Summary
Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.
Abstract
Numerosos insultos fisiopatológicos podem danificar as membranas celulares e, quando combinada com defeitos inatos na reparação da membrana celular ou integridade, podem resultar em doença. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes em torno de reparo da membrana celular, portanto, é um objectivo importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para doenças associadas à dinâmica disfuncional da membrana celular. Muitos estudos in vitro e em vivo vistos compreender a membrana celular de fechamento em diversos contextos de doença utilizam ablação a laser dois fotões como um padrão para determinar os resultados funcionais após tratamentos experimentais. Neste ensaio, as membranas celulares são sujeitas a ferindo com um laser de dois fotões, que faz com que a membrana da célula, ruptura e tintura fluorescente para se infiltrar na célula. A intensidade da fluorescência dentro da célula em seguida pode ser monitorada para quantificar a capacidade da célula de selar em si. Existem vários métodos alternativos para a avaliação da membrana celular resposta a lesão, bem como a grande variação na laser dois fotões ferindo abordagem em si, portanto, um modelo de célula ferindo unificada beneficamente serviria para diminuir o variação entre estas metodologias. Neste artigo, nós esboçamos um laser simples de dois fotões ferindo o protocolo para a avaliação da membrana celular reparação in vitro em ambos saudáveis e dysferlinopathy paciente fibroblastos células transfectadas com ou sem um plasmídeo dysferlin completos.
Introduction
A membrana celular das células eucarióticas é composto por uma camada dupla de fosfolipídios cravejado de proteína que define o ambiente intra/extracelular da célula e é essencial para manter a sobrevivência celular de homeostase e célula. Membrana celular lesões decorrentes de insultos mecânicos ou químicos são comuns em vários tipos de células de mamíferos, incluindo esquelético e músculo cardíaco, estômago e pulmão células1,2,3,4. Além de lesões consequentes para funções fisiológicas diárias, as membranas das células também podem ser danificadas por insultos ambientais, toxinas bacterianas e reperfusão isquêmica5. Falha de selar rupturas na membrana celular leva ao influxo não regulamentado de extracelular Ca2 +- juntamente com outros componentes extracelulares potencialmente tóxicos - dentro da célula, desencadeando cascatas de sinal a jusante que rapidamente podem resultar em células morte1,4,5,6.
Até à data, tem havido vários modelos propostos para o reparo de membrana nas células. Mecanismos de reparação diferentes podem ser ativados, dependendo do tamanho e da natureza da ruptura da membrana. Por exemplo, sugere-se que as membranas celulares podem utilizar fluxo lateral ou proteína entupimento para reparar pequenas interrupções (< 1 nm). O modelo de fusão lateral propõe que rupturas de membrana são rapidamente reparadas através de recrutamento lateral de dysferlin contendo membrana7, enquanto a proteína entupimento modelo sugere que pequenas perfurações são remendadas através de agregações de proteínas (principalmente anexinas) 8. Inversamente, desencadear lesões maiores de membrana Ca2 +-dependente, mediada por dysferlin vesículas fusão e formação de um remendo do reparo. No modelo de remendo de reparação, um rápida Ca2 + influxo para a célula dispara o recrutamento de várias proteínas (dysferlin, anixinas, mitsugumin-53 e proteínas EDH) que formam um complexo ou "patch", juntamente com uma fusão de vesículas intracelulares ou lisossomos no local da membrana danificar4,9,10,11,12. É importante notar que estes modelos não são necessariamente mutuamente exclusivos e podem trabalhar em conjunto para facilitar a reparação da membrana. Falha de selar corretamente o dano da membrana celular está associada a vários Estados da doença, incluindo distrofia muscular (dysferlinopathy - incluindo Miyoshi miopatia, membro-cinta distrofia muscular tipo IIB e miopatia distal com início tibial anterior) 13, cardiomiopatia14e Chediak-Higashi síndrome (CHS)15.
Dada essa integridade adequada da membrana celular e peças de fechamento um papel tão importante na saúde e na doença, uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares subjacentes do reparo da membrana celular seria benéfica na busca de novas estratégias terapêuticas. É, portanto, necessário possuir técnicas experimentais adequadas para a cinética de monitorar e avaliar a capacidade de reparação da membrana celular. Vários métodos em vitro para reparação de membrana de modelagem foram projetados. Uma estratégia envolve lesão mecânica, que pode ser facilitado através da célula a raspar com uma lâmina/navalha pipeta/cirúrgico ou pelo rolamento esferas de vidro sobre as células de16. No entanto, este tipo de lesão mecânica gera lesões maiores e cria um elevado grau de variação no ferimento da pilha, tanto dentro como entre culturas.
Outro método de gerar feridas de membrana é ablação a laser por microscopia de dois fotões. Em contraste com a microscopia confocal laser tradicional que emprega a excitação de fóton único, o laser de dois fotões usa simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longa, baixo consumo de energia para facilitar a excitação de um elétron de alta energia17. Este processo não-linear resulta em excitação exclusivamente dentro do plano focal e não ao longo do trajeto da luz toda17 (Figura 1). Este reduzido excitação volume ajuda a minimizar Fotodano quando de imagens ao vivo de células18,19. Pesquisadores, portanto, são capazes de gerar lesões precisas na membrana celular e monitor membrana efectuou em tempo real usando corantes fluorescentes e observar as alterações da intensidade de fluorescência como a ruptura da membrana celular e, depois, regenere.
Esta abordagem tem sido usada repetidamente para estudar a membrana ferindo em vitro e em vivo e em célula de vários tipos de20,21. Por exemplo, a membrana reparar defeitos em fibroblastos e myotubes derivado de dysferlinopathy, os pacientes foram avaliados utilizando esta técnica22,23. Também, única fibras musculares isoladas de ratos foram usadas para monitorar reparo remendo formação13,24,25. O movimento de proteínas fluorescente etiquetados também pode ser observado durante o reparo da membrana em fibras de músculo único9. Além disso, o processo de reparação mecanismos a seguir dois fotões laser ferindo em embriões de peixe-zebra pode ser observado em tempo real na vivo26.
Neste artigo, descrevem uma metodologia para avaliar a dinâmica de reparo da membrana celular em fibroblastos usando dois fotões laser ferindo, embora esta metodologia pode ser aplicada a vários tipos de células com a finalidade de quantificar a membrana plasmática, capacidade de fechamento em vitro. Neste método, as células são incubadas com FM4-64, um corante lipofílico, célula-impermeável que fluoresce rapidamente a como liga-se ao negativamente carregada de fosfolipídios no citoplasma ao entrar na célula através da lesão de membrana (Figura 2& 3). quantificação da fluorescência do corante adjacente à lesão de membrana permite o monitoramento do tempo que leva para a membrana da célula de selar em si. Para exemplificar a utilidade desse método, usamos dysferlinopathy paciente fibroblastos transfectados com plasmídeos dysferlin completos GFP-conjugados (DYSF) para avaliar o resgate de reparo da membrana celular.
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Protocol
Células de fibroblastos humanos utilizadas neste estudo foram utilizadas com aprovação do Comitê de ética humana da faculdade de medicina e Odontologia da Universidade de Alberta.
1. transfecção de células com longa-metragem do plasmídeo DYSF
- Células de cultura de fibroblastos num balão de T225 contendo 40 mL de meio de crescimento - de mL 36 Dulbecco modificado águia médio (DMEM), 4 mL de soro fetal bovino (FBS) e 20 µ l de penicilina/estreptomicina (P/S) - numa incubadora de CO2 a 37 ° C.
Nota: As células devem ser cultivadas para aproximadamente 70-80% de confluência e não devem tornar-se completamente confluentes. - Para preparar células para semeadura, enxagúe as células com 40 mL de salina tamponada fosfato (PBS) duas vezes e, em seguida, adicionar 5 mL de tripsina 0,05% para separar as células. Retorno as células a 37 ° c CO2 incubadora e incube as celulas por 5 min.
- Quando as células são totalmente isoladas, adicione 40 mL de meio de crescimento para parar a reação de tripsina.
- Conte as células usando um hemocytometer ou outra célula contando o dispositivo.
- Sementes de 2 mL de células a 1 x 105 células/mL em pratos de vidro-fundo revestido de colágeno de 35 mm. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de CO2 a 37 ° C.
Nota: As células devem ser aproximadamente 50-60% de confluencia no dia seguinte. - Remova a mídia de crescimento e substituí-lo com 2 mL de soro-privado media (mídia de crescimento sem FBS).
- Transfect as células com plasmídeo dysferlin completos usando lipotransfection.
- Prepare 150 µ l de meios privados de soro em um tubo de 1,5 mL (um tubo para cada prato a transfected).
- Adicione 3 µ l de reagente de Transfeccao para cada tubo de 1,5 mL contendo meios privados de soro. Incube-lo pelo menos 5 min à temperatura ambiente.
- Em um tubo separado 1,5 mL, adicione 175 µ l dos meios de comunicação privados de soro e 3,5 µ g do ADN do plasmídeo.
Nota: Multiplica os valores acima para cada prato adicional a transfected. - Combine a 150 µ l de mídia contendo o plasmídeo de DNA em um tubo com 150 µ l de soro privado de mídia e reagente de transfeccao. -Incube por 20 min em temperatura ambiente.
- Distribua uniformemente 300 µ l de mídia com o reagente do plasmídeo e transfecção em todo o prato. Incubar os pratos para 24h numa incubadora de CO2 a 37 ° C.
- Substituir a mídia com a mídia de crescimento fresco com soro e incube-lo para um adicional 24h numa incubadora de CO2 a 37 ° C.
2. preparação de células para ensaio ferindo dois fotões
- Remova a mídia pipetando e enxágue as células uma vez com 1 mL de solução de Tyrode, em seguida, adicione 1 mL de solução de Tyrode fresco contendo 1 µ l de 2,5 mM FM 4-64 tintura.
Nota: A concentração final de tintura de FM 4-64 é 2,5 µM. - Se avaliação de reparação da membrana em um ambiente empobrecido cálcio é desejada, enxágue as células com 1 mL de PBS e em seguida, adicione 1 mL de PBS contendo 1 mM EGTA.
Nota: Como PBS fará com que as células a se destacar ao longo do tempo, o ensaio ferindo deve ser concluído mais rapidamente possível.
3. dois fotões laser ferindo ensaio
- Usando um microscópio confocal invertido e o software programa associado, criar um destino de µm de 0,2 µm x 2 e colocá-lo na borda da membrana celular, para que a linha de destino se sobrepõe e encontra-se perpendicular à direção da membrana celular (Figura 2).
- Use um laser aqui vai de 543-nm para excitar o sinal de FM tintura e definir a escala da deteção para 600-760 nm. Use um laser de argônio 488 nm para excitar o sinal GFP (Figura 4) e definir a escala da deteção para 500-550 nm.
- Criar uma série de tempo de 5 min de exames de imagem sequencial, células de imagem a cada 5 s.
- Para gerar uma lesão de membrana, lixívia células usando um laser de dois fotões definido como 820 nm, usando 15% poder com 10 iterações do laser e lixívia células 25 s após o início da série de tempo.
- Para quantificar a FM 4-64 fluorescência de tintura, use o software para desenhar um 6 µm x 6 µm região de interesse (ROI) e colocá-lo adjacente para o local do ferimento e dentro da célula (Figura 3).
Nota: Evite áreas de amostragem de supersaturação pixel usando a função de "Indicador de intervalo" no software - nesta aplicação, pixels vermelhos representam pixels saturadas. Exporte valores de fluorescência cru em uma planilha eletrônica para análise estatística. - Calcular os valores de fluorescência relativo para cada ponto de tempo subtraindo o valor do fundo (valor médio de fluorescência momentos antes da membrana ferindo) e dividindo o aumento líquido por fluorescência valor em t = 0 (Figura 5, 6) .
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Representative Results
Fibroblastos humanos saudáveis, fibroblastos de pacientes não tratados dysferlinopathy e pacientes fibroblastos transfectados com um plasmídeo que contém a sequência de dysferlin completos foram submetidas a dois fotões laser ferindo para avaliar a capacidade de fechamento de membrana em tempo real. Células de fibroblasto humano saudável exibida baixos níveis de ativação de fluorescência FM 4-64 seguindo do laser ferindo e fibroblastos de pacientes não tratados exibiram um alto grau de intensidade de fluorescência relativo após lesão (Figura 5& 6 ). As células doentes que foram transfectadas com plasmídeo dysferlin completos mostraram FM relativa reduzida intensidade de fluorescência 4-64 em comparação com controles de pacientes não tratados e comparada com valores de fluorescência observados no controle saudável (Figura 5& 6).
Figura 1 . Um fóton versus microscopia de dois fotões. Em um sistema tradicional de um fóton de microscópio, um fóton único de alta energia (UV ou espectro visível) é usado para excitar um fluoróforo (A). Em um sistema de dois fotões, dois fótons de baixa energia (próximo do infravermelho) são usados para excitar um fluoróforo (B). Retratado dentro dos cilindros é o sinal de fluorescência gerado em todo o plano focal, demonstrando como o sistema de laser de dois fotões pode concentrar excitação luz para dentro de uma região específica (B) e excluir a luz dos aviões fora de foco (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Colocando um alvo na membrana celular. Usando o software, um alvo de µm 0,2 µm x 2 desenhado e colocado sobrepostos e perpendicular à membrana celular. A seta indica o destino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Sinal de fluorescência do corante de FM como ele se infiltra na célula através da ruptura de membrana. Como as rupturas de membrana celular, corante lipofílico FM 4-64 se infiltra na célula e fluorescente como liga-se negativamente carregada de fosfolipídios no citoplasma. Usando o software, uma região de interesse (ROI) pode ser desenhada (caixa branca) e valores de fluorescência dentro da caixa podem ser usados para calcular as alterações de fluorescência relativa dentro da célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Sinal de fluorescência do GFP-conjugados completos no plasmídeo DYSF. Na sequência de transfeccao Plasmideo, células de fibroblastos paciente expressam completo proteína DYSF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Quantificação de fluorescência ao longo do tempo. Valores de fluorescência calculados pelo software de computador de dentro o ROI podem ser usados para determinar a relativa fluorescência muda ao longo do tempo para cada grupo de tratamento. A seta indica o tempo de ablação a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Mudança na fluorescência relativa ao longo do tempo. Valores de fluorescência relativo (RF) para cada ponto de tempo são calculados subtraindo os valores de fluorescência determinado (sinal o valor de fluorescência de fundo (calculado como a média dos valores de fluorescência dos momentos antes da membrana ferindo) Intensidade - Background = ΔF) e dividindo a rede aumentar (ΔF) pelo valor de fluorescência em t = 0 (F0). Portanto, RF = ΔF/F0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Dois fotões laser ferindo da membrana celular é uma técnica precisa e versátil para avaliar a dinâmica da membrana em vitrode fechamento. Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação da membrana celular, habilidade em dysferlinopathy paciente células usando o laser de dois fotões ferindo o ensaio de fechamento. Nossos resultados mostram que a paciente células dysferlinopathy são defeituosas na membrana celular de fechamento, que é consistente com resultados por outros pesquisadores e que destaca ainda mais as semelhanças marcantes na membrana celular, efectuou a dinâmica entre o músculo e os tipos de células não-musculares3,11,15,22. Observamos também que paciente pilhas transfectadas com um plasmídeo que contém a sequência de dysferlin completos foram resgatadas a partir de sua membrana defeituosa recelagem fenótipo, demonstrando que o plasmídeo dysferlin completos pode resgatar fenótipo em não-músculo tipos de células, bem como no músculo27.
Juntos, nossos resultados reforçam a viabilidade e a confiabilidade do ensaio ferindo dois fotões membrana como um padrão-ouro na medição de célula membrana auto-vedante capacidade em vitro. No entanto, o custo e disponibilidade associados com dois fotões microscopia podem ser um potencial limitando fator para alguns grupos de pesquisa que procuram utilizar a membrana dois fotões ferindo o ensaio. Além disso, nossa configuração utiliza um microscópio confocal invertido, que é adequado para trabalho em vitro , mas pode ser menos apropriado para a imagem latente na vivo .
É importante notar que a precisão do alinhamento do laser dois fotões é crítica para o sucesso da técnica. Em nossa experiência, solução de problemas de alinhamento do laser foi o problema mais comum encontrado. Outros problemas que poderiam afetar a capacidade de marcar sucessos bem sucedidos durante laser ferindo incluem o nivelamento do prato fundo de vidro sobre o palco, bem como a orientação das células em solução.
O ensaio é aplicável aos actuais e futuros estudos investigando Estados de doença em que a integridade da membrana celular ou fechamento é perturbado e a eficácia das terapias, tais como terapia gênica e terapia baseada em do oligonucleotide antisentida, que beneficiaria de ter um ensaio eficaz para caracterizar a dinâmica de membrana para que novas opções terapêuticas podem ser exploradas de28,29.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Alberta faculdade de medicina e odontologia, os amigos de Garrett Cumming cadeira fundo de pesquisa, HM Toupin fundo de cadeira de pesquisa neurológica de ciência, Distrofia Muscular Canadá, Canadá Foundation para inovação (CFI), Alberta educação e tecnologia avançada (AET), institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR), viagem de Jesse - Fundação para o Gene e terapia celular, as mulheres e Instituto de pesquisa de saúde infantil (WCHRI), e Alberta inova saúde soluções (AIHS ).
Gostaríamos de agradecer o Dr. Steven Laval para nos fornecer o plasmídeo dysferlin completos. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Katsuya Miyake para aconselhamento técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
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