función de barrera evitando fármacos administrados sistémicamente de paso de la sangre al humor vítreo, dificultar estudiar la complejidad de la función la EPR en vivo. Así, hay una gran necesidad para el establecimiento de cultivos de células RPE para el estudio de las células RPE en un ambiente flexible, controlado3,4.
Existe un número de líneas establecidas de células RPE, proporciona una manera fácil y conveniente de obtención y almacenamiento de las células; sin embargo, las células los tienen algunas desventajas en comparación con células primarias2,3,4. En primer lugar, a menudo se caracterizan por cambios en la morfología de la célula. Por ejemplo, ninguna de las líneas celulares existentes fueron encontrada para ser conveniente para un estudio confiable de las propiedades de barrera RPE debido a la pérdida del fenotipo de la polaridad celular y desaparición parcial de ensambladuras apretadas4. Además de la pérdida de polaridad y conexiones adecuadas de célula a célula, las líneas de células RPE rápidamente pierden su pigmentación debido a la ausencia de las enzimas clave de la melanogénesis en el RPE adulto5. La pigmentación puede ser restaurada, pero el análisis integral del mecanismo de la pigmentación que incluiría una combinación de microscopía electrónica de transmisión, ensayos de química y análisis de expresión genética para confirmar la presencia de melanina nunca ha se han realizado6. Una limitación más es que las líneas de células RPE tienen vida extendido (a veces - la inmortalidad) y bajo ciertas condiciones pueden transformarse en renovado células madre multipotentes que separar del sustrato y forma flotante colonias7, 8. esta limitación hace que sea imposible utilizar las líneas de células para trasplante de experimentos3.
Teniendo en cuenta las desventajas de las líneas establecidas de células RPE, cultivos primarios de células RPE obtenidos de tejidos frescos podrían servir como un modelo biológicamente más relevante para el estudio del RPE. Las células RPE primarias han sido utilizadas no sólo para estudiar las funciones específicas de RPE como metabolismo de la vitamina A9, fagocitosis de los segmentos externo de fotorreceptor10 y ion transporte11, sino también para estudiar biología celular básica tales como epiteliales polaridad de la célula2 , homeostasis lisosomal y autofagia12,13.
En los últimos años ha habido un número de publicaciones sobre el establecimiento de cultivos primarios de RPE, que indica un creciente interés en esta área de investigación3,14,15. Numerosos protocolos para células RPE humanas y no humanas RPE células como las células RPE de bovina y porcinas fueron publicados16,17,18,19. Sin embargo, es más difícil manejar las células RPE ratón debido a su tamaño mucho más pequeño. A pesar de que absolutamente un número de publicaciones ha descrito protocolos para aislar células RPE del ratón14,20,21, todavía hay muchos investigadores que luchan aislar las células RPE sin contaminación de células coroides o de desechos de retina neural. Aquí presentamos el protocolo para el establecimiento de cultivo de células RPE, incluyendo la obtención de los ojos del ratón, la disección de los ojos y el aislamiento de las hojas RPE para producir las células de cultivo primario de ratón. Este protocolo video sería especialmente útil para los investigadores que están empezando a trabajar con cultivos primarios de RPE de ratón y necesita orientación sobre las técnicas de disección.
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Protocol
Procedimientos que involucran animales sujetos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en Universidad de Pittsburgh
1. Preparar soluciones
- Preparar medio de cultivo por suplir Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), glucosa alta con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina, 2,5 mM L-glutamina y aminoácidos no esenciales de 1 MEM x. Precaliente los medios en la incubadora de 37 ° C antes de usar.
- Preparar solución de trabajo de 2% (peso/vol) dispase II:
- Preparar una solución stock de dispase II de 100 mg/mL disolver 30 mg de dispase II en 300 μL tampón HEPES solución salina (50 mM HEPES KOH de pH 7.4, 150 mM NaCl). Este volumen es de 3 a 4 ratones, puede ser escalado para arriba o abajo basado en el número de ratones para el experimento). Esta acción puede guardarse durante al menos 1 semana a 4 ° C.
- Preparar la solución de trabajo de 2% dispase agregando 300 μL de 100 mg/mL valores II dispase a 1,2 mL de DMEM estéril, glucosa alta y la solución de filtración con filtro 0,22 μm. Este paso debe realizarse en el gabinete bajo condiciones estériles de flujo laminar. Caliente previamente el preparado dispase II en incubadora de 37 ° C antes de usar.
2. obtención de los ojos de ratón
- Eutanasia el ratón utilizando cualquier método aprobado y colóquela sobre una almohadilla absorbente.
- Guantes, coloque el pulgar y el dedo índice alrededor del ojo y presione suavemente la piel para proptose del globo ocular.
- Inserte la punta de la tijera angulada entre la piel y el globo ocular y corte cuidadosamente el ojo. Para evitar la contaminación, sumergir brevemente el ojo en etanol al 70%.
- Inmediatamente colocar el ojo en el tampón fosfato salino (PBS) en una placa Petri.
- Repita los pasos 2.2-2.4 para quitar el segundo ojo.
3. disección de ojo
- Retire con cuidado el tejido conectivo del ojo con el microscopio de disección. Esto puede hacerse en PBS o en la caja de Petri seca.
- Utilice pinzas de sutura para levantar los tejidos conectivos del globo ocular y recorto con unas tijeras de Vannas. No corte la esclera debido a que es prácticamente imposible obtener las ojeras posteriores intactas si se corta la esclera.
- Después de limpiar el tejido conectivo, mantener los globos oculares resultantes en PBS para el siguiente paso de lavado.
Nota: Los siguientes pasos deben realizarse en el gabinete bajo condiciones estériles de flujo laminar.
- Lavar los ojos dos veces en precalentado a 37 ° C DMEM (glucosa alta). Cuidadosamente transfiera los globos oculares en el C ° 37 con DMEM (glucosa alta) con unas pinzas. Aspire los ojos medio y la transferencia a medio fresco en un plato nuevo.
- Aspirar el medio DMEM (glucosa alta) e incubar los ojos en la solución de trabajo de II dispase 2% (peso/vol) precalentado por 45 min en la incubadora de 37 ° C.
Nota: En todos los pasos siguientes, colocar y manipular ojos u ojeras en el medio de crecimiento, que protegen el tejido y proporcionan un buen medio para la disección. - Retirar la solución II dispase y lavar los ojos dos veces en un medio de aspirar el medio antiguo y agregando el nuevo medio de crecimiento con 37 ° C (Figura 1a).
Nota: Después de disociación por dispase II, los globos oculares se convierten en suaves. - Sujete el ojo con pinzas y haga una incisión alrededor de la ora serrata, de cada ojo con unas tijeras de Vannas bajo el microscopio de disección coloca en el flujo laminar gabinete.
- Mantener el globo ocular en la solución, retire con cuidado la córnea anterior ampliando el corte alrededor de la circunferencia de la serrata de ora y tirando la córnea anterior después de que la corte ha sido completado.
- Retire la cápsula de lente y el epitelio asociado iris pigmentado tirando suavemente de la ojera con pinza dentada (Figura 1b, 1C).
- Incubar las ojeras posteriores resultantes en el medio de crecimiento por 20 min a 37 ° C para facilitar la separación de la retina neural del RPE.
- El cilindro posterior a cortar 4 pétalos con el microscopio de disección colocada en el flujo laminar gabinete. Los cortes deben ser lo suficientemente largo para aplanar la ojera, pero suficientemente corto como para mantener los pétalos conectados (figura 1 d).
- Aplane el cilindro y extraiga la retina neural tirando muy suavemente con unas pinzas mientras mantiene el resto de complejo de RPE-coroides esclerótica con otro fórceps (Figura 1e). Empezar a tirar de los bordes en lugar del centro.
- Transferencia de todos los tejidos en cuartos en una nueva placa de cultivo estéril con medio de cultivo con 37 ° C.
4. aislamiento de las células RPE primarias
- Sosteniendo un pétalo del complejo EPR-coroides esclerótica en cuartos con pinzas de la multa estupenda, retire suavemente las hojas intactas de RPE de la membrana basal subyacente (membrana de Bruch) utilizando un cuchillo media luna microquirúrgica con el microscopio de disección colocado en el flujo laminar del gabinete (figura 1f).
- Transferencia de las hojas RPE en el nuevo plato de cultivo estériles conteniendo medio de cultivo utilizando una micropipeta P200. Remisión de hojas RPE, mojar las puntas de pipetas con medio de cultivo mediante pipeteo varias veces para evitar que el tejido se pegue dentro de la punta. RPE es claramente distinguible de la coroides: RPE parece más pardusco, mientras que la coroides es más oscuro y parece pegajosa y esponjosa.
- También utilizar la digestión enzimática y disociación suave sin fórceps para separar el RPE de la coroides14.
- Lavar las hojas RPE 2 - 3 veces usando precalentado 37 ° C medio de cultivo en la placa de cultivo estéril. Después de cada paso de lavado, recoger cuidadosamente las hojas RPE evitando otros tejidos tales como desechos de retina o coroides. Al final del último lavado recoger las hojas RPE con una micropipeta de P200 y colocarlos en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
Nota: No es necesario centrifugar las hojas RPE: van sedimentos por gravedad dentro de 1 minuto. - Retire el medio de crecimiento extra usando una micropipeta P200. Resuspender las células en medio fresco precalentado y triturate suavemente utilizando una micropipeta P200. Evitar formación de burbujas. Una suspensión unicelular es ideal, pero también evitar demasiado trituración, de lo contrario las células RPE no son capaces de sobrevivir. Recomendamos muy suavemente trituración para 40 - 50 veces.
5. cultivo de células RPE
- Las células en una placa de cultivo de la placa.
- Si aplicaciones posteriores de las células RPE requieren retención de su polaridad, placa RPE células de 2 ratones en una inserción de membrana poliéster 12 mm cargado en placas 12-bien. Las celdas de alta densidad de la galjanoplastia es deseada porque en ese caso las células RPE son capaces de mantener las propiedades originales, como el hexagonal de la forma y la pigmentación.
- No mover la placa o cambiar el medio de crecimiento de las primeras 72 h de cultivo. Después de 3 días, reemplazar el viejo medio con medio fresco crecimiento precalentado. Después de cambia el medio de cultivo cada dos días. Una vez las células RPE confluency, reducir la FBS en medio del crecimiento a 2%.
Nota: Las células se pueden dividir con tripsina 0.25%. Sin embargo, después de dividir las células pueden perder su forma hexagonal y pigmentación en los pasos posteriores. No se recomienda dividir las células, pero si es necesaria para las aplicaciones posteriores de la cultura, tenga en cuenta que las células primarias no pueden ser pasadas por tiempo indefinido: se sabe que se distinguen después de 5 a 7 pasos.
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Representative Results
El ratón RPE cultivo primario establecido de 2 ratones en 12 mm membrana poliéster relleno alcanza 90-95% confluencia después de 1 semana en cultura. Después de 2 semanas de cultivo, las células alcanzaron 100% de confluencia y comenzaron a formar un mosaico de células hexagonales pigmentadas y bi-nucleated. Por 3 semanas de cultivo, las células continúan forman la forma y la pigmentación, sin embargo, después de 4 semanas una porción de células consiguió hiperpigmentadas (figura 2).
La pureza del cultivo primario de células RPE puede evaluarse por immunostaining usando el anticuerpo de RPE65 (retinoide isomerohydrolase, una enzima fundamental en el ciclo visual vertebrado que permite la conversión de ésteres de all-trans-retinilo en 11-cis-retinol durante fototransducción) (figura 3, rojo). La integridad de las uniones célula a célula y la presencia de forma hexagonal se pueden demostrar usando phalloinin tinción (figura 3, verde). Además, expresión de la proteína ZO-1, un componente importante de ensambladuras apretadas, puede validarse mediante Western Blot (figura 4) o immunostaining.
Nuestros resultados demuestran que los cultivos primarios de RPE de ratón obtenidos son capaces de proliferar, mantener la pigmentación, forma hexagonal y ensambladuras apretadas y expresar marcadores funcionales como RPE65.
Figura 1 . Cultivos celulares de diferentes pasos de la disección de ojo para obtener RPE primaria. (a) después de disociación en dispase del 2%, se lava el ojo en medio de cultivo. (b) el cilindro posterior se obtiene mediante la eliminación de la córnea y el cristalino. (c) el cilindro resultante se limpia más quitando el iris asociado pigmentado epitelio. (d) después de la incubación aún más en medio de cultivo, el cilindro se corta radialmente para generar cuadrantes. (e) La retina neural se pela apagado del complejo EPR-coroides-esclera restante. (f) hojas de la RPE suavemente se separan de la membrana de Bruch. Nota que el RPE se ve más parduscas (flechas), mientras que la coroides es muy pegajoso y oscuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Las células RPE primarias de un 3 semana - viejo ratón cultivada en un inserto de membrana de poliéster de 12 mm cargado en placas 12-bien. El ratón RPE cultivo primario establecido de 2 ratones en 12 mm membrana poliéster relleno alcanza 90-95% confluencia después de 1 semana de cultura (a). Después de 2 semanas de cultivo, las células alcanzaron 100% de confluencia y comenzaron a formar un mosaico de células hexagonales, pigmentados y bi-nucleated (b). Por 3 semanas de cultivo continuaron de las células para formar la forma y la pigmentación (c), sin embargo, después de 4 semanas una porción de células consiguió hiperpigmentadas (d). Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . El marcador de células RPE, RPE65, es detectable en las células de RPE de ratón primaria. Células de RPE de ratón primario después de 4 semanas de la cultura se fija en 4% paraformaldehido (PFA) y se incubaron con anticuerpos RPE65 o solución amortiguadora de bloqueo como control negativo (NC). Phalloidin (verde) y DAPI (azul) se añadieron también para teñir los núcleos y membranas de la célula. Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . El marcador de ensambladuras apretadas, ZO-1 se expresa en las células RPE primarias. Las células primarias de ratón RPE (mRPE) fueron cosechadas después de 3 semanas de la cultura y 8 μg del lisado celular se ejecutó en un Western blot. La cantidad equivalente de las células ARPE-19 (disponible en el mercado estable RPE línea celular) se utilizaron como control negativo. ZO-1 fue altamente expresada en las células RPE primarias mientras que siendo ausente de las células ARPE-19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo detallado presentado permite confiable establecimiento de cultivos primarios RPE ratón que alcanzan confluencia después de 1 semana y presentan las principales características RPE como forma hexagonal y pigmentación después de 2 semanas. Las células RPE obtenidas pueden ser utilizadas para un número de aplicaciones posteriores tales como vitamina A metabolismo9, fagocitosis de los segmentos externo de fotorreceptor10 y ion transporte11, célula epitelial polaridad2, lysosomal homeostasis y autofagia12,13. Dependiendo de la aplicación aguas abajo, la morfología de las culturas derivadas puede ser validada por la transmisión y microscopía electrónica de barrido como se describe en detalle en otra parte14. Ensayos adicionales para demostrar la maduración de las culturas puede incluir resistencia eléctrica transepitelial (TEER) ensayo para demostrar la polaridad de las células RPE,4,22, pruebas funcionales (fagocitosis de ensayos de permeabilidad 23) y formación de la bóveda.
En nuestra experiencia, las células más que se platean en un pozo, mejor la confluencia y el fenotipo. En este protocolo, siembran las células RPE de 2 ratones en uno de 12 mm de los. Sin embargo, también es factible poner las células RPE de 2 ratones en un inserto de 6,5 mm para conseguir mejor confluencia y TEER. En muchos estudios, las placas de cultivos de células RPE se recubren con Matrigel o laminina. No hemos visto una diferencia significativa en el accesorio de células RPE a estas embarcaciones con o sin recubrimiento. Además, el porcentaje de equipos en el medio de cultivo puede ser modificado para lograr mejores resultados. 10% FBS es generalmente bueno para llegar a la confluencia, pero cae a menos equipos parece ser beneficioso para RPE la diferenciación/maduración14,17.
La principal limitación de este método es la necesidad de formación precisa de la persona que realiza la disección de ojo para asegurar la máxima eficiencia de recuperación de la célula del EPR sin contaminación con células derivadas de otros tejidos oculares. Para evitar la contaminación cruzada, el investigador debe dominar el paso crítico de este procedimiento: cuidado despegando la retina seguido por separación precisa del RPE de la coroides. La pureza de los cultivos obtenidos puede validarse mediante inmunotinción específicos de RPE. Un número de marcadores RPE es disponible para la caracterización de las culturas de la RPE, incluyendo genes involucrados en el ciclo visual, barrera y función de transporte, metabolismo, fagocitosis y melanogénesis15.
Otra limitación es el número de ojos que pueden procesarse simultáneamente para obtener las culturas. En general, no recomendamos trabajar con más de 2 ratones a la vez. Para garantizar la viabilidad de las células RPE, los ojos se deben disecar lo antes posible. Después de que el usuario a ser más competentes, es posible manejar más ratones por la alternancia de tiempos de incubación.
En general, una serie de métodos ha sido publicada en el que se establece el ratón principal RPE culturas3,14,15, sin embargo, por primera vez, presentamos una versión en video del protocolo completo. Este protocolo se puede utilizar como orientación sobre las técnicas de disección de ojo. Sin embargo, el equilibrio óptimo entre la velocidad y la precisión requerida para la disección se logra solamente con practica.
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Disclosures
DS ha recibido financiación de Alemania y F. Hoffmann-La Roche, Bayer HealthCare, Suiza de la investigación. Los restantes autores no declaran a intereses financieros que compiten. Este trabajo es apoyado por la investigación para evitar la ceguera (becas sin restricciones el Wilmer Eye Institute y la Universidad de Pittsburgh). Este trabajo es apoyado también por los fondos de arranque para DS de Oftalmología, Universidad de Pittsburgh.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado en parte por The BrightFocus Foundation (para DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
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