Summary
Retinal pigmentepitel (RPE) är en multi-funktionell epitel i ögat. Här presenterar vi ett protokoll för att upprätta primära cellkulturer härrör från murina RPE.
Abstract
Retinal pigmentepitel (RPE) är en starkt polariserad multifunktionella epitel som ligger mellan neurala näthinnan och åderhinnan i ögat. Det är ett enstaka pappersark pigmenterade celler som hexagonally packas och ansluten med tight junctions. De viktigaste funktionerna i RPE inkluderar absorption av ljus, fagocytos skjul ljusmätare yttre segment, rumsliga buffring av joner, transport av näringsämnen, joner och vatten samt aktivt deltagande i den visuella cykeln. Med sådana viktiga och olikartade funktioner är det kritiskt viktigt att studera biologi av RPE-celler. Ett antal RPE cellinjer har fastställts. dock är anpassade och förevigade celler kända för att snabbt förlora vissa morfologiska och fysiologiska egenskaper av naturliga RPE-celler. Primära celler är således mer lämpade för att studera olika aspekter av RPE cellbiologi och funktion. Mus primära RPE cellkultur är mycket användbart för forskare eftersom musmodeller används ofta i biologiska studier, emellertid samla RPE-celler från mus är också mycket utmanande på grund av sin ringa storlek. Här presenterar vi ett protokoll för att skapa primära mus RPE cellkulturer som omfattar enucleation och dissektion av ögonen och isolering av RPE täcker ge cellerna för odling. Denna metod möjliggör effektiv cell återvinning. RPE-cellerna erhållits från två möss kan nå konfluens på en 12 mm polyester membran infoga förinstallerad i kultur plattan efter en vecka av kultur och visa några av den ursprungliga egenskaper hos bona fide RPE-celler såsom sexkantig form och pigmentering efter två veckor av kultur.
Introduction
Retinal pigmentepitel (RPE) är ett enda lager av polariserade epitelceller som ligger mellan neurala näthinnan och åderhinnan i ögat. Funktionaliteten i RPE-cellerna och integriteten hos de RPE enskiktslager är kritiska för vision eftersom RPE spelar en viktig roll i flera processer såsom att upprätthålla den yttre blod-retinal barriären, transport av vatten och joner mellan näthinnan och koroidea, ljus absorbering, skydd mot oxidativ stress, kontroll av retinoid metabolism och fagocytos av de yttersta segmenten av fotoreceptorer1,2. Placeringen av RPE på baksidan av ögat, liksom dess barriärfunktion förebyggande läkemedel administreras systemiskt från passera från blodet till glaskroppen, gör det svårt att studera komplexiteten av RPE funktion i vivo. Det finns således ett stort behov för etableringen av RPE cellkulturer att studera RPE-cellerna i en flexibel och kontrollerad miljö3,4.
Finns ett antal etablerade RPE-cellinjer, som ger ett enkelt och bekvämt sätt att erhålla och lagra cellerna; överförda celler har dock vissa nackdelar jämfört med primära celler2,3,4. Först, de kännetecknas ofta av förändringar i cellmorfologi. Till exempel befanns ingen av de existerande cellinjer vara lämplig för en tillförlitlig studie av RPE barriäregenskaper på grund av förlusten av cell polaritet fenotyp och delvis försvinner i åtsittande föreningspunkter4. Förutom förlusten av polaritet och rätt cell till cell anslutningar förlora RPE cellinjer snabbt sin pigmentering på grund av avsaknad av viktiga Melanogenes enzymer i de vuxna RPE-5. Pigmentering kan återställas, men den omfattande analysen av mekanismen för re-pigmentering som skulle innehålla en kombination av transmissionselektronmikroskopi, gen uttryck analys och kemiska analyser till förekomsten av melanin har aldrig varit utförda6. En ytterligare begränsning är att raderna RPE cell har utökade cell liv (ibland - odödlighet) och under vissa förutsättningar kan omvandla till själv förnya multipotenta stamceller som kopplar loss från underlaget och bildar flytande kolonier7, 8. denna begränsning gör det omöjligt att använda cell linjer för transplantation experiment3.
Med tanke på nackdelarna av RPE etablerade cellinjer, primära RPE cellkulturer från färska vävnader kan fungera som en mer biologiskt relevant modell för att studera RPE. Primära RPE-celler har använts inte bara att studera RPE-specifika funktioner såsom vitamin A metabolism9, fagocytos av ljusmätare yttre segment10 och ion transportera11, men också att studera grundläggande cellbiologi som epitelial cell polaritet2 , lysosomala homeostas och autofagi12,13.
Under de senaste åren har förekommit ett antal publikationer om inrättande av primära RPE kulturer, vilket tyder på ett växande intresse för detta område forskning3,14,15. Många protokoll för mänskliga RPE-celler och icke-mänskliga RPE-celler såsom bovin och porcin RPE-celler var publicerade16,17,18,19. Det är dock svårare att hantera musen RPE-celler på grund av deras mycket mindre storlek. Även om ganska ett antal publikationer har beskrivit protokoll för att isolera RPE-celler från mus14,20,21, finns det fortfarande många forskare kämpar för att isolera RPE-celler utan förorening av koroidea celler eller celler från neural retina skräp. Här presenterar vi protokollet för att skapa primära mus RPE cellkultur, inklusive att få ögonen från mus, dissekering av ögonen och isolering av RPE täcker ge cellerna för odling. Denna video protokollet skulle vara särskilt användbar för forskare som börjar arbeta med mus primära RPE kulturer och behöver vägledning på dissektion teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden som omfattar animaliska ämnen har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Pittsburgh
1. Förbered lösningar
- Förbereda odlingsmedium genom komplettering Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM), hög glukos med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, 2,5 mM L-glutamin och 1 x MEM onödiga aminosyror. Pre varma media i 37 ° C inkubator före användning.
- Förbered 2% (wt/vol) dispase II fungerande lösning:
- Förbereda en stamlösning av 100 mg/mL dispase II genom upplösning 30 mg dispase II i 300 µL HEPES-buffrad koksaltlösning (50 mM HEPES/KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Denna volym är för 3-4 möss, den kan skalas upp eller ner baserat på antalet möss för experimentet). Detta bestånd kan lagras i minst 1 vecka vid 4 ° C.
- Förbereda den fungerande lösningen av 2% dispase genom att lägga till 300 µL av 100 mg/mL dispase II lager till 1,2 mL steril DMEM, hög glukos och filtrera lösningen genom ett 0,22 µm filter. Detta steg bör utföras i laminärt flöde skåp under sterila förhållanden. Pre värma den förberedda dispase II i 37 ° C inkubator före användning.
2. att erhålla mus ögon
- Avliva musen med någon godkänd metod och placera den på en absorberande pad.
- Handskar, sätt tummen och pekfingret runt ögat och tryck försiktigt huden att proptose ögongloben.
- Sätt spetsen vinklad sax mellan huden och ögongloben och skär försiktigt ut ögat. För att undvika kontaminering, kort doppa ögat i 70% etanol.
- Placera omedelbart ögat i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en petriskål.
- Upprepa steg 2.2-2.4 ta bort det andra ögat.
3. ögon dissektion
- Ta försiktigt bort bindväv från ögat under mikroskopet dissekera. Detta kan göras antingen i PBS eller på torra petriskål.
- Använda suturering tången för att lyfta bindväv från ögongloben och klippa ut med Vännäs sax. Skär inte sklera eftersom det är praktiskt omöjligt att erhålla intakt bakre ögonmusslorna om sklera skärs.
- Efter rengöring bindväv, hålla de resulterande ögongloberna i PBS för nästa tvätt steg.
Obs: Alla följande steg bör utföras i laminärt flöde skåp under sterila förhållanden.
- Tvätta ögonen två gånger i förväg värmde 37 ° C DMEM (hög glukos). Noggrant överföra ögonglober till de pre värmde 37 ° C DMEM (hög glukos) med hjälp av tången. Aspirera medium och överföring ögonglober till färska medium i en ny maträtt.
- Aspirera DMEM (hög glukos) medium och inkubera ögonen i förväg värmde 2% (wt/vol) dispase II arbetslösning för 45 minuter i 37 ° C inkubatorn.
Obs: I alla följande steg, placera och manipulera ögon eller ögonmusslor i odlingsmedium, som kommer att skydda vävnaden och ger ett bra medel för dissektion. - Ta bort dispase II lösningen och tvätta ögonen två gånger i odlingsmedium genom att aspirera på gamla medellång och lägga nya pre värmde 37 ° C odlingsmedium (figur 1a).
Obs: Efter dissociation av dispase II, ögonglober blivit mjuk. - Håll ögat med pincett och gör ett snitt runt den ora serrata av varje öga med Vännäs sax under mikroskopet dissekera placeras i laminärt flöde skåp.
- Att hålla ögongloben i lösningen, ta försiktigt bort främre hornhinnan genom att utvidga skära runt ora serrata omkretsen och dra främre hornhinnan bort efter snittet har varit komplett.
- Ta bort linskapseln och associerade iris pigmenterade epitel genom att försiktigt dra dem ur ögonmusslan med teethed pincett (figur 1b, 1 c).
- Inkubera resulterande bakre ögonmusslorna i odlingsmedium för 20 min vid 37 ° C att underlätta separering av neurala näthinnan från RPE.
- Skär de bakre ögonmusslorna i 4 kronblad under mikroskopet dissekera placeras i laminärt flöde skåp. Nedskärningarna bör vara tillräckligt lång för att platta ögonmusslan, men tillräckligt korta för att hålla kronbladen ansluten (figur 1 d).
- Plattar ögonmusslan och avlägsna neurala näthinnan genom att dra det mycket försiktigt med pincett medan du håller de återstående RPE-åderhinnan-sklera komplex med en annan peang (figur 1e). Börja dra från kanterna i stället för från centrum.
- Över alla fyrdelning vävnader till en ny steril kultur maträtt fylld med pre värmde 37 ° C odlingsmedium.
4. isolering av primära RPE-celler
- Håller ett blomblad av fyrdelning RPE-åderhinnan-sklera komplexet med fin super pincett, lossnar försiktigt intakt ark av RPE från underliggande basalmembranet (Bruchs membran) med hjälp av en mikrokirurgisk crescent kniv under mikroskopet dissekera placeras i laminärt flöde skåp (figur 1f).
- Överföra RPE arken i nya sterila kultur skålen som innehåller odlingsmedium genom att använda en P200 mikropipett. När du överför RPE ark, våt pipettspetsarna med odlingsmedium genom att flera gånger med att förhindra vävnad fastnar inuti spetsen. RPE ska vara tydligt åtskiljbar från åderhinnan: RPE ser mer brunaktig, medan åderhinnan är mörkare och ser klibbigt och fluffig.
- Alternativt använda enzymatisk nedbrytning och skonsam dissociation utan tång för att lossa RPE från åderhinnan14.
- Tvätta de RPE lakan 2 - 3 gånger med pre värmde 37 ° C odlingsmedium i sterila kultur skålen. Efter varje tvätt steg noggrant samla RPE arken samtidigt undvika andra vävnader såsom näthinnan skräp eller åderhinnan. I slutet av den sista tvättningen samla RPE arken med en P200 mikropipett och placera dem i en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör.
Obs: Det finns ingen anledning att Centrifugera RPE arken: kommer de sediment självtryck inom 1 min. - Ta bort extra odlingsmedium använder en P200 mikropipett. Att resuspendera cellerna i färska pre värmde odlingsmedium och försiktigt pulverisera dem med en P200 mikropipett. Undvika att bubblor bildas. En encellig suspension är perfekt, men också undvika för mycket sönderdelning, annars RPE-celler inte kunna överleva. Vi rekommenderar mycket försiktigt sönderdelning för 40 - 50 gånger.
5. odling RPE-celler
- Platta celler med en kultur plattan.
- Om nedströms tillämpningar av RPE-cellerna kräver behålla av deras polaritet, plattan RPE-celler från 2 möss i en 12 mm polyester membran infoga förinstallerad i 12-väl kultur plattor. Plätering cellerna på hög densitet önskas eftersom i så fall RPE-celler förmår hålla ursprungliga egenskaper, såsom sexkantig form och pigmentering.
- Inte flytta plattan eller ändra odlingsmedium för första 72 h för odling. Efter 3 dagar, ersätta det gamla mediet med färska pre värmde odlingsmedium. Efter att ändra odlingssubstratet varannan dag. När RPE-celler får confluency, minska FBS i odlingsmedium till 2%.
Obs: Cellerna kan delas upp med 0,25% trypsin. Dock efter dela upp kan cellerna förlora sin sexkantig form och pigmentering i de efterföljande passagerna. Vi rekommenderar inte dela celler, men om det krävs av nedströms tillämpningar av kulturen, hålla i åtanke att de primära cellerna inte kan vara passaged på obestämd tid: det är känt att de differentiera efter 5-7 passager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus RPE primärkulturen etablerad från 2 möss i 12 mm polyester membran infoga når 90-95% konfluens efter 1 vecka i kultur. Efter 2 veckor av kultur, celler nådde 100% konfluens och började att bilda en mosaik av sexkantiga, pigmenterad och bi-nucleated celler. Med 3 veckor av kultur, cellerna fortsatte att bilda formen och pigmentering, men fick efter 4 veckor en del av cellerna hyperpigmenterad (figur 2).
Renhet av primära RPE cellkulturen kan bedömas genom immunfärgning med den RPE65 antikroppen (retinoid isomerohydrolase, en kritisk enzym i ryggradsdjur visuella cykel som gör att omvandlingen av all-trans-retinyl estrar till 11-cis-retinol under phototransduction) (figur 3, röd). Integriteten för cell till cell i korsningar och förekomsten av sexkantiga formen kan påvisas med hjälp av phalloinin färgning (figur 3, grön). Dessutom kan uttryck för ZO-1 protein, en viktig komponent i åtsittande föreningspunkter, valideras med Western blotting (figur 4) eller immunfärgning.
Våra resultat visar att de erhållna mus primära RPE kulturerna ska kunna föröka sig, behålla pigmentering, sexkantig form och åtsittande föreningspunkter och express funktionella markörer såsom RPE65.
Figur 1 . Olika stegen i ögat dissektion att erhålla primära RPE cell kulturer. (en) efter dissociation i 2% dispase, ögat sköljs i odlingsmedium. (b) den bakre ögonmusslan erhålls genom att ta bort hornhinnan och linsen. (c) den resulterande ögonmusslan rengörs ytterligare genom att ta bort den associerade irisen pigmenterade epitel. (d) efter ytterligare inkubation i odlingsmedium, ögonmusslan skärs radiellt för att generera kvadranter. (e) Neurala näthinnan är skalade bort från de återstående RPE-åderhinnan-sklera-komplexet. (f) The RPE ark är försiktigt separeras från den Bruchs membran. Observera att RPE ser mer brunaktig (pilar), medan åderhinnan är mörkare och mycket klibbig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Primära RPE-celler från en 3 - vecka-gammal mus odlade på en 12 mm polyester membran infoga förinstallerad i 12-väl kultur plattor. Mus RPE primärkulturen etablerad från 2 möss i 12 mm polyester membran infoga når 90-95% konfluens efter 1 vecka i kultur (en). Efter 2 veckor av kultur, cellerna nådde 100% konfluens och börjat bildar en mosaik av sexkantiga, pigmenterad och bi-nucleated celler (b). Av 3 veckor av kultur cellerna fortsatte att bilda formen och pigmentering (c), men fick efter 4 veckor en del av cellerna hyperpigmenterad (d). Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . RPE cell markören, RPE65, detekteras i primära mus RPE-cellerna. Primära mus RPE-celler efter 4 veckors kultur var fast i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och inkuberas med antingen RPE65 antikropp eller blockerande buffert som den negativa kontrollen (NC). Phalloidin (grön) och DAPI (blå) lades också till att färga de Cellmembran och kärnor. Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Markören av tight junctions, ZO-1 uttrycks i primära RPE-cellerna. Primära mus RPE-celler (mRPE) skördades efter 3 veckor av kultur och 8 µg cellens lysate kördes på en Western blot. Motsvarande mängd ARPE-19 cellerna (kommersiellt tillgängliga stabila RPE cell linje) användes som en negativ kontroll. ZO-1 uttrycktes mycket i de primära RPE-cellerna samtidigt vara frånvarande från ARPE-19 celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenteras detaljerade protokollet möjliggör tillförlitlig inrättandet av mus primära RPE kulturer som når konfluens efter 1 vecka och presentera de viktigaste RPE egenskaperna såsom sexkantig form och pigmentering efter 2 veckor. De erhållna RPE-cellerna kan användas för ett antal nedströms tillämpningar såsom vitamin A metabolism9, fagocytos av ljusmätare yttre segment10 och ion transport11, epitelial cell polaritet2, lysosomala homeostas och autofagi12,13. Beroende på programmet nedströms morfologi av de härledda kulturerna kan verifieras av överföring och svepelektronmikroskopi som beskrivs i detalj på annan plats14. Ytterligare analyser visa mognaden av kulturerna kan innehålla transepithelial resistans (TEER) analys för att påvisa polariteten av RPE-cellerna, permeabilitet analyser4,22, funktionella tester (fagocytos 23) och kupol bildandet.
Vår erfarenhet, ju fler celler som är klädd i en brunn, desto bättre konfluens och fenotypen. I detta protokoll seedade vi RPE-cellerna från 2 möss på ett 12 mm vändskär. Det är dock också möjligt att sätta RPE-celler från 2 möss i en 6,5 mm infoga att få bättre konfluens och TEER. I många studier, är pläterar för RPE cellkulturer belagda med Matrigel eller laminin. Vi har inte sett en signifikant skillnad i RPE cell fastsättning dessa fartyg med eller utan beläggning. Dessutom kan andelen FBS i odlingsmediet ändras för att uppnå bättre resultat. 10% FBS är oftast bra för att nå konfluens, men att släppa till mindre FBS verkar vara fördelaktigt för RPE differentiering/mognad14,17.
Den största begränsningen med denna metod är exakt utbildningen av den person som utför de öga dissektionerna måste säkerställa maximal effektivitet av RPE cell återhämtning utan förorening med celler från andra okulära vävnader. För att undvika korskontaminering, forskaren bör behärska de kritiska steget i proceduren: försiktig skalar av näthinnan följt av exakt separering av RPE från åderhinnan. Renheten av de erhållna kulturerna kan valideras med RPE-specifika immunfärgning. Det finns ett antal RPE markörer för karaktärisering av RPE kulturer, inklusive gener involverade i visuella cykel, barriär och transport funktion, metabolism, fagocytos och Melanogenes15.
En annan begränsning är antalet ögon som kan bearbetas samtidigt för att få kulturer. Vi rekommenderar generellt inte arbeta med mer än 2 möss i taget. För att säkerställa lönsamheten av RPE-cellerna, bör ögonen vara dissekerade så snabbt som möjligt. Efter användaren blir mer kompetenta, är det möjligt att hantera fler möss av omväxlande inkubationstider.
Sammantaget ett antal metoder har publicerats på upprättandet primära musen RPE kulturer3,14,15, dock för första gången presenterar vi en video version av protokollet komplett. Detta protokoll kan användas som vägledning på ögat dissektion teknik. Optimal balans mellan hög hastighet och precision som krävs för dissektion kan dock uppnås endast med praktiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DS har fått forskningsmedel från Bayer HealthCare, Tyskland och F. Hoffmann-La Roche, Schweiz. Återstående författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen. Detta arbete stöds av forskning för att förhindra blindhet (obegränsad bidrag till Wilmer Eye Institute och University of Pittsburgh). Detta arbete stöds också av nystartade fonder till DS från oftalmologi, University of Pittsburgh.
Acknowledgments
Denna studie finansierades delvis av BrightFocus Foundation (till DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
