Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Resumo

Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.

Resumo

Numerosos insultos fisiopatológicos podem danificar as membranas celulares e, quando combinada com defeitos inatos na reparação da membrana celular ou integridade, podem resultar em doença. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes em torno de reparo da membrana celular, portanto, é um objectivo importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para doenças associadas à dinâmica disfuncional da membrana celular. Muitos estudos in vitro e em vivo vistos compreender a membrana celular de fechamento em diversos contextos de doença utilizam ablação a laser dois fotões como um padrão para determinar os resultados funcionais após tratamentos experimentais. Neste ensaio, as membranas celulares são sujeitas a ferindo com um laser de dois fotões, que faz com que a membrana da célula, ruptura e tintura fluorescente para se infiltrar na célula. A intensidade da fluorescência dentro da célula em seguida pode ser monitorada para quantificar a capacidade da célula de selar em si. Existem vários métodos alternativos para a avaliação da membrana celular resposta a lesão, bem como a grande variação na laser dois fotões ferindo abordagem em si, portanto, um modelo de célula ferindo unificada beneficamente serviria para diminuir o variação entre estas metodologias. Neste artigo, nós esboçamos um laser simples de dois fotões ferindo o protocolo para a avaliação da membrana celular reparação in vitro em ambos saudáveis e dysferlinopathy paciente fibroblastos células transfectadas com ou sem um plasmídeo dysferlin completos.

Introdução

A membrana celular das células eucarióticas é composto por uma camada dupla de fosfolipídios cravejado de proteína que define o ambiente intra/extracelular da célula e é essencial para manter a sobrevivência celular de homeostase e célula. Membrana celular lesões decorrentes de insultos mecânicos ou químicos são comuns em vários tipos de células de mamíferos, incluindo esquelético e músculo cardíaco, estômago e pulmão células^1,2,3,4. Além de lesões consequentes para funções fisiológicas diárias, as membranas das células também podem ser dani....

Protocolo

Células de fibroblastos humanos utilizadas neste estudo foram utilizadas com aprovação do Comitê de ética humana da faculdade de medicina e Odontologia da Universidade de Alberta.

1. transfecção de células com longa-metragem do plasmídeo DYSF

1. Células de cultura de fibroblastos num balão de T225 contendo 40 mL de meio de crescimento - de mL 36 Dulbecco modificado águia médio (DMEM), 4 mL de soro fetal bovino (FBS) e 20 µ l de penicilina/estreptomicina (P/S) - numa incubadora de CO₂ a 37 ° C.
   Nota: As células devem ser cultivadas para aproximadamente 70-80% de confluência e não devem tornar-se completamente confluent....

Resultados

Fibroblastos humanos saudáveis, fibroblastos de pacientes não tratados dysferlinopathy e pacientes fibroblastos transfectados com um plasmídeo que contém a sequência de dysferlin completos foram submetidas a dois fotões laser ferindo para avaliar a capacidade de fechamento de membrana em tempo real. Células de fibroblasto humano saudável exibida baixos níveis de ativação de fluorescência FM 4-64 seguindo do laser ferindo e fibroblastos de pacientes não tratados exibiram um alto grau de in.......

Discussão

Dois fotões laser ferindo da membrana celular é uma técnica precisa e versátil para avaliar a dinâmica da membrana em vitrode fechamento. Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação da membrana celular, habilidade em dysferlinopathy paciente células usando o laser de dois fotões ferindo o ensaio de fechamento. Nossos resultados mostram que a paciente células dysferlinopathy são defeituosas na membrana celular de fechamento, que é consistente com resultados por outros pesquisadores e que destaca ai.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Soro Fetal	Bovino Sigma-Aldrich	F1051
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina	Sigma-Aldrich	D8537
35mm pratos com fundo de vidro revestidos de colágeno	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Mídia privada de soro	Thermo Fisher	31985070
Reagente de transfecção	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Corante	Invitrogen	T13320
Tyrode' s Sais Solução	Sigma-Aldrich	T2397
Microscópio confocal de varredura a laser	Carl Zeiss	NA
Chameleon Laser de dois fótons	Coerente	NA