Summary
Herir la membrana de la célula a través de dos fotones láser es un método ampliamente utilizado para evaluar la capacidad mismo-resellado de la membrana y se puede aplicar a múltiples tipos de células. Aquí, describimos un protocolo en vitro en vivo imágenes de cierre de membrana en células de pacientes dysferlinopathy después de la ablación láser de dos fotones.
Abstract
Numerosos insultos fisiopatológicos pueden causar daño a las membranas celulares y, cuando está juntado con defectos naturales en la reparación de la membrana de la célula o integridad, pueden resultar en enfermedad. Comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes que rodean la reparación de la membrana de la célula es, por tanto, un objetivo importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para enfermedades asociadas a la membrana celular disfuncional dinámica. Muchos estudios in vitro e in vivo para entender el cierre de membrana de la célula en diversos contextos de la enfermedad utilizan la ablación del laser de dos fotones como un estándar para la determinación de los resultados funcionales después de tratamientos experimentales. En este ensayo, las membranas celulares son sometidas a heridas con un láser de dos fotones, que hace que la membrana de la célula a la ruptura y el colorante fluorescente para infiltrarse en la célula. La intensidad de fluorescencia dentro de la célula puede controlarse entonces para cuantificar la capacidad de la célula para sellar a sí mismo. Existen varios métodos alternativos para evaluar la respuesta de membrana de la célula a la lesión, así como gran variación en el láser de dos fotones hiriendo a enfoque sí mismo, por lo tanto, un modelo de célula herir unificada beneficioso serviría para disminuir el variación entre estas metodologías. En este artículo, describiremos un láser simple de dos fotones hiriendo a protocolo para la evaluación de membrana celular reparación en vitro en ambos sanos dysferlinopathy paciente fibroblastos y las células transfected con o sin un plásmido de cuerpo entero del dysferlin.
Introduction
La membrana celular de las células eucariotas consiste en una doble capa de fosfolípidos proteína tachonada, que define el entorno intra/extracelular de la célula y es esencial para mantener la homeostasis celular, supervivencia celular. Lesiones de la membrana de la célula derivados de insultos mecánicos o químicos son comunes en varios tipos de células de mamífero, incluyendo esquelético y músculo cardiaco, estómago y pulmón células1,2,3,4. Además de lesiones consiguientes a función fisiológica diaria, las membranas celulares también pueden dañarse por insultos ambientales, toxinas bacterianas y reperfusión isquémica5. Falta para sellar roturas en la membrana celular conduce a un flujo no regulado de extracelular Ca2 +- junto con otros componentes extracelulares potencialmente tóxicos - en la célula, activación de cascadas de la señal descendente que pueden resultar rápidamente en la célula muerte1,4,5,6.
Hasta la fecha, ha habido varios modelos propuestos para la reparación de la membrana en las células. Mecanismos de reparación diferente pueden activarse dependiendo del tamaño y naturaleza de la ruptura de la membrana. Por ejemplo, se sugiere que las membranas celulares pueden utilizar flujo lateral u obstrucción para reparar pequeñas alteraciones de proteínas (< 1 nm). El modelo de fusión lateral propone que rupturas de la membrana son rápidamente reparados a través reclutamiento lateral del dysferlin-que contiene la membrana7, mientras que la proteína que el modelo sugiere que se reparar pequeñas perforaciones a través de las agregaciones de la proteína (en su mayoría anexinas) 8. por el contrario, provocar lesiones de membrana más grandes Ca2 +-fusión de la vesícula dependiente, dysferlin-mediada y la formación de un parche de reparación. En el modelo del parche de reparación, una rápida Ca2 + afluencia en la célula provoca la contratación de múltiples proteínas (dysferlin, anexinas, mitsugumin-53 y EDH proteínas) que forman un complejo o un "parche", junto con una fusión de vesículas intracelulares o lisosomas en el sitio de la membrana de dañan4,9,10,11,12. Es importante tener en cuenta que estos modelos no son necesariamente excluyentes y pueden trabajar en conjunto para facilitar la reparación de la membrana. Fracaso para sellar correctamente el daño de la membrana celular está asociado con varios Estados de enfermedad, incluyendo la distrofia muscular (dysferlinopathy - incluyendo Miyoshi myopathy, miembro-rodea distrofia muscular tipo IIB y Miopatía distal con inicio tibial anterior) 13, miocardiopatía14y Chediak-Higashi síndrome (CHS)15.
Dado integridad de la membrana de célula apropiada y resellado juega un papel tan importante en la salud y la enfermedad, una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares subyacentes de la reparación de la membrana de la célula sería beneficiosa en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, es necesario poseer técnicas experimentales adecuadas para la cinética de monitorear y evaluar la capacidad de reparación de la membrana de la célula. Se han diseñado varios métodos en vitro para el modelado de reparación de la membrana. Una estrategia implica lesión mecánica, que puede facilitarse a través de células raspando con una cuchilla/navaja pipeta, quirúrgico o haciendo rodar los granos de cristal sobre el de las células16. Sin embargo, este tipo de lesión mecánica genera lesiones más grandes y crea un alto grado de variación en lesión de la célula, tanto dentro como entre las culturas.
Otro método de generar heridas de membrana es la ablación del laser por microscopia de dos fotones. En contraste con la microscopía confocal de láser tradicional que emplea la excitación de fotones individuales, el láser de dos fotones simultáneamente utiliza dos fotones de longitud de onda larga, bajo consumo de energía para facilitar la excitación de un electrón de alta energía17. Este proceso no lineal produce excitación exclusivamente en el plano focal y no a lo largo de la trayectoria de la luz entera17 (figura 1). Esto reduce la excitación volumen ayuda a minimizar el fotodaño imágenes de células vivas18,19. Los investigadores son capaces de generar lesiones precisa en la membrana de la célula y monitor membrana resellado en tiempo real mediante el uso de tintes fluorescentes y observar cambios en la intensidad de la fluorescencia como la membrana de la célula se rompe y luego reseals.
Este enfoque se ha utilizado repetidamente para estudiar Membrana hiriendo a in vitro y en vivo y en células múltiples tipos de20,21. Por ejemplo, la membrana reparar los defectos en fibroblastos y miotubos derivados de dysferlinopathy los pacientes fueron evaluados utilizando esta técnica22,23. También, solo fibras musculares aisladas de ratones fueron utilizadas para controlar la reparación parche formación13,24,25. También se pueden observar el movimiento de proteínas fluorescente etiquetados durante la reparación de la membrana en fibras musculares individuales9. Además, el proceso de reparación sarcolemales siguiendo dos fotones láser hiriendo en embriones de pez cebra puede observarse en tiempo real en vivo26.
En este artículo, describiremos una metodología para la evaluación dinámica de reparación membrana celular en fibroblastos con dos fotones láser herir, aunque esta metodología puede aplicarse a varios tipos de células con el fin de cuantificar la capacidad de cierre de la membrana del plasma en vitro. En este método, las células se incuban con FM4-64, cargada de un tinte lipofílico, células impermeables que rápidamente aparece como negativa se une a fosfolípidos dentro del citoplasma al entrar en la célula a través de la lesión de la membrana (figura 2& 3). cuantificación de la fluorescencia del tinte adyacente a la lesión de membrana permite supervisar el tiempo que tarda para que la membrana de la célula sellar a sí mismo. Para ejemplificar la utilidad de este método, utilizamos fibroblastos pacientes dysferlinopathy transfectados con GFP conjugados completos dysferlin (DYSF) plásmidos para evaluar el rescate de la reparación de la membrana de la célula.
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Protocol
Las células de fibroblastos humanos utilizadas en este estudio fueron utilizadas con la aprobación del Comité de ética humana de la Facultad de medicina y Odontología de la Universidad de Alberta.
1. transfección de células con el plásmido DYSF integral
- Células fibroblastos en cultivo en un matraz T225 que contiene 40 mL de medio de crecimiento - 36 mL Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), 4 mL de suero bovino fetal (FBS) y 20 μl de penicilina/estreptomicina (P/S) - en un incubador de CO2 a 37 ° C.
Nota: Las células deben ser cultivadas a aproximadamente 70-80% de confluencia y no debe ser completamente confluente. - Para preparar las células para la siembra, lavar las células con 40 mL de tampón fosfato salino (PBS) dos veces y, a continuación, añadir 5 mL de tripsina 0,05% para separar las células. Volver a las células a los 37 ° C CO2 incubadora e incubar las células durante 5 minutos.
- Cuando las células están completamente separadas, añadir 40 mL de medio de crecimiento para detener la reacción de la tripsina.
- Contar las células usando un hemocitómetro u otro celular dispositivo de conteo.
- Semilla 2 mL de células 1 x 105 células/ml en platos de fondo de cristal colágeno cubierto de 35 mm. Incube las células durante la noche en un incubador de CO2 a 37 ° C.
Nota: Las células deben ser aproximadamente 50-60% confluente al día siguiente. - Quitar los medios de cultivo y reemplazarlo con 2 mL de suero privados medios (crecimiento sin SFB).
- Transfectar las células con el plásmido de cuerpo entero del dysferlin usando lipotransfection.
- Preparar 150 μL de medios privados de suero en un tubo de 1,5 mL (un tubo para cada plato a ser transfectadas).
- Agregar 3 μl de reactivo de transfección a cada tubo de 1,5 mL que contiene los medios de comunicación privados de suero. Se incuban un mínimo de 5 min a temperatura ambiente.
- En un tubo separado 1,5 mL, añadir 175 μl de medios privados de suero y 3,5 μg de ADN plásmido.
Nota: Multiplique las cantidades anteriores para cada plato adicional a ser transfectadas. - Mezcle 150 μL de medios que contiene ADN de plásmido en un tubo con 150 μL de reactivo de transfección y medios privados de suero. Incubar por 20 min a temperatura ambiente.
- Distribuir 300 μL de medio con el reactivo de plásmido y transfección en el plato. Incubar los platos por 24 h en un incubador de CO2 a 37 ° C.
- Sustituir los medios de comunicación con medios de cultivo fresco con suero e incubar durante 24 h adicional en un incubador de CO2 a 37 ° C.
2. preparación de células de ensayo hirió a dos fotones
- Quitar los medios de comunicación mediante pipeteo y enjuague las celdas una vez con 1 mL de solución de Tyrode, luego agregar 1 mL de solución de Tyrode fresca que contiene 1 μl de 2.5 mM FM tinte 4-64.
Nota: La concentración final de tinte 4-64 de FM es de 2.5 μm. - Si se desea la evaluación de la reparación de la membrana en un ambiente empobrecido en calcio, enjuague las células con 1 mL de PBS y luego añadir 1 mL de PBS con 1 mM EGTA.
Nota: Como PBS hará que las células separar en el tiempo, el análisis de la herida debe completarse lo antes posible.
3. dos fotones láser hirió a ensayo
- Utilizando un microscopio confocal invertido y el software asociado de programa, crear un destino de μm 0.2 μm x 2 y colóquelo en el borde de la membrana celular para que la línea de blanco se superpone y se encuentra perpendicular a la dirección de la membrana celular (figura 2).
- Utilizar un láser de HeNe 543 nm para excitar la señal de FM tinte y establecer el rango de detección para 600-760 nm. Utilizar un láser de argón de 488 nm para excitar la señal GFP (figura 4) y ajustar el rango de detección de 500-550 nm.
- Crear una serie de tiempo de 5 minutos de análisis de imagen secuencial, imagen células cada 5 s.
- Para generar una lesión de la membrana, las células de cloro usando un laser de dos fotones a 820 nm, utilizando el 15% energía con 10 iteraciones del laser y bleach células 25 s después del inicio de la serie de tiempo.
- Para cuantificar FM fluorescencia de tinte 4-64, utilice el software para dibujar un 6 μm x 6 μm región de interés (ROI) y colocar adyacente a la localización de la herida y dentro de la célula (figura 3).
Nota: Evite áreas de muestreo de sobresaturación de píxeles mediante la función "Indicador de rango" en el software - en esta aplicación, píxeles rojos representan píxeles sobresaturados. Valores de fluorescencia crudo de exportación en una hoja de cálculo electrónica para el análisis estadístico. - Calcular los valores de fluorescencia relativa para cada punto del tiempo restando el valor de fondo (valor de fluorescencia promedio de los puntos de tiempo antes de herir la membrana) y dividiendo el aumento neto de la fluorescencia valor en t = 0 (figura 5, 6) .
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Representative Results
Fibroblastos humanos saludables, fibroblastos de pacientes no tratados dysferlinopathy y fibroblastos pacientes transfectados con un plásmido que contiene la secuencia completa del dysferlin fueron sometidos a dos fotones láser hiriendo a evaluar la capacidad de cierre de membrana en tiempo real. Las células de fibroblastos humanos sanos muestran bajos niveles de activación de la fluorescencia de FM 4-64 después de heridas de láser y fibroblastos de pacientes no tratados exhiben un alto grado de intensidad de fluorescencia relativa después de lesión (figura 5& 6 ). Paciente células fueron transfectadas con larga duración del dysferlin plásmido demostraron FM relativa reducida intensidad de fluorescencia 4-64 en comparación con los controles de pacientes no tratados y fueron comparable con los valores de fluorescencia observados en el control sano (figura 5& 6).
Figura 1 . Un fotón versus microscopía de dos fotones. En un sistema de microscopio tradicional de un fotón, un fotón único de alta energía (Ultravioleta o del espectro visible) se utiliza para excitar un fluoróforo (A). En un sistema de dos fotones, dos fotones de menor energía (infrarrojo cercano) se utilizan para excitar un fluoróforo (B). Representado dentro de los cilindros es la señal de fluorescencia generada a lo largo del plano focal, demostrando cómo el sistema de dos fotones láser puede enfocar excitación luz dentro de una región específica (B) y excluir luz de los planos fuera de foco (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Colocar un blanco en la membrana celular. Usando el software, un objetivo de μm 0.2 μm x 2 es atraído y colocado superpuestos y perpendicular a la membrana celular. La flecha indica el destino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Señal de la fluorescencia del tinte de FM que infiltra en la célula a través de la ruptura de la membrana. Como la membrana de la célula se rompe, tinte lipofílico de FM 4-64 infiltra en la célula y es como que une a los fosfolípidos cargados negativamente dentro del citoplasma. Usando el software, una región de interés (ROI) puede ser dibujada (caja blanca) y valores de fluorescencia dentro de la caja pueden utilizarse para calcular cambios de fluorescencia relativa dentro de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Señal de la fluorescencia de GFP-conjugado completa plásmido DYSF. Tras la transfección del plásmido, células fibroblastos pacientes expresan proteína DYSF integral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Cuantificación de la fluorescencia con el tiempo. Valores de fluorescencia calculados por el software de ordenador de dentro el ROI pueden utilizarse para determinar la fluorescencia relativa cambia con el tiempo para cada grupo de tratamiento. La flecha indica el momento de la ablación con láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Cambio en la fluorescencia relativa en el tiempo. Valores de fluorescencia relativa (RF) para cada punto de tiempo se calculan restando el valor de fluorescencia de fondo (calculado como la media de los valores de fluorescencia de los puntos de tiempo antes de herir la membrana) de los valores de fluorescencia dado (señal Intensidad - fondo = ΔF) y dividir la red (ΔF) por el valor de fluorescencia en t = 0 (F0). Por lo tanto, RF = ΔF/F0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Dos fotones láser herir de la membrana celular es una técnica precisa y versátil para la evaluación de la dinámica de la membrana de cierre in vitro. En este artículo, describe un protocolo para determinar la membrana de la célula resellado capacidad en dysferlinopathy paciente células usando el laser de dos fotones hiriendo a ensayo. Nuestros resultados muestran que las células pacientes dysferlinopathy son defectos de cierre de la membrana de la célula, que es consistente con hallazgos de otros investigadores y que más pone de relieve las semejanzas llamativas en la membrana de la célula resellado dinámica entre músculo y los tipos de célula no muscular3,11,15,22. También observamos que pacientes en células transfectadas con un plásmido que contiene la secuencia completa del dysferlin fueron rescatadas de su membrana defectuosa resellado fenotipo, demostrando que ese plásmido dysferlin integral puede rescatar fenotipo muscular no tipos de células, así como en músculo27.
Juntos, nuestros resultados refuerzan la viabilidad y la confiabilidad del ensayo hirió a dos fotones membrana como un estándar de oro para la medición de la célula membrana mismo-resellado capacidad in vitro. Sin embargo, el costo y la disponibilidad asociada a microscopia de dos fotones podrían ser un potencial factor de algunos grupos de investigación que buscan utilizar la membrana dos fotones hiriendo a ensayo limitante. Además, nuestro programa de instalación utiliza un microscopio confocal invertido, que está bien preparado para el trabajo in vitro , pero puede ser menos apropiado para la proyección de imagen en vivo .
Es importante tener en cuenta que la precisión de la alineación de dos fotones láser es fundamental para el éxito de la técnica. En nuestra experiencia, solución de problemas de alineación láser era el problema más común encontrado. Otras cuestiones que puedan afectar a la capacidad de anotar golpes exitosos durante hiriendo a láser incluyen la nivelación de la placa de fondo de cristal en la etapa, así como la orientación de las células en solución.
El ensayo es aplicable a los actuales y futuros estudios investigaron Estados de la enfermedad en la que la integridad de la membrana de la célula o resellado es perturbado y la eficacia de terapias como la terapia génica y la terapia basada en oligonucleótidos antisentida, que beneficiaría a de tener un análisis eficaz para caracterizar la dinámica de la membrana para que nuevas opciones terapéuticas pueden ser había explorado28,29.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Alberta Facultad de medicina y odontología, los amigos de Garrett Cumming silla del fondo de investigación, HM Toupin neurológica fondo silla de la investigación de ciencia, Distrofia Muscular de Canadá, Fundación de Canadá para la innovación (CFI), Alberta educación y tecnología avanzada (AET), institutos canadienses de investigación en salud (CIHR), viaje de Jesse - la Fundación de Gene y terapia celular, las mujeres y el Instituto de investigación de salud de los niños (WCHRI), y Alberta Innovates Health Solutions (AIHS ).
Nos gustaría agradecer a Dr. Steven Laval por proveernos el plásmido de cuerpo entero del dysferlin. También nos gustaría agradecer a Dr. Katsuya Miyake por asesoramiento técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
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