Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

مقايسة إصلاح غشاء الخلية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون

doi: 10.3791/56999 Published: January 2, 2018

Summary

جرح غشاء الخلية عن طريق الليزر اثنين-فوتون هو أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية إعادة ختم الغشاء ويمكن تطبيقها على أنواع متعددة من الخلايا. هنا، يمكننا وصف بروتوكول في المختبر العيش-التصوير لإعادة ختم غشاء في خلايا المريض ديسفيرلينوباثي بعد التذرية الليزر اثنين-فوتون.

Abstract

الشتائم الفيزيولوجية المرضية العديدة يمكن أن تسبب ضررا لأغشية الخلية، وعندما يقترن مع العيوب المتأصلة في تصليح غشاء الخلية أو النزاهة، يمكن أن يسفر عن المرض. فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء المحيطة بتصليح غشاء الخلية، ولذلك، هدفا مهما لوضع استراتيجيات علاجية رواية للأمراض المرتبطة بديناميات غشاء الخلية المفككة. تستخدم العديد من الدراسات في المختبر و في فيفو تهدف إلى فهم إعادة ختم غشاء الخلية في العديد من السياقات المرض التذرية الليزر اثنين-فوتون كمعيار لتحديد النتائج الوظيفية بعد علاجات تجريبية. في هذا التحليل، تتعرض أغشية الخلية للجرح بليزر اثنين-فوتون، الذي يتسبب في غشاء الخلية إلى تمزق وصبغة الفلورسنت لاختراق الخلية. يمكن رصد كثافة الأسفار داخل الخلية ثم لقياس قدرة الخلية على ختم نفسها. هناك عدة طرق بديلة لتقييم استجابة غشاء الخلية للإصابة، فضلا عن التباين الكبير في يومين-فوتون الليزر إصابة النهج نفسه، ولذلك، سيخدم نموذج وحيد وموحد لإصابة خلية مفيد إنقاص الاختلاف بين هذه المنهجيات. في هذه المقالة، نحن مخطط ليزر اثنين-فوتون بسيطة إصابة البروتوكول لتقييم غشاء الخلية إصلاح في المختبر في كلا صحية والمريض تنتجها الخلايا الليفية ديسفيرلينوباثي transfected الخلايا مع أو بدون بلازميد dysferlin كاملة طول.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتكون غشاء الخلية من الخلايا حقيقية النواة المزدوجة-طبقة من فوسفوليبيدات المرصعة البروتين الذي يحدد البيئة داخل/خارج الخلية للخلية وضروري للمحافظة على بقاء التوازن والخلية الخلوية. غشاء الخلية الإصابات الناشئة عن الشتائم الميكانيكية أو الكيميائية شائعة في مختلف أنواع خلايا الثدييات، بما في ذلك الهيكل العظمى وعضلة القلب والمعدة والرئة1،2،،من34خلايا. وبالإضافة إلى الإصابات نتيجة للوظيفة الفسيولوجية اليومية، يمكن أن تتلف أغشية الخلية بالشتائم البيئية والسموم البكتيرية وضخه الدماغية5. فشل إعادة ختم تمزق في غشاء الخلية يؤدي إلى تدفق غير منظم خارج الخلية Ca2 +-إلى جانب عناصر أخرى يمكن أن تكون سامة في خارج الخلية-داخل الخلية، تحريك الشلالات إشارة المتلقين للمعلومات التي يمكن أن تؤدي بسرعة في الخلية وفاة1،4،،من56.

وحتى الآن، وهناك العديد من النماذج المقترحة لإصلاح الغشاء في الخلايا. قد يتم تنشيط آليات إصلاح مختلفة تبعاً لحجم وطبيعة تمزق الأغشية. على سبيل المثال، يقترح أن أغشية الخلية قد تستخدم التدفق الأفقي أو انسداد لإصلاح الأعطال صغير البروتين (< 1 نانومتر). نموذج الانصهار الأفقي وتقترح أن تمزق الأغشية هي أوصت سريعاً من خلال توظيف الجانبية التي تحتوي على ديسفيرلين الغشاء7، بينما البروتين انسداد النموذج يوحي بأن الثقوب الصغيرة هي أوصت من خلال المجموعات البروتين (معظمهم من أننيكسينس) 8-على العكس من ذلك، يؤدي أكبر آفات الأغشية Ca2 +-حويصلة تعتمد، بوساطة dysferlin الانصهار وتكوين التصحيح إصلاح. في نموذج التصحيح إصلاح مشغلات Ca2 + تدفق سريع إلى الخلية تجنيد البروتينات متعددة (ديسفيرلين، أنيكسينس، ميتسوجومين-53، والبروتينات إده) التي تشكل مجمع أو "التصحيح"، جنبا إلى جنب مع مزيج من حويصلات داخل الخلايا أو ليسوسوميس في موقع الغشاء الأضرار4،،من910،،من1112. من المهم أن نلاحظ أن هذه النماذج لا يستبعد بالضرورة، وقد تعمل يدا واحدة لتسهيل إصلاح الغشاء. فشل إعادة ختم الضرر غشاء الخلية بشكل صحيح يرتبط مع دول المرض متعددة، بما في ذلك ضمور العضلات (ديسفيرلينوباثي-عضلي ميوشي وحزام أطرافهم ضمور العضلات النوع الثاني باء وعضلي القاصي مع بداية الظنبوبي الأمامي) 13،14من اعتلال عضلة القلب، و Higashi شيدياك متلازمة (CHS)15.

ونظرا لأن سلامة غشاء الخلية سليم وإعادة ختم يلعب دوراً مهما في الصحة والمرض، وفهم أعمق للآليات الجزيئية الكامنة لتصليح غشاء الخلية سيكون مفيداً في البحث عن استراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، من الضروري أن تمتلك التقنيات التجريبية المناسبة لرصد الحركية وتقييم قدرة تصليح غشاء الخلية. وقد صممت عدة أساليب في المختبر للنمذجة إصلاح الغشاء. تتضمن استراتيجية واحدة الإصابات الميكانيكية، التي يمكن أن يتيسر من خلال إلغاء الخلية مع بليد ماصة/جراحية/أسلاك شائكة أو عن طريق التدحرج الخرز الزجاج خلايا16. بيد أن هذا النوع من الإصابات الميكانيكية يولد أكبر الآفات، ويخلق درجة عالية من التباين في إصابة الخلية، سواء داخل أو بين الثقافات.

هو أسلوب آخر لتوليد الجروح غشاء التذرية الليزر قبل يومين-فوتون مجهرية. على عكس الليزر التقليدية مجهرية [كنفوكل] التي توظف الإثارة فوتون واحد، يستخدم الليزر اثنين-فوتون في وقت واحد اثنين الفوتونات طويلة-الطول الموجي، والطاقة المنخفضة تيسيرا للإثارة من الإلكترونات ذات الطاقة العالية17. نتائج هذه العملية غير الخطية في الإثارة حصرا ضمن المستوى البؤري ولا على طول المسار بأكمله الخفيفة17 (الشكل 1). وهذا تخفيض الإثارة حجم يساعد على تقليل د عند التصوير الخلايا الحية18،19. ولذلك الباحثين قادرين على توليد آفات دقيقة في غشاء الخلية ورصد غشاء إعادة ختم في الوقت الحقيقي باستخدام الأصباغ الفلورية، ومراقبة التغيرات في كثافة الأسفار تمزقات غشاء الخلية ومن ثم ريسيلس.

وقد استخدمت مرارا وتكرارا لدراسة الغشاء مما أدى إلى إصابة في المختبر و في فيفو هذا النهج وفي خلايا متعددة الأنواع20،21. على سبيل المثال، غشاء إصلاح العيوب الموجودة في الخلايا الليفية و myotubes المستمدة من ديسفيرلينوباثي تم تقييم المرضى باستخدام هذا الأسلوب،من2223. أيضا، استخدمت ألياف العضلات واحدة معزولة من الفئران لرصد إصلاح تصحيح تشكيل13،،من2425. ويمكن أيضا ملاحظة الحركة البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة أثناء تصليح غشاء في ألياف العضلات واحد9. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة عملية إصلاح ساركوليمال عقب إصابة اثنين-فوتون الليزر في الأجنة الزرد في الوقت الحقيقي في فيفو26.

في هذه المقالة، نحن مخطط منهجية لتقييم ديناميات تصليح غشاء الخلية في الخلايا الليفية باستخدام الليزر اثنين-فوتون إصابة، على الرغم من أن هذه المنهجية يمكن تطبيقها على مختلف أنواع الخلايا غرض التحديد الكمي لغشاء البلازما إعادة ختم القدرة في المختبر. في هذا الأسلوب، يتم المحتضنة الخلايا مع FM4-64، صبغة محبتين، خلية كتيمة فلوريسسيس بسرعة كما أنه يربط سلبا تهمة فوسفوليبيدات داخل السيتوبلازم عند دخول الخلية عن طريق الآفة الأغشية (الشكل 2& 3)-التحديد الكمي لصبغ fluorescence المتاخمة للآفة غشاء يسمح بمراقبة الوقت الذي يستغرقه لغشاء الخلية لإعادة ختم نفسها. لتجسد مدى فائدة هذا الأسلوب، نستخدم ديسفيرلينوباثي الليفية المريض transfected مع البلازميدات dysferlin كامل طول مترافق التجارة والنقل (ديسف) لتقييم عملية الإنقاذ لإصلاح غشاء الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

واستخدمت خلايا تنتجها الخلايا الليفية البشرية المستخدمة في هذه الدراسة بموافقة من "لجنة الأخلاقيات البشرية" بكلية الطب وطب الأسنان في جامعة ألبرتا.

1-تعداء الخلايا التي تحتوي على كامل طول ديسف بلازميد

  1. الثقافة تنتجها الخلايا الليفية الخلايا في قارورة T225 التي تحتوي على 40 مل وسائط النمو-36 مل دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، 4 مل من المصل البقري الجنين (FBS)، وميليلتر 20 من البنسلين/ستربتوميسين (P/S)-في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون مثقف لما يقرب من 70-80% كونفلوينسي الخلايا ولا ينبغي أن تصبح متكدسة تماما.
  2. لإعداد الخلايا للبذر، شطف الخلايا مع 40 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين، ثم يضاف 5 مل التربسين 0.05% لفصل الخلايا. عودة الخلايا إلى 37 درجة مئوية CO2 حاضنة واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق.
    1. عندما تكون الخلايا المنفصلة تماما، إضافة 40 مل وسائط النمو التوقف عن رد فعل التربسين.
    2. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو خلية أخرى عد الجهاز.
  3. البذور 2 مل خلايا في 1 × 105 خلايا/مل في أطباق أسفل الزجاج المغلفة بالكولاجين 35 ملم. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: ينبغي الخلايا روافد 50-60 في المائة تقريبا في اليوم التالي.
  4. قم بإزالة وسائط النمو واستبدله مع 2 مل من المصل المحرومين الوسائط (وسائط النمو دون FBS).
  5. ترانسفيكت الخلايا مع بلازميد كامل طول ديسفيرلين باستخدام ليبوترانسفيكتيون.
    1. إعداد 150 ميليلتر وسائط المحرومين من المصل في أنبوب 1.5 مل (أنبوب واحد لكل طبق يكون ترانسفيكتيد).
    2. إضافة 3 ميليلتر من تعداء كاشف لكل أنبوبة 1.5 مل تحتوي على وسائط الإعلام المحرومين من المصل. تبني عليه على الأقل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة 175 ميليلتر من المحرومين من المصل وسائل الإعلام وميكروغرام 3.5 من بلازميد الحمض النووي.
      ملاحظة: مضاعفة المبالغ المذكورة أعلاه لكل طبق إضافي يكون ترانسفيكتيد.
    4. الجمع بين 150 ميليلتر من الوسائط التي تحتوي على بلازميد الحمض النووي في أنبوب مع 150 ميليلتر المصل حرمان وسائل الإعلام وكاشف تعداء. تبني عليه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. توزيع 300 ميليلتر لوسائل الإعلام مع كاشف بلازميد وتعداء عبر الطبق بالتساوي. احتضان أطباق ح 24 في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.
  6. استبدال وسائط الإعلام مع نمو جديدة الوسائط التي تحتوي على المصل واحتضان أنها 24 ساعة إضافية في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.

2-إعداد الخلايا للتحليل مما أدى إلى جرح اثنين-فوتون

  1. قم بإزالة الوسائط من بيبيتينج وشطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من محلول في تيرودي، ثم أضف 1 مل من محلول الطازجة تيرودي يحتوي على 1 ميليلتر من 2.5 ملم FM صبغ 4-64.
    ملاحظة: هو تركيز صبغ 4-64 FM النهائي 2.5 ميكرون.
  2. إذا كان المطلوب هو تقييم لإصلاح الغشاء في بيئة استنزاف الكالسيوم، شطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 مم اجتا.
    ملاحظة: كما سيؤدي برنامج تلفزيوني في الخلايا لفصل على مر الزمن، ينبغي استكمال الفحص مما أسفر عن إصابة بأقصى سرعة ممكنة.

3-اثنين-فوتون بالليزر الإنزيم مما أسفر عن إصابة

  1. استخدام المجهر المقلوب [كنفوكل] والبرامج المرتبطة بها، إنشاء هدف ميكرومتر 0.2 ميكرون x 2 ووضعه على حافة غشاء الخلية حيث سطر target التداخل ويكمن عمودي على اتجاه غشاء الخلية (الشكل 2).
  2. استخدام ليزر زناد 543-شمال البحر الأبيض المتوسط لتثير إشارة صبغ FM وتعيين نطاق اكتشاف 600-760 نانومتر. استخدام ليزر أرجون 488 نانومتر لإثارة بروتينات فلورية خضراء إشارة (الشكل 4) وتعيين نطاق اكتشاف 500-550 نانومتر.
    1. إنشاء سلسلة زمنية دقيقة 5 لمسح صورة متتابعة، تصوير الخلايا كل 5 s.
    2. لتوليد آفة الأغشية، الخلايا التبييض باستخدام ليزر اثنين-فوتون تعيين إلى 820-شمال البحر الأبيض المتوسط، 15% باستخدام الليزر السلطة مع تكرارات 10 والتبييض الخلايا 25 ثانية بعد بداية السلسلة الزمنية.
  3. لقياس FM fluorescence صبغ 4-64، استخدام البرنامج لرسم منطقة ميكرومتر µm x 6 6 الفائدة (ROI) ووضعه المتاخمة للموقع مما أدى إلى إصابة وداخل الخلية (الشكل 3).
    ملاحظة: تجنب مناطق أخذ العينات من أوفيرساتوريشن بكسل باستخدام الدالة "نطاق مؤشر" في البرنامج--في هذا التطبيق، وتمثل الحمراء بكسل بكسل oversaturated. تصدير قيم الفلورية الخام إلى جدول بيانات إلكترونية للتحليل الإحصائي.
  4. حساب القيم fluorescence النسبي لكل نقطة الوقت بطرح قيمة الخلفية (قيمة الأسفار يعني تيميبوينتس قبل إصابة الغشاء) وقسمة الزيادة الصافية الأسفار القيمة عند t = 0 (الشكل 5، 6) .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الليفية البشرية صحية والليفية ديسفيرلينوباثي غير معاملة المريض والمريض الليفية transfected مع بلازميد يحتوي على تسلسل كامل طول dysferlin تعرضوا لإصابة الليزر اثنين-فوتون لتقييم إعادة ختم قدرة الغشاء في الوقت الحقيقي. خلايا صحية بشرية تنتجها الخلايا الليفية عرض مستويات منخفضة من التنشيط fluorescence FM 4-64 بعد إصابة الليزر والليفية المريض غير المعالجة أظهرت درجة عالية من الكثافة النسبية الأسفار بعد إصابة (الشكل 5& 6 ). خلايا المريض الذي تم transfected مع بلازميد dysferlin كامل طول أظهرت انخفاض نسبي FM 4-64 fluorescence كثافة مقارنة مع عناصر تحكم المريض غير المعالجة وقابلة للمقارنة مع القيم fluorescence في مراقبة صحية (الشكل 5& 6).

Figure 1
الشكل 1 . فوتون واحد مقابل الفحص المجهري اثنين-فوتون- في نظام التقليدي فوتون واحد مجهر، يستخدم فوتون وحيد لطاقة عالية (الأشعة فوق البنفسجية أو الطيف المرئي) لإثارة فلوروفوري (A). في نظام الثاني-فوتون، تستخدم اثنين الفوتونات المنخفضة بالطاقة (بالقرب من الأشعة تحت الحمراء) لإثارة فلوروفوري (ب). يصور داخل الاسطوانات إشارة الأسفار التي تم إنشاؤها في جميع أنحاء المستوى البؤري، تبين كيف يمكن تركيز نظام ليزر اثنين-فوتون الإثارة الخفيفة إلى داخل منطقة محددة (ب) واستبعاد الخفيفة من الطائرات خارج نطاق التركيز (A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . وضع هدفا في غشاء الخلية. باستخدام البرمجيات، رسمها هدفا ميكرومتر 0.2 ميكرون x 2 ووضع عمودي على غشاء الخلية والمتداخلة. يشير السهم إلى الهدف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . إشارة الأسفار من صبغ FM كما يخترق الخلية عن طريق تمزق الأغشية. تمزقات غشاء الخلية، يخترق الخلية محبتين FM 4-64 صبغ وفلوريسسيس كما أنه يربط فوسفوليبيدات مشحونة سلبا داخل السيتوبلازم. باستخدام البرمجيات، منطقة الاهتمام (ROI) يمكن أن تكون مرسومة (مربع أبيض) ويمكن استخدام قيم الأسفار داخل المربع لحساب التغيرات النسبية الأسفار داخل الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . إشارة الأسفار من بروتينات فلورية خضراء مترافق كامل طول ديسف بلازميد. وعقب بلازميد تعداء، عن خلايا المريض تنتجها الخلايا الليفية كامل طول ديسف البروتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . التحديد الكمي للأسفار مع مرور الوقت- يمكن استخدام قيم fluorescence حسابها بواسطة برامج الحاسوب من خلال العائد على الاستثمار لتحديد الأسفار نسبي يتغير بمرور الزمن لكل مجموعة العلاج. يشير السهم إلى وقت التذرية الليزر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . التغيير في الأسفار النسبي على مر الزمن- يتم حساب القيم fluorescence النسبي (RF) لكل نقطة الوقت بطرح قيمة الأسفار الخلفية (محسوبة كمتوسط القيم الأسفار من تيميبوينتس قبل إصابة الغشاء) من القيم fluorescence معين (إشارة كثافة-الخلفية = ΔF) وقسمة الصافي زيادة (ΔF) بقيمة الأسفار عند t = 0 (F0). ولذلك، الترددات اللاسلكية = ΔF/F0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مما أسفر عن إصابة اثنين-فوتون الليزر من غشاء الخلية تقنية دقيقة وتنوعاً لتقييم ديناميات غشاء إعادة ختم في المختبر. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول لتحديد الخلية غشاء إعادة ختم القدرة في خلايا المريض ديسفيرلينوباثي باستخدام الليزر اثنين-فوتون إصابة المقايسة. النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن خلايا المريض ديسفيرلينوباثي معيبة في إعادة ختم غشاء الخلية، وهو ما يتسق مع النتائج التي توصل إليها باحثون آخرون، وكذلك تبرز أوجه التشابه الصارخ في غشاء الخلية إعادة ختم ديناميات بين العضلات و أنواع الخلايا غير العضلات3،،من1115،22. لاحظنا أيضا أنه قد تم إنقاذ خلايا المريض transfected مع بلازميد يحتوي على تسلسل كامل طول ديسفيرلين من الغشاء معيبة إعادة ختم النمط الظاهري، مما يدل على أن بلازميد dysferlin كامل طول يمكن إنقاذ النمط الظاهري في غير العضلات أنواع الخلايا، وكذلك كما هو الحال في العضلات27.

معا، نتائجنا تعزز جدوى وموثوقية الفحص مما أسفر عن إصابة اثنين-فوتون غشاء كمعيار ذهب في قياس الخلية غشاء إعادة ختم القدرة في المختبر. بيد أن تكلفة وتوافر المرتبطة بالفحص المجهري اثنين-فوتون يمكن احتمال الحد من عامل لبعض المجموعات البحثية التي تسعى إلى الاستفادة من الغشاء اثنين-فوتون إصابة المقايسة. وعلاوة على ذلك، يستخدم الإعداد لدينا مجهر مقلوب [كنفوكل]، التي هي مناسبة تماما للعمل في المختبر ولكنها قد تكون أقل ملاءمة للتصوير في فيفو .

من المهم ملاحظة أن دقة المحاذاة الليزر اثنين-فوتون أمر حاسم لنجاح هذه التقنية. في تجربتنا، استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمحاذاة الليزر مسألة الأكثر شيوعاً مصادفة. وتشمل القضايا الأخرى التي يمكن أن تؤثر على القدرة على نقاط يضرب ناجح خلال إصابة الليزر تسوية الطبق أسفل الزجاج في المرحلة، فضلا عن اتجاه الخلايا في حل.

التحليل ينطبق على الدراسات الحالية والمستقبلية التحقيق في الحالات المرضية التي سلامة غشاء الخلية أو إعادة ختم تشعر بالقلق، ومدى فعالية العلاجات، مثل العلاج الجيني والعلاج على أساس اليغنوكليوتيد العقاقير، مما سيعود بالنفع من بعد بحث تحليل فعال لوصف ديناميات الغشاء حتى يمكن أن تكون الخيارات العلاجية رواية28،29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها جامعة ألبرتا كلية الطب وطب الأسنان و "أصدقاء من غاريت كومينغ رئيس صندوق أبحاث"، رئيس صندوق أبحاث العلوم العصبية توبين جلالة، "ضمور العضلات كندا" و "المؤسسة الكندية" للابتكار (CFI)، ألبرتا متقدمة والتعليم والتكنولوجيا (بعد التمديد)، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، رحلة جيسي--الأساس للجينات والعلاج بالخلايا، والنساء والأطفال في معهد بحوث الصحة (وتشري)، والبرتا يبتكر الحلول الصحية (عيس ).

ونود أن نشكر الدكتور ستيفن لافال لإمداد لنا مع بلازميد dysferlin كاملة الطول. ونود أيضا أن نشكر الدكتور كاتسويا مياكي للمشورة التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes MatTek P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
FM 4-64 Dye Invitrogen T13320
Tyrode’s Salts Solution Sigma-Aldrich T2397
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss NA
Chameleon Two-photon laser Coherent NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312, (3), L371-L391 (2017).
  2. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
  3. McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96, (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
  4. McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (6), 499-505 (2005).
  5. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95, (4), 1205-1240 (2015).
  6. Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261, (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
  7. McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28, (8), 3660-3670 (2014).
  8. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, (Unit 4), 11-24 (2013).
  9. Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213, (6), 705-718 (2016).
  10. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140, (5), 1097-1109 (1992).
  11. Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137, (1), 93-104 (1997).
  12. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, (2), 157-169 (2001).
  13. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, (6936), 168-172 (2003).
  14. Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117, (7), 1805-1813 (2007).
  15. Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (48), 16795-16800 (2004).
  16. Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
  17. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  18. Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3, (3), 231-237 (2000).
  19. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, (5), 1808-1817 (2003).
  20. McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4592-4597 (2003).
  21. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
  22. Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
  23. Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
  24. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, (1), 56-64 (2009).
  25. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (16), 6004-6009 (2014).
  26. Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22, (3), 515-529 (2012).
  27. Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287, (33), 27629-27636 (2012).
  28. Lee, J., Yokota, T. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Springer Japan. 87-102 (2016).
  29. Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17, (9-10), 875-882 (2011).
مقايسة إصلاح غشاء الخلية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).More

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter