Summary
Netthinnens pigment epitel (RPE) er en multi-funksjonell epitel i øyet. Her presenterer vi en protokoll for å etablere primært cellekulturer fra murine RPE.
Abstract
Netthinnens pigment epitel (RPE) er et svært polarisert multifunksjonelle epitel som ligger mellom neural netthinnen og akkord av øyet. Det er ett ark pigmentert celler som er hexagonally pakket og forbundet med stramme veikryss. Hovedfunksjonene til RPE inkluderer absorpsjon av lys, fagocytose skur photoreceptor ytre segmenter, romlig bufring av ioner, transport av næringsstoffer, ioner og vann i tillegg til aktiv deltakelse i visuelle syklus. Med slike viktige og ulike funksjoner er det kritisk viktig å studere biologi av RPE celler. RPE cellen linjer er etablert; men er passaged og udødeliggjort celler kjent for å raskt miste noen morfologiske og fysiologiske kjennetegner naturlig RPE celler. Dermed er primære celler mer egnet for å studere ulike aspekter av RPE cellebiologi og funksjon. Musen primære RPE cellekultur er svært nyttig for forskerne siden musen modeller er mye brukt i biologiske studier, men samle RPE celler fra musen er også svært utfordrende på grunn av sin lille størrelse. Her presenterer vi en protokoll for å etablere hovedknappen på musen RPE cellekulturer som inkluderer enucleation og Disseksjon av øynene og isolasjon av RPE ark til cellene for dyrking. Denne metoden gjør det mulig for effektiv celle utvinning. RPE cellene fra to mus kan nå confluency på en 12 mm polyester membran setter forhåndsinstallert i kultur plate etter en uke av kultur og vise noen av den opprinnelige egenskapene til bona fide RPE celler som Sekskantet form og pigmentering etter to uker kultur.
Introduction
Netthinnens pigment epitel (RPE) er en enkelt lag av polarisert epitelceller som ligger mellom neural netthinnen og akkord av øyet. Funksjonaliteten til RPE cellene og integriteten til den RPE monolayer er avgjørende for visjon fordi RPE spiller en stor rolle i flere prosesser som opprettholde ytre blod-retinal barrieren, vann og ioner mellom netthinnen og choroid, lys absorpsjon, beskyttelse mot oksidativt stress, kontroll av retinoid metabolisme og fagocytose av de ytre delene av fotoreseptorer1,2. Plasseringen av RPE på baksiden av øyet, samt barriere funksjonen forhindrer narkotika administrert systemisk fra passerer fra blodet til glasslegemet humor, gjør det vanskelig å studere kompleksiteten av RPE funksjonen i vivo. Derfor finnes det et stort behov for etablering av RPE cellekulturer å studere RPE cellene i en fleksibel, kontrollert miljø3,4.
Etablerte RPE cellen linjer finnes, gir en enkel og praktisk måte å skaffe og lagring i celler. men har passaged celler noen ulemper i forhold til primære celler2,3,4. Først, de er ofte preget av endringer i celle morfologi. For eksempel ble ingen av de eksisterende linjene funnet for å være egnet for en pålitelig studie av RPE barriereegenskaper tap av cellen polaritet fenotypen og delvis forsvinningen av tett veikryss4. I tillegg til tapet av polaritet og riktig celle til celle forbindelser mister RPE celle linjene raskt sin pigmentering på grunn av fravær av nøkkelen melanogenesis enzymer i voksen RPE5. Pigmentering kan gjenopprettes, men omfattende analyse av mekanismen av re-pigmentering som inkluderer en kombinasjon av overføring elektronmikroskop, gene expression analyse og kjemiske analyser å bekrefte tilstedeværelse av melanin har aldri vært utført6. En mer begrensning er at de RPE linjene har utvidet celle liv (noen ganger - udødelighet) og under visse betingelser kan forvandle selv fornyende multipotent stamceller som kobler substrat og skjemaet flytende kolonier7, 8. denne begrensningen gjør det umulig å bruke celle linjene for transplantasjon eksperimenter3.
Vurderer ulempene med de etablerte RPE linjene, primære RPE cellekulturer fra friskt vev kan tjene som mer biologisk relevante modell å studere i RPE. Primære RPE cellene har blitt brukt ikke bare å studere RPE-spesifikke funksjoner som vitamin A metabolisme9, fagocytose photoreceptor ytre segmenter10 og ion transportere11, men også å studere grunnleggende cellebiologi som epithelial celle polaritet2 og lysosomale homeostase autophagy12,13.
I de siste par årene har det vært en rekke publikasjoner om å etablere primære RPE kulturer, viser en økende interesse i dette området av forskning3,14,15. Flere protokoller for menneskelige RPE celler og ikke-menneskelige RPE celler som storfe og svin RPE celler ble publisert16,17,18,19. Men er det vanskeligere å håndtere musen RPE celler på grunn av deres mye mindre størrelse. Selv om ganske mange publikasjoner har beskrevet for å isolere RPE celler fra musen14,20,21, er det fortsatt mange forskere sliter med å isolere RPE celler uten forurensning av choroid celler eller celler fra neural netthinnen rusk. Her presenterer vi protokollen for å etablere hovedknappen på musen RPE cellekultur, inkludert å få øynene fra mus, Disseksjon av øynene og isolasjon av RPE ark til cellene for dyrking. Denne video protokollen ville være spesielt nyttig for forskerne som begynner å arbeide med musen primære RPE kulturer og trenger veiledning på disseksjon teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh
1. klargjør løsninger
- Forberede vekst medium ved supplere Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM), høy glukose med 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, 2,5 L-glutamin og 1 x MEM unødvendige aminosyrer. Forvarm media i 37 ° C inkubator før bruk.
- Forbered 2% (wt/vol) dispase II arbeidsoppløsning:
- Forbered en lagerløsning av 100 mg/mL dispase II ved oppløsning 30 mg dispase II i 300 µL HEPES-bufret saltvann (50 mM HEPES/KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). Dette volumet er for 3-4 mus, det kan være skalert opp eller ned basert på antall mus for eksperimentet). Dette lager kan lagres i minst 1 uke på 4 ° C.
- Forberede arbeidsoppløsning av 2% dispase ved å legge til 300 µL av 100 mg/mL dispase II lager til 1,2 mL steril DMEM, høy glukose og filtrering løsningen gjennom en 0.22 µm. Dette trinnet skal utføres i laminær strømning regjering under sterile forhold. Forvarm på forberedt dispase II i 37 ° C inkubator før bruk.
2. få musen øynene
- Euthanize musen bruker en godkjent metode og plassere den på en absorberende puten.
- Bruk hansker, sette tommelen og pekefingeren rundt øyet og skyv huden til proptose øyeeplet.
- Stikk vinklet saks mellom huden og øyeeplet og forsiktig kutte ut øyet. For å unngå forurensning, kort dypp øyet i 70% etanol.
- Umiddelbart plassere øyet i fosfat-bufret saltvann (PBS) i en Petriskål.
- Gjenta 2.2-2,4 fjerne det andre øyet.
3. øye disseksjon
- Fjern forsiktig bindevev fra øyet under dissecting mikroskop. Dette kan gjøres i PBS eller på tørr Petriskål.
- Bruk suturing tang til å løfte bindevev fra øyeeplet og klipp dem ut med Vannas saks. Ikke klippe sclera fordi det er praktisk talt umulig å skaffe de intakt bakre eyecups hvis sclera er kuttet.
- Etter rengjøring connective vev, holde de resulterende øyeepler i PBS for neste vaske trinn.
Merk: Alle følgende trinn skal utføres i laminær strømning regjering under sterile forhold.
- Vaske øynene to ganger i forvarmes 37 ° C DMEM (høy glukose). Nøye overføre eyeballs i forvarmes 37 ° C DMEM (høy glukose) ved hjelp av pinsett. Sug opp medium og overføre eyeballs til frisk medium i en ny rett.
- Sug opp DMEM (høy glukose) medium og ruge øynene i forvarmes 2% (wt/vol) dispase II arbeider løsningen for 45 min i 37 ° C inkubator.
Merk: I alle de følgende trinnene, plasser og manipulere øyne eller eyecups i vekst medium, som beskytter vev og gir en god medium for dissection. - Fjerne dispase II løsningen og vask øynene to ganger i vekst medium ved aspirating gamle mediet og legge til nye forvarmes 37 ° C vekstmediet (figur 1a).
Merk: Etter dissosiasjon av dispase II, eyeballs bli myk. - Holde øye med tang og gjør en snitt rundt ora-serrata av hvert øye med Vannas saks under dissecting mikroskopet plassert i laminær strømning kabinett.
- Holde øyeeplet i løsningen, forsiktig fjerne fremre hornhinnen ved å utvide kuttet rundt ora serrata omkretsen og trekke fremre hornhinnen bort etter kuttet er fullført.
- Fjern linsen capsule og tilknyttede iris pigmentert epitel ved forsiktig trekker dem ut av eyecup med teethed tang (figur 1b, 1 c).
- Inkuber de resulterende bakre eyecups i vekst medium for 20 min på 37 ° C til rette for separasjon av neural netthinnen fra RPE.
- Skjær de bakre eyecups i 4 kronblad under dissecting mikroskopet plassert i laminær strømning kabinett. Kutt skal være lang nok å flate eyecup, men kort nok til å holde kronbladene koblet (figur 1 d).
- Flate eyecup og fjerne neural netthinnen ved å dra det veldig forsiktig med tang mens du holder den gjenværende RPE-akkord-sclera kompleks med en tang (figur 1e). Begynne å trekke fra kantene ikke som sentrum.
- Overføre alle kvartering vev til en ny steril kultur parabol fylt med forvarmes 37 ° C vekst medium.
4. isolering av primære RPE celler
- Holde ett blomsterblad i kvartering RPE-akkord-sclera komplekset med fine super tang, løsner forsiktig intakt ark med RPE fra underliggende kjelleren membranen (Bruchs membran) ved hjelp av en Mikrokirurgiske halvmåne kniv under dissecting mikroskopet plassert i laminær strømning kabinett (figur 1f).
- Overføre RPE arkene i den nye steril kultur parabolen med oppblomstringen medium ved hjelp av P200 brønnene. Når du overfører RPE ark, våt pipette-spisser med vekst medium av pipettering flere ganger slik at vev henger i spissen. RPE blir klart kan skilles fra akkord: RPE ser mer brun, mens akkord er mørkere og ser klissete og luftig.
- Alternativt bruke enzymatisk fordøyelsen og mild dissosiasjon uten tang koble RPE fra de choroid14.
- Vask RPE ark 2 - 3 ganger ved hjelp av forvarmes 37 ° C vekstmediet i steril kultur parabolen. Etter hver vask trinn nøye samle RPE ark samtidig unngå andre vev som netthinnen rusk eller akkord. På slutten av siste vask samle RPE ark med P200 brønnene og plassere dem i en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
Merk: Det er ikke nødvendig å sentrifuge RPE ark: de vil sedimenter av tyngdekraften innen 1 min. - Fjerne ekstra vekstmediet bruker P200 brønnene. Resuspend cellene i frisk forvarmes oppblomstringen medium og forsiktig triturate dem ved hjelp av P200 brønnene. Unngå dannelse av bobler. En enkeltcelle suspensjon er ideell, men også unngå mye føden, ellers RPE celler er ikke stand til å overleve. Vi anbefaler svært forsiktig føden for 40 - 50 ganger.
5. dyrking RPE celler
- Plate cellene i en kultur plate.
- Hvis nedstrøms programmer RPE cellene trenger beholder sine polaritet, celler plate av RPE fra 2 mus i en 12 mm polyester membran setter inn forhåndsinstallert i 12-brønnen plater. Kontaktflate cellene på høy tetthet er ønsket fordi i dette tilfellet RPE celler kunne holde de opprinnelige egenskapene, for eksempel Sekskantet form og pigmentering.
- Ikke Flytt platen eller endre vekstmediet for første 72 h av dyrking. Etter 3 dager, erstatte den gamle mediet med fersk forvarmes vekstmediet. Etter det endre kultur medium annenhver dag. Når RPE celler kommer confluency, redusere FBS i vekst medium til 2%.
Merk: Cellene kan deles med 0,25% trypsin. Men etter å splitte kan cellene miste sin Sekskantet form og pigmentering i etterfølgende avsnittene. Vi anbefaler ikke dele cellene, men hvis det kreves av nedstrøms programmer kultur, husk at primære cellene ikke kan være passaged på ubestemt tid: de er kjent for de skille etter 5-7 ganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen primære RPE kulturen etablert fra 2 mus i 12 mm polyester membran sett inn når 90-95% confluency etter 1 uke i kultur. Etter 2 uker med kultur, cellene nådd 100% confluency og begynte å danne en mosaikk av cellene Sekskantet, pigmentert og bi-nucleated. 3 uker av kultur, cellene fortsatte å danne formen og pigmentering, men fikk etter 4 uker en del celler hyperpigmentert (figur 2).
Renheten av den primære RPE celle kulturen kan bli vurdert av immunostaining med RPE65 antistoffer (retinoid isomerohydrolase, en kritisk enzym i virveldyr visuelle syklus som gjør at konvertering av alle-trans-retinyl estere til 11-cis-retinol under phototransduction) (Figur 3røde). Integriteten til celle til celle veikryss og tilstedeværelsen av Sekskantet form kan påvises med phalloinin flekker (Figur 3grønn). I tillegg kan uttrykk ZO-1 protein, en viktig komponent i tett veikryss, valideres vestlige blotting (Figur 4) eller immunostai.
Våre resultater viser at innhentet musen primære RPE kulturer sprer, beholde pigmentering, Sekskantet form og tett veikryss og uttrykke funksjonelle markører som RPE65.
Figur 1 . Forskjellige trinnene i øyet disseksjon hente primære RPE celle kulturer. (en) etter dissosiasjon i 2% dispase, øyet er vasket i vekst medium. (b) den bakre eyecup oppnås ved å fjerne den hornhinnen og linse. (c) den resulterende eyecup er videre renset ved å fjerne tilknyttede iris pigmentert epitel. (d) etter ytterligere inkubasjon i vekst medium, eyecup kuttet radielt for å generere kvadranter. (e) Neural netthinnen skrelles fra gjenværende RPE-akkord-sclera komplekset. (f) The RPE ark er forsiktig atskilt fra Bruchs membran. Merk at RPE ser mer brun (piler), mens akkord er mørkere og veldig klissete. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Primære RPE celler fra en 3 - uke gammel mus kultivert på en 12 mm polyester membran setter forhåndsinstallert i 12-brønnen plater. Musen primære RPE kulturen etablert fra 2 mus i 12 mm polyester membran sett inn når 90-95% confluency etter 1 uke i kultur (a). Etter 2 uker med kultur, cellene nådd 100% confluency og begynte å danne en mosaikk av sekskantede, pigmentert og bi-nucleated celler (b). Av 3 uker kultur cellene fortsatte å danne formen og pigmentering (c), men fikk etter 4 uker en del celler hyperpigmentert (d). Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Den RPE celle markøren, RPE65, er synlig i hovedknappen på musen RPE celler. Hovedknappen på musen RPE celler etter 4 uker kultur ble løst i 4% paraformaldehyde (PFA) og inkubert med RPE65 antistoffer eller blokkerer bufferen som kontrollen negative (NC). Phalloidin (grønn) og DAPI (blå) ble også lagt stain cellemembraner og kjerner. Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Markøren av tett knutepunktene, ZO-1 er uttrykt i primære RPE cellene. Hovedknappen på musen RPE celler (mRPE) ble høstet etter 3 uker av kultur og 8 µg cellen lysate ble kjørt på en Western blot. Tilsvarende beløp for ARPE-19 cellene (kommersielt tilgjengelig stabil RPE celle linje) ble brukt som en negativ kontroll. ZO-1 ble svært uttrykt i primære RPE cellene samtidig være fraværende fra ARPE-19 celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presenteres detaljert protokollen kan pålitelig etablering av musen primære RPE kulturer som nå confluency etter 1 uke og presentere RPE hovedegenskapene som Sekskantet form og pigmentering etter 2 uker. Innhentet RPE cellene kan brukes til en rekke nedstrøms programmer som vitamin A metabolisme9, fagocytose photoreceptor ytre segmenter10 og ion transport11, tarmepitelet polaritet2lysosomale homeostase, og autophagy12,13. Avhengig av programmet nedstrøms morfologi av avledede kulturer kan valideres av overføring og skanning elektronmikroskop som beskrevet i detalj andre steder14. Flere analyser å demonstrere modning av kulturer kan omfatte transepithelial motstand (TEER) analysen for å demonstrere polaritet RPE cellene, permeabilitet søk4,22, funksjonelle tester (fagocytose 23) og dome formasjon.
I vår erfaring, mer cellene er belagt i en brønn, bedre confluency og fenotypen. I denne protokollen seeded vi RPE cellene fra 2 mus på en 12 mm setter. Men er det også mulig å sette RPE celler fra 2 mus i en 6,5 setter inn å få bedre confluency og TEER. Mange studier, er plater for RPE cellekulturer belagt med Matrigel eller laminin. Vi har ikke sett en betydelig forskjell i RPE celle vedlegg til disse fartøyene med eller uten belegg. I tillegg kan andelen FBS i kultur medium endres for å oppnå bedre resultater. 10% FBS er vanligvis god for å nå confluency, men synker til mindre FBS synes å være gunstig for RPE differensiering/modning14,17.
Den viktigste begrensningen av denne metoden er behovet for presis opplæring av personen som utfører øye disseksjoner for å sikre maksimal effektivitet av RPE celle utvinning uten kryss-kontaminering med celler Hentet fra andre okulær vev. For å unngå kryss-kontaminering, forskeren burde beherske det kritiske trinnet av denne fremgangsmåten: forsiktig peeling av netthinnen etterfulgt av nøyaktig separasjon av RPE fra akkord. Renheten av innhentet kulturer kan valideres bruker RPE-spesifikke immunostaining. Et antall RPE merkene er tilgjengelige for karakterisering av RPE kulturer, inkludert gener involvert i visuelle syklus, barriere og transport funksjon, metabolisme, fagocytose og melanogenesis15.
En annen begrensning er antallet øyne som kan behandles samtidig for å få kulturer. Generelt anbefaler vi ikke arbeide med mer enn 2 mus samtidig. For å sikre levedyktigheten til de RPE cellene, bør øynene være dissekert så raskt som mulig. Når brukeren bli dyktigere, er det mulig å håndtere mer mus av vekslende inkubasjon ganger.
Samlet en rekke metoder har blitt publisert på etablering primære musen RPE kulturer3,14,15, men for første gang presenterer vi en video versjon av protokollen som fullstendig. Denne protokollen kan brukes som veiledning på øyet disseksjon teknikker. Men kan optimal balanse mellom høy fart og presisjon kreves for dissection oppnås bare med praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DS har mottatt forskningsmidler fra Bayer HealthCare, Tyskland og F. Hoffmann-La Roche, Sveits. Gjenværende forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser. Dette arbeidet støttes av forskning for å hindre blinde (ubegrenset tilskudd til Wilmer Eye Institute og Universitetet i Pittsburgh). Dette arbeidet er også støttet av oppstart midler til DS fra Oftalmologi, University of Pittsburgh.
Acknowledgments
Denne studien var delvis finansiert av BrightFocus stiftelsen (som DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
