Summary
2 光子レーザーを介して細胞膜が負傷した膜を再シール能力評価に広く使われている方法で、複数の細胞のタイプに適用できます。ここでは、体外でライブ イメージング dysferlinopathy 2 光子レーザー アブレーション患者細胞の膜を再シールするためのプロトコルについて述べる.
Abstract
数多くの病態生理学的侮辱は細胞膜に損傷を与えることができるし、細胞膜修復または整合性の生来欠陥と相まって病で発生する可能性が。周囲の細胞膜修復基盤となる分子機構の解明は、したがって、機能不全の細胞膜の動態と関連する疾患の新規治療戦略の開発に重要な目的。細胞膜を再シールするさまざまな疾患のコンテキストで理解することを目的とした多くのin vitroとin vivoの研究は、次の実験的治療機能の結果を決定するための標準として 2 光子レーザー焼灼を利用します。この分析では、細胞膜が破裂し、細胞に侵入する蛍光色素細胞膜をおこす二光子励起レーザーと負傷にさらされます。セル内での蛍光の強度は、自体を再シールする細胞の能力を定量化する監視できます。アプローチ自体が負傷した二光子レーザーで大きな変化と同様、傷害、細胞膜の応答を評価するためのいくつかの方法があります、したがって、セルが負傷したの単一の統一されたモデルは有益減少になるだろう、これらの方法のバリエーション。この記事では、細胞膜修復体外の両方の健康と dysferlinopathy 患者線維芽細胞細胞トランスフェクション フルレングス ジスフェリン プラスミドの有無を評価するためのプロトコルが負傷した単純な二光子励起レーザーを概説します。
Introduction
真核細胞の細胞膜は、細胞の内か細胞外の環境を定義し、細胞の恒常性と細胞の生存を維持するために不可欠ですタンパク質がちりばめられたリン脂質の二重層で構成されます。機械的又は化学的侮辱から生じる細胞膜損傷、様々 な哺乳類の細胞のタイプで平凡、骨格を含む、心筋、胃、肺細胞は1,2,3,4。毎日生理機能の結果としての傷害、に加えては、環境の侮辱、細菌毒素、虚血再灌流5によって細胞膜を破損ことができます。細胞膜の破裂を再シールに失敗につながる細胞外 Ca2 +- - その他の潜在的に有害細胞コンポーネントと共に無秩序な流入、細胞へ細胞になることができますすぐに下流の信号カスケードをトリガー死1,4,5,6。
日には、細胞膜修復のためいくつかの提案されたモデルがずっとあります。サイズや膜破裂の性質に応じて異なる修復メカニズムが起動できます。たとえば、側方流動や目詰まり小さな混乱を修復するタンパク質が細胞膜を利用することが示唆された (< 1 nm)。側面の融合モデルを提案する膜が破裂するがジスフェリン含む横募集を通して出される急速に膜7、蛋白質モデルの目詰まり小さな穿孔がタンパク質集計を出されることを示唆しています。(大抵アネキシン)8します。 逆に、大きい膜病変を引き起こす Ca2 +-依存、ジスフェリンを介した小胞融合し修復パッチの形成。修理パッチ モデルでセルに急速な Ca2 +流入トリガー形複合体や細胞内小胞の融合と共に「パッチ」複数のタンパク質 (ジスフェリン、アネキシン、mitsugumin-53、EDH 蛋白質) の募集やリソソーム膜のサイトで4,9,10、11,12に損傷を与えます。これらのモデルは必ずしも相互に排他的ではありませんし、膜の修復を容易にするコンサートで動作可能性がありますに注意してくださいすることが重要です。細胞膜の損傷を正しく再シールに失敗した筋ジストロフィー (dysferlinopathy - 三好ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィーのタイプ IIB、前方脛骨発症型ミオパチーなど) を含む複数の病気の状態に関連付けられています。13、心筋症の14、および Chediak-東症候群 (CHS)15。
その適切な細胞膜の完全性と演劇を再シール健康と病気、そのような重要な役割細胞膜修復の分子機構の解明理解有益となる新しい治療戦略の検索で。したがって、速度を監視し、細胞膜修復の能力を評価する適切な実験技術を保有する必要は。細胞膜修復をモデル化するためいくつかの培養方法を設計されています。1 つの戦略には、機械的損傷、細胞をこするピペット/手術/刃またはセル16のガラスビーズの寝返りによってを通じて促進することができますが含まれます。ただし、機械的損傷のこのタイプはより大きな病変を生成し、細胞損傷、内や文化の間の変化の高度を作成します。
膜の傷を生成する別の方法は、二光子励起顕微鏡法によるレーザーアブレーションです。単一光子励起を採用し従来のレーザー共焦点顕微鏡と対照をなして 2 光子レーザーは同時に17の高エネルギー電子の励起を容易にするのに 2 つの長波長、低エネルギーの光子を使用します。この非線形プロセス結果励起焦点面でのみ、全体の光路17 (図 1) にはないです。これは、削減励起ボリューム イメージングの生きているセル18,19時に光損傷を最小限に抑えることです。研究者は、細胞膜とモニター膜は蛍光染料を使用し、細胞膜が破裂し、reseals としての蛍光強度の変化を観察することによってリアルタイムで再封止の正確な病変を生成することが従って。
このアプローチは、 in vitroとin vivoが負傷した膜を研究に使用されました、複数セルのタイプ20,21。たとえば、膜は、線維芽細胞および dysferlinopathy この技術22,23を行った患者由来細胞の欠陥を修復します。また、マウスから隔離された単一の筋線維は、修復パッチ形成13,24,25を監視する使用されました。9単一の筋線維の細胞膜修復中の蛍光付けられた蛋白質の動きを観察することも。さらに、ゼブラフィッシュ胚における二光子励起レーザーが負傷した後, 修復のプロセスは、26リアルタイム体内で観察できます。
この記事で私たちは能力を再封止膜の定量化を目的として様々 な細胞タイプにこの方法論を適用できますが、2 光子レーザーの負傷を使用して線維芽細胞細胞膜修復の動態を評価するための方法論を概説します。生体外で。FM4 64 セルに孵化するこの方法では、すぐに否定的に連結され、蛍光を発する脂溶性、細胞不浸透性染料の帯電膜病変から細胞に入ると細胞質内リン脂質 (図 2&3). 色素蛍光膜病変に隣接の定量化により細胞膜自体を封印するためにかかる時間を監視するため。このメソッドの有用性を実証するため細胞膜修復の救助を評価するのに GFP 共役フルレングス ジスフェリン (DYSF) プラスミドをトランスフェクトした dysferlinopathy 患者線維芽を使用します。
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Protocol
本研究で使用されるひと線維芽細胞は、医学部・歯学部アルバータ大学で人間の倫理委員会から承認を得て使用されました。
1. フルレングスの DYSF プラスミドを細胞のトランスフェクション
- 成長媒体 - 36 mL ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、ウシ胎児血清 (FBS) の 4 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) - 37 ° C で CO2インキュベーターの 20 μ L の 40 mL を含む T225 フラスコ培養線維芽細胞
注: セルは約 70-80% の confluency に培養する必要があり、なって完全に合流するべきではないです。 - シードの細胞を準備をするには、40 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のセルを 2 回、リンス セルをデタッチする 0.05% トリプシンの 5 mL を追加します。37 ° c CO2インキュベーターのセルを返すし、5 分のセルを孵化させなさい。
- セルは完全に独立した、トリプシン反応を停止する成長媒体の 40 mL を追加します。
- 診断を使用してセルまたはデバイスを数える別のセルをカウントします。
- 35 mm コラーゲン被覆ガラス底皿に5セル/mL の 1 x 10 のセルの 2 mL をシードします。37 ° C で CO2インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。
注: セルする約 50-60% 合流次の日する必要があります。 - 成長媒体を取り外して 2 ml の血清を奪われたメディア (FBS なし成長媒体)。
- フルレングス ジスフェリン プラスミド lipotransfection を使用してセルを transfect します。
- 1.5 mL チューブ (トランスフェクションするのに各料理の 1 つの管) の血清を奪われたメディアの 150 μ L を準備します。
- 血清を奪われたメディアを含む各 1.5 mL チューブにトランスフェクション試薬の 3 μ L を追加します。それは室温で少なくとも 5 分間インキュベートします。
- 別 1.5 mL チューブに 175 μ L の血清を奪われたメディアとプラスミド DNA の 3.5 μ g を追加します。
注: は、トランスフェクションするのに各追加料理の上記金額を乗算します。 - 150 μ L の血清を奪われたメディアとトランスフェクション試薬の 150 μ L でチューブにプラスミド DNA を含むメディアを組み合わせます。室温で 20 分間インキュベートそれ。
- プラスミド、トランスフェクション試薬とメディアの 300 μ L を料理に均等に分散します。37 ° C で CO2インキュベーターで 24 h の料理を孵化させなさい
- 血清を含む新鮮な成長媒体でメディアを交換し、37 ° C で CO2インキュベーターでさらに 24 時間インキュベート
2 セルの 2 光子負傷試金のための準備
- ピペッティングでメディアを削除、タイロード溶液 1 mL と 1 回細胞を洗浄し、2.5 ミリメートル FM の 1 μ L を含む新鮮なタイロード溶液の 1 mL を追加 4 64 染料。
注: FM 4-64 の染料の最終濃度は 2.5 μ M です。 - カルシウムの欠乏した環境で細胞膜修復の評価が必要な場合は、1 ml の PBS のセルをすすいで 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸を含む PBS の 1 つの mL を追加します。
注: PBS は、細胞が時間の経過を切断すると負傷のアッセイは、できるだけ早く完了する必要があります。
3. 2 光子レーザー負傷アッセイ
- 倒立の共焦点顕微鏡と関連付けられたプログラム ソフトウェアを使用して、0.2 μ x 2 μ m ターゲットを作成し、細胞膜の端にそれを置き、ターゲット ラインと重なるし、細胞膜 (図 2) の方向に垂直であります。
- FM 色素信号を励起し、600-760 nm の検出範囲の設定 543 nm HeNe レーザーを使用します。GFP 信号 (図 4) をエキサイト 500 550 nm の検出範囲を設定し、488 nm アルゴン レーザーを使用します。
- 作成の 5 分の時系列連続画像スキャン、イメージ投射セルのすべての 5 s。
- 膜病変を生成するには、820 nm、15% を使用してに設定 2 光子レーザーを用いた漂白剤細胞はレーザ 10 の反復処理で出力と時系列の初めの後細胞 25 s をブリーチします。
- FM 4-64 色素蛍光を定量化するには、ソフトウェアを使用して、利益 (率 ROI) の 6 μ x 6 μ m 領域を描画し、負傷の場所と (図 3) のセル内に配置。
注: ソフトウェアで-このアプリケーションで「範囲インジケーター」関数を使用してピクセル過飽和のサンプリング エリアを避けるために、赤いピクセルは、過飽和ピクセルを表します。統計分析のための電子スプレッドシートに未加工の蛍光値をエクスポートします。 - (膜を傷つける前に縦長の平均蛍光値) バック グラウンド値を減算して各時点の相対的な蛍光値を計算し、t 増加額を割って、蛍光値 = 0 (図 5, 6).
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Representative Results
健康な線維芽細胞、dysferlinopathy の非投与患者線維芽細胞、フルレングス ジスフェリン シーケンス機能を再封止膜を評価するために負傷した二光子レーザーを受けたを含むプラスミドをトランスフェクトした患者線維芽細胞リアルタイムで.正常ひと線維芽細胞がレーザーが負傷した FM 4-64 蛍光活性の低レベルを表示し、非投与患者線維芽細胞展示相対蛍光強度損傷の高度 (図 5& 6).フルレングス ジスフェリン プラスミドを導入させた患者の細胞を示し減少の相対的な FM 4-64 の蛍光強度非投与患者のコントロールと比較して健康管理 (図で観察された蛍光値と同等であった5& 6)。
図 1.2 光子励起顕微鏡と 1 光子。伝統的な 1 光子励起顕微鏡システム単一の高エネルギー光子 (紫外線または可視スペクトル) を使用して、(A) の蛍光体を励起します。における 2 光子 (近赤外線) の 2 つの低エネルギー光子、(B) の蛍光体を励起するために使用されます。アウト フォーカス面 (A) から (B) の特定の領域と除外光内に光二光子励起レーザー システムが励起を集中できる方法を示す、焦点面全体で生成される蛍光信号は、シリンダー内で描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.細胞膜にターゲットを配置すること。ソフトウェアを使用すると、0.2 μ x 2 μ m ターゲットが描画および重複して細胞膜に垂直に配置します。矢印は、対象を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.それと FM 色素からの蛍光信号浸透膜破裂をセルします。細胞膜破裂として FM 4-64 の脂溶性色素細胞の浸潤し、結合する細胞質内負荷電リン脂質と蛍光を発する。ソフトウェアを使用すると、利益 (率 ROI) の領域が描画 (ホワイト ボックス) をすることができます、セル内での相対的な蛍光の変化を計算するボックス内の蛍光値を使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.フルレングスの DYSF プラスミドを GFP 共役から蛍光信号します。プラスミド トランスフェクション後患者線維芽細胞は、フルレングスの DYSF 蛋白質を表現します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.時間をかけて蛍光の定量化します。治療グループごとに時間をかけて相対的な蛍光変化を調べるため、ROI 内からコンピューターのソフトウェアによって計算された蛍光値を使用できます。矢印は、レーザーアブレーションの時刻を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.時間をかけて相対的な蛍光の変化します。時期ごとに相対的な蛍光 (RF) 値が (膜を傷つける前に縦長の蛍光値の平均として計算される) バック グラウンド蛍光値指定された蛍光値 (信号から減算することによって計算します。強度 - 背景 = ΔF) ネットを分割増 t で蛍光値の (ΔF) と 0 (F0) を =。そのため、RF = ΔF/F0。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
2 光子レーザーの細胞膜の負傷は、再シールする体外膜のダイナミクスを評価するため正確で汎用性の高い手法です。この記事で dysferlinopathy 患者細胞アッセイが負傷した二光子励起レーザーを使用しての能力を再シールする細胞膜を決定するプロトコルについて述べる。Dysferlinopathy 患者の細胞は細胞膜が再シールに欠陥が他の研究者による調査結果に一貫しているし、筋肉間の原動力を再シールする細胞膜の顕著な類似性をさらに強調することが分かったと非筋細胞の3、11,15,22 を種類します。またフルレングス ジスフェリン シーケンスを含むプラスミドをトランスフェクトした患者の細胞表現型を再シールの欠陥膜から救出されたことを認め、そのフルレングス ジスフェリン プラスミドは非筋の表現型を救うことができますを示す筋27のようにセル型も。
一緒に、我々 の結果は測定のゴールド スタンダードは細胞膜を再シール能力体外として可能性と 2 光子膜負傷アッセイの信頼性を強化します。しかし、コストと 2 光子顕微鏡に関連付けられている可用性は潜在的な試金が負傷した 2 光子膜を利用しようとしていくつかの研究グループのための要因を制限するかもしれない。さらに、我々 のセットアップは、体外作業に適していますが、生体内イメージングはあまり適して可能性があります倒立共焦点顕微鏡を利用しています。
2 光子レーザーの配置の精度は技術の成功に重要な注意してくださいが重要です。我々 の経験で発生した最も一般的な問題をだったレーザーの配置のトラブルシューティングします。レーザーが負傷した時に成功したヒットを獲得する能力に影響を与える可能性があります他の問題には、ステージだけでなく、ソリューションのセルの方向ガラス底皿の平準化が含まれます。
アッセイは、細胞膜の完全性または再シールは不安、病気の状態を調査し、現在および将来の研究および治療、遺伝子治療やアンチセンス オリゴヌクレオチド ベース療法、効果が得られるなどの効果に適用されます。新規の治療オプションをできるように膜動態を特徴付けるため効果的な試金は28,29を検討しました。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、技術革新 (CFI) のアルバータ大学学部医学と歯学、友人のギャレット カミング研究椅子基金、HM のトゥーピン神経科学研究の椅子基金、筋ジストロフィー カナダ、カナダの財団によって支えられました。アルバータ州の高度な教育と技術 (AET)、カナダ保健研究 (機構)、ジェシーの旅 - 遺伝子と細胞療法、女性と子供の健康研究所 (WCHRI) のための基礎機構とアルバータ州革新健康ソリューション (AIHS).
博士スティーブン ラヴァルをありがとうフルレングス ジスフェリン プラスミドをご提供したいと思います。技術的助言の Katsuya Miyake 先生に感謝も申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
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