Summary
Cellmembranet såra via två-photon laser är en allmänt använd metod för bedömning av membran återförslutning förmåga och kan användas till flera celltyper. Här beskriver vi ett protokoll för in vitro- live-avbildning av membran återförslutning i dysferlinopathy patientens celler efter två-photon laser ablation.
Abstract
Talrika patofysiologiska förolämpningar kan orsaka skada på cellmembranen och, när den kombineras med medfödda defekter i cellmembranet reparation eller integritet, kan resultera i sjukdom. Förstå de molekylära mekanismer bakom kring cellmembranet reparation är därför ett viktigt mål för utvecklingen av nya terapeutiska strategier för sjukdomar associerade med dysfunktionella cellmembranet dynamics. Många in vitro och in-vivo studier som syftar till att förstå cellmembranet återförslutning i olika sjukdom sammanhang använda två-photon laser ablation som standard för att fastställa funktionella resultat efter experimentella behandlingar. I denna analys utsätts cellmembran för sårande med en två-photon-laser, vilket orsakar cellmembranet till bristning och fluorescerande färg att infiltrera cellen. Intensiteten av fluorescens i cellen kan sedan övervakas för att kvantifiera cellens förmåga att återförsluta själv. Det finns flera alternativa metoder för bedömning av cellmembranet svar på skada, samt stor variation i två-photon laser sårande inställning själv, därför en enhetlig modell för cell såra fördelaktigt skulle tjäna till att minska den variationen mellan dessa metoder. I den här artikeln beskriver vi en enkel två-photon laser såra protokoll för att bedöma cellmembranet reparation in vitro- både friska och dysferlinopathy patienten fibroblast celler transfekterade med eller utan en fullängds dysferlin plasmid.
Introduction
Cellmembranet av eukaryota celler består av ett dubbel-lager av protein-prydda fosfolipider som definierar intra/extracellulära miljön av cellen och är väsentliga för att upprätthålla cellernas homeostas och cell överlevnad. Cellmembranet skador som härrör från mekanisk eller kemisk förolämpningar är vardagsmat i olika proteintillverkningen, inklusive skelett- och hjärtmuskulatur, magen och lung celler1,2,3,4. Förutom skador åtföljande till dagliga fysiologiska funktion, kan cellmembranen också skadas av miljömässiga förolämpningar, bakteriella toxiner och ischemisk reperfusion5. Underlåtenhet att återförsluta spricker i cellmembranet som leder till en oreglerad tillströmning av extracellulära Ca2 +- tillsammans med andra potentiellt toxiska extracellulära beståndsdelar - in i cellen, utlöser downstream signalera kaskader som snabbt kan resultera i cell död1,4,5,6.
Hittills har det varit flera föreslagna modeller för membran reparation i celler. Olika reparationsmekanismer kan aktiveras beroende på storlek och art av membran brista. Till exempel föreslås det att cellmembranen kan utnyttja lateral flow eller protein igensättning för att reparera små störningar (< 1 nm). Den laterala fusion-modellen föreslår att membranet spricker är snabbt lagas genom laterala rekrytering av dysferlin-innehållande membranet7, medan proteinet igensättning modell föreslår att små perforeringar är lagade genom protein aggregeringar (mestadels annexins) 8. omvänt, större membran lesioner utlösa Ca2 +-beroende, dysferlin-medierad vesikler fusion och bildandet av en lagningslapp. I reparation patch modellen, en snabb Ca2 + tillströmning i cellen utlöser rekrytering av flera proteiner (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 och EDH proteiner) som bildar en komplex eller ”patch”, tillsammans med en fusion av intracellulära blåsor eller lysosomer på platsen för membran skada4,9,10,11,12. Det är viktigt att notera att dessa modeller är inte nödvändigtvis utesluter och kan arbeta i samförstånd för att underlätta membran reparation. Underlåtenhet att korrekt återförsluta cellmembranet skador är associerad med flera sjukdomstillstånd, inklusive muskeldystrofi (dysferlinopathy - inklusive Miyoshi myopati, lem-gördel muskeldystrofi typ IIB och distala myopati med främre tibial debut) 13, kardiomyopati14och Chediak-Higashi syndromet (CHS)15.
Med tanke på att ordentlig cellmembranet integritet och återförslutning spelar en så viktig roll i hälsa och sjukdom, en djupare förståelse av de molekylära mekanismer bakom av cellmembranet reparation skulle vara fördelaktigt i sökandet efter nya terapeutiska strategier. Det är därför nödvändigt att inneha lämplig experimentella metoder för att övervaka kinetik och utvärdera förmågan hos cellmembranet reparation. Flera in vitro- metoder för modellering membran reparation har utformats. En strategi innebär mekanisk skada, som kan underlättas genom cell skrapning med en pipett och kirurgiska kniv/rakblad eller genom att rulla glaspärlor över de celler16. Men denna typ av mekanisk skada genererar större skador, och skapar en hög grad av variation i cell skada, både inom och mellan kulturer.
En annan metod för att generera membran sår är laser ablation av 2-foton mikroskopi. I motsats till traditionella laser konfokalmikroskopi som sysselsätter single photon excitation, använder två-photon lasern samtidigt två lång våglängd, låg energi fotoner för att underlätta excitation av en high-energy elektron17. Denna icke-linjär process resulterar i excitation uteslutande inom fokalplanet och inte längs hela ljusstrålen17 (figur 1). Detta minskar excitation volym hjälper till att minimera photodamage när imaging levande celler18,19. Forskare är därför kunna generera exakt lesioner i cellmembranet och övervaka membran återförslutning i realtid med hjälp av fluorescerande färgämnen och observerar förändringar i fluorescensintensiteten som cellmembranet spricker och sedan återförslutningar.
Detta tillvägagångssätt har använts flera gånger att studera membran såra in vitro och i vivo och i flera cell typer20,21. Till exempel membran reparera defekter i fibroblaster och myotubes som härrör från dysferlinopathy patienter bedömdes med hjälp av denna teknik22,23. Också, enda muskelfibrer som isolerats från möss användes att övervaka reparation patch bildandet13,24,25. Rörelsen av fluorescently märkta proteiner kan också observeras under membranet reparation i enda muskelfibrer9. Processen för sarcolemmal reparation efter två-photon laser såra hos zebrafiskar embryon kan dessutom observeras i realtid i vivo26.
I den här artikeln beskriver vi en metod för att bedöma cellmembranet reparation dynamik i fibroblaster använder två-photon laser såra, även om denna metod kan tillämpas på olika celltyper i syfte att kvantifiera plasmamembranet återförslutning förmåga in vitro. I denna metod, cellerna inkuberas med FM4-64, ett lipofilt, cell-impermeable färgämne som snabbt fluorescerar i eftersom det binder till negativt laddade fosfolipider i cytoplasman vid inträdet i cellen genom membran lesionen (figur 2& 3). kvantifiering av färgämne fluorescens intill membran lesionen tillåter övervakning den tid det tar för cellmembranet återförsluta själv. För att exemplifiera nyttan av denna metod, använder vi dysferlinopathy patienternas fibroblaster transfekterade med GFP-konjugerad fullängds dysferlin (DYSF) plasmider för att bedöma räddningsaktionen av cellmembranet reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga fibroblast-celler som används i denna studie användes med godkännande från den mänskliga etiska kommittén av fakulteten och tandvård vid University of Alberta.
1. transfection av celler med fullängds DYSF plasmid
- Kultur fibroblast celler i en T225 kolv som innehåller 40 mL tillväxt medier - 36 mL Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM), 4 mL fetalt bovint serum (FBS) och 20 µL av penicillin/streptomycin (P/S) - i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
Obs: Celler bör vara odlade till cirka 70-80% konfluens och bör inte tillåtas att bli helt konfluenta. - För att förbereda celler för sådd, skölj cellerna med 40 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger, tillsätt sedan 5 mL 0,05% trypsin att lossa cellerna. Returnera cellerna till 37 ° C CO2 inkubator och inkubera cellerna för 5 min.
- När cellerna är helt fristående, tillsätt 40 mL tillväxt medier att stoppa trypsin reaktionen.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en annan cell räknar enheten.
- Utsäde 2 mL av celler vid 1 x 105 celler/mL i 35 mm kollagen-belagd glasbotten rätter. Inkubera cellerna över natten i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
Obs: Celler bör vara ca 50-60% konfluenta nästa dag. - Ta bort tillväxt medier och ersätta det med 2 mL serum-berövade media (tillväxt medier utan FBS).
- Transfect cellerna med fullängds dysferlin plasmid med lipotransfection.
- Förbereda 150 µL serum-berövade media i en 1,5 mL tub (en tub för varje maträtt att vara transfekterade).
- Tillsätt 3 µL transfection reagens i varje 1,5 mL tub som innehåller serum-berövade media. Inkubera det minst 5 minuter i rumstemperatur.
- I en separat 1,5 mL tub, lägga till 175 µL serum-berövade media och 3,5 µg av plasmid DNA.
Obs: Multiplicera ovanstående belopp för varje ytterligare maträtt att vara transfekterade. - Kombinera 150 µL av media som innehåller plasmid DNA i ett rör med 150 µL serum-berövade media och transfection reagens. Inkubera det i 20 min i rumstemperatur.
- Jämnt fördela 300 µL av media med plasmid och transfection reagens över skålen. Inkubera rätter för 24 h i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Byt ut materialet med färska tillväxt medier som innehåller serum och inkubera det för en ytterligare 24 h i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
2. förberedelse av celler för två-photon skadade assay
- Ta bort media genom pipettering och skölj cellerna en gång med 1 mL Tyrodes lösning och tillsätt 1 mL av färska Tyrodes lösning innehållande 1 µL av 2,5 mM FM 4-64 färgämne.
Obs: FM 4-64 dye slutliga koncentration är 2,5 µM. - Om bedömning av membran reparation i en kalcium-utarmat miljö önskas, skölj celler med 1 mL PBS och tillsätt därefter 1 mL PBS med 1 mM EGTA.
Obs: Eftersom PBS kommer att orsaka cellerna att lossa över tid, skadade analysen bör slutföras så snabbt som möjligt.
3. två-photon laser skadade assay
- Använda en inverterad confocal mikroskopet och associerade programmet, skapa ett 0,2 µm x 2 µm mål och placera den på kanten av cellmembranet så att uppsätta som mål fodrar överlappar och ligger vinkelrätt mot ledning av cellmembranet (figur 2).
- Använda en 543-nm HeNe laser att excitera FM-dye signalen och ange detektionsområdet för 600-760 nm. Använda en 488-nm Argon laser att excitera GFP signal (figur 4) och ange detektionsområdet för 500-550 nm.
- Skapa en 5 min tidsserie sekventiella bild skanningar, imaging celler varje 5 s.
- Generera en membran-lesion, blekmedel celler med hjälp av en två-photon laser inställd på 820-nm, med 15% laser power med 10 iterationer och blekmedel celler 25 s efter början av tidsserierna.
- För att kvantifiera FM 4-64 dye fluorescens, använda programvaran för att rita en 6 µm 6 µm region av intresse (ROI) och placera den i anslutning till den skadade platsen och i cellen (figur 3).
Obs: Undvik provtagning områden av pixel oversaturation med hjälp av ”utbud indikator”-funktionen i programvaran - i denna ansökan, röda pixlar representerar överöstes pixlar. Exportera raw fluorescens värden till ett elektroniskt kalkylblad för statistisk analys. - Beräkna relativa fluorescens värden för varje tidpunkt genom att subtrahera bakgrunden värdet (medelvärde fluorescens värdet av tidpunkter före membran såra) och dividera nettoökningen av fluorescensen värdet vid t = 0 (figur 5, 6) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Friska mänskliga fibroblaster, icke behandlat dysferlinopathy patienternas fibroblaster och patienternas fibroblaster transfekterade med en plasmid som innehåller sekvensen fullängds dysferlin utsattes för två-photon laser sårande för att bedöma membran återförslutning förmåga i realtid. Friska mänskliga fibroblast celler visas låga nivåer av FM 4-64 fluorescens aktiveringen efter laser såra och icke behandlat patienten fibroblaster uppvisade en hög grad av relativa fluorescensintensiteten efter skada (figur 5& 6 ). Patientens celler som var transfekterade med fullängds dysferlin plasmid visade minskad relativ FM 4-64 fluorescensintensiteten jämfört med icke-behandlade patienten kontroller och var jämförbara med fluorescens-värden som observerats i kontrollen friska (figur 5& 6).
Figur 1 . En-photon kontra 2-foton mikroskopi. I ett system med traditionella en-photon Mikroskop används en enda hög energi foton (UV eller synliga spektrat) för att excitera en fluorophore (A). I en två-photon-systemet används två lägre energi fotoner (nära infrarött) att excitera en fluorophore (B). Skildras inom cylindrarna är fluorescens signalen genereras i hela fokalplanet, visar hur två-photon Lasersystemet kan fokusera excitation ljus att inom en viss region (B) och utesluta ljus från out-of-fokus plan (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Att placera ett mål vid cellmembranet. Använda programvaran, ett 0,2 µm x 2 µm mål dras och placeras överlappande och vinkelrätt mot cellmembranet. Pilen anger målet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Fluorescens signal från FM färgämne som det infiltrerar cellen genom membran bristning. Som de cellmembranet bristningar, lipofila FM 4-64 dye infiltrerar cellen och fluorescerar i eftersom det binder negativt laddade fosfolipider i cytoplasman. Använda programvaran, en region av intresse (ROI) kan vara dragna (vit ruta) och fluorescens värden inom rutan kan användas för att beräkna relativa fluorescens förändringar inom cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Fluorescens signal från GFP-konjugerad fullängds DYSF plasmid. Efter plasmid transfection uttrycker patientens fibroblast celler fullängds DYSF protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Kvantifiering av fluorescens med tiden. Fluorescens-värden som beräknas av datorprogramvara från inom ROI kan användas för att bestämma relativa fluorescens förändringar över tiden för varje behandlingsgrupp. Pilen anger tiden för laser ablation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Förändring av relativ fluorescens med tiden. Relativa fluorescens (RF) värden för varje tidpunkt beräknas genom att subtrahera bakgrunden fluorescens värdet (beräknad som medelvärdet av fluorescens värdena från tidpunkter före membran såra) från given fluorescens värdena (Signal Intensitet - bakgrund = ΔF) och dividera nätet öka (ΔF) genom fluorescens värdet vid t = 0 (F0). Därför RF = ΔF/F0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två-foton laser såra cellmembranet är en exakt och mångsidig teknik för att bedöma dynamiken i membran återförslutning in vitro. I den här artikeln beskrev vi ett protokoll för fastställande av cellmembranet återförslutning förmåga i dysferlinopathy patientens celler med två-photon lasern skadade assay. Våra resultat visar att dysferlinopathy patientens celler är defekta i cellmembranet återförslutning, vilket är förenligt med resultaten av andra forskare och som ytterligare belyser slående likheter i cellmembranet återförslutning dynamiken mellan muskel och icke-muskel cell typer3,11,15,22. Vi noterade också att patientens celler transfekterade med en plasmid som innehåller sekvensen fullängds dysferlin räddades från deras defekta membran återförslutning fenotyp, visar att fullängds dysferlin Plasmiden kan rädda fenotyp i icke-muskel celltyper samt liksom muskel27.
Tillsammans, förstärka våra resultat genomförbarheten och tillförlitlighet i två-photon membran skadade analysen som en guld-standard för att mäta cell membran återförslutning förmåga in vitro. Kostnad och tillgänglighet som är associerad med två-foton mikroskopi kan dock en potential som begränsande faktor för vissa forskargrupper att använda två-photon membranet såra assay. Dessutom använder våra setup tredjeparts en inverterad confocal Mikroskop, vilken är väl lämpad att in vitro arbete men kan vara mindre lämpligt för i vivo imaging.
Det är viktigt att notera att de två-photon laser anpassningen precision är avgörande för framgång av tekniken. Vår erfarenhet var felsökning av laser anpassning det vanligaste problemet som uppstått. Andra problem som kan påverka förmågan att Poäng lyckade hits under laser såra inkluderar en utjämning av glasbotten skålen på scenen, liksom orientering på cellerna i lösning.
Analysen gäller för nuvarande och framtida studier som undersöker sjukdomstillstånd där cellmembranet integritet eller återförslutning är oroade, och effekten av terapier som genterapi och antisense oligonukleotid-baserad terapi, vilket skulle gynna från att ha utforskas ett effektivt test för kännetecknar membran dynamics så att nya terapeutiska alternativ kan28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av University of Alberta fakulteten och tandvård, The vänner av Garrett Cumming stol forskningsfond, HM Toupin neurologiska vetenskapen stol forskningsfond, muskeldystrofi Kanada, Kanada Stiftelsen för Innovation (CFI), Alberta avancerad utbildning och teknik (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - Stiftelsen för genen och cellterapi, kvinnor och barns hälsa Research Institute (WCHRI), och Alberta utvecklar Health Solutions (AIHS ).
Vi vill tacka Dr Steven Laval för att förse oss med fullängds dysferlin Plasmiden. Vi vill också tacka Dr Katsuya Miyake för teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
