Summary
Membrana cellulare ferendo tramite due fotoni laser è un metodo ampiamente usato per la valutazione della membrana risigillazione capacità e può essere applicato a più tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo in vitro live-imaging per membrana menzionerà in disferlinopatia paziente cellule dopo ablazione laser del due-fotone.
Abstract
Numerosi insulti patofisiologici possono danneggiare le membrane cellulari e, quando accoppiato con difetti innati nella riparazione della membrana cellulare o integrità, possono provocare la malattia. Comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti che circonda la riparazione della membrana delle cellule è, pertanto, un obiettivo importante per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per malattie connesse con dinamiche disfunzionali della membrana cellulare. Molti studi in vitro ed in vivo , finalizzati alla comprensione di chiusura in vari contesti di malattia della membrana cellulare utilizzano l'ablazione laser del due-fotone come standard per la determinazione dei risultati funzionali dopo trattamenti sperimentali. In questa analisi, le membrane cellulari sono sottoposte a ferimento con un laser del due-fotone, che provoca la membrana cellulare per rottura e tintura fluorescente per infiltrarsi nella cella. L'intensità di fluorescenza all'interno della cellula può essere monitorata quindi per quantificare la capacità della cellula di risigillare stessa. Ci sono diversi metodi alternativi per la valutazione della risposta della membrana cellulare a lesioni, come pure la grande variazione nel due-fotone laser ferendo approccio stesso, pertanto, un modello unificato di cella ferendo beneficamente servirebbe a diminuire il variazione tra queste metodologie. In questo articolo, descriviamo un semplice due fotoni laser ferendo il protocollo per la valutazione della membrana cellulare riparazione in vitro in entrambi sani e disferlinopatia paziente del fibroblasto cellule trasfettate con o senza un plasmide dysferlin full-length.
Introduction
La membrana cellulare delle cellule eucariotiche è costituito da un doppio strato di fosfolipidi tempestato di proteina che definisce l'ambiente intra/extracellulari della cella ed è essenziale per il mantenimento della sopravvivenza delle cellule e l'omeostasi cellulare. Membrana cellulare lesioni derivanti da insulti meccanici o chimici sono comuni in vari tipi di cellule di mammiferi, tra cui scheletrico e muscolo cardiaco, stomaco e polmone cellule1,2,3,4. Oltre alle lesioni conseguenti alla funzione fisiologica quotidiana, le membrane cellulari può essere danneggiate anche da insulti ambientali, tossine batteriche e riperfusione ischemica5. Errore per sigillare le rotture nella membrana cellulare comporta un afflusso non regolamentato di extracellulare Ca2 +- insieme ad altri componenti extracellulari potenzialmente tossici - nella cellula, innescando cascate di segnale a valle che possono rapidamente portare in cella 5,1,4,di morte6.
Fin qui, ci sono stati diversi modelli proposti per la riparazione di membrana in cellule. Meccanismi di riparazione diversi possono essere attivati a seconda della dimensione e natura della rottura della membrana. Ad esempio, è suggerito che le membrane cellulari può utilizzare flusso laterale o proteina intasamento per riparare piccoli guasti (< 1 nm). Il modello di fusione laterale propone che rotture della membrana sono rapidamente riparate attraverso reclutamento laterale di dysferlin-contenente membrana7, mentre la proteina intasamento modello suggerisce che piccole perforazioni sono riparate attraverso aggregazioni di proteina (principalmente annexins) 8. al contrario, le più grandi lesioni della membrana innescano Ca2 +-fusione della vescicola dipendente, dysferlin-mediata e la formazione di una patch di riparazione. Nel modello di patch di riparazione, un rapido afflusso Ca2 + nella cella attiva il reclutamento di proteine multiple (disferlina, annexins, mitsugumin-53 e proteine EDH) che formano un complesso o "patch", insieme a una fusione delle vescicole intracellulari o i lisosomi presso il sito della membrana danneggiano4,9,10,11,12. È importante notare che questi modelli non sono necessariamente mutuamente esclusivi e possono lavorare di concerto per facilitare la riparazione della membrana. Fallimento per sigillare correttamente danno della membrana delle cellule è associato a più Stati di malattia, compreso la distrofia muscolare (disferlinopatia - tra cui Miyoshi myopathy e distrofia muscolare dei cingoli, tipo IIB e miopatia distale con esordio tibia anteriore) 13, cardiomiopatia14e Chediak-Higashi sindrome (CHS)15.
Data tale integrità della membrana cellulare corretta e risigillazione gioca un ruolo importante nella salute e nella malattia, una più profonda comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti di riparazione della membrana cellulare sarebbe utile nella ricerca di nuove strategie terapeutiche. È, pertanto, necessario possedere adeguate tecniche sperimentali per la cinetica di monitorare e valutare la capacità di riparazione della membrana cellulare. Sono stati progettati diversi metodi in vitro per la modellazione di riparazione della membrana. Una strategia comporta danno meccanico, che può essere facilitata da cella raschiando con un pipetta/chirurgica/rasoio della lama o dal ribaltamento le cellule16perle di vetro. Tuttavia, questo tipo di danno meccanico genera più grandi lesioni e crea un alto grado di variazione nella lesione delle cellule, sia all'interno che tra le culture.
Un altro metodo per generare le ferite della membrana è l'ablazione laser da microscopia del due-fotone. In contrasto con la microscopia confocale laser tradizionale che si avvale di eccitazione di singolo fotone, il laser del due-fotone utilizza contemporaneamente due fotoni di lunghezza d'onda, basso consumo energetico per facilitare l'eccitazione di un elettrone ad alta energia17. Questo processo non lineare provoca eccitazione esclusivamente all'interno del piano focale e non lungo l' intero percorso della luce17 (Figura 1). Questo ridotto volume di eccitazione consente di minimizzare photodamage quando imaging cellule vive18,19. I ricercatori sono quindi in grado di generare lesioni precise nella membrana cellulare e monitor membrana una chiusura in tempo reale utilizzando coloranti fluorescenti e osservare i cambiamenti dell'intensità di fluorescenza come le rotture della membrana cellulare e quindi reseals.
Questo approccio è stato utilizzato ripetutamente per studiare membrana ferendo in vitro e in vivo e in cella più tipi di20,21. Ad esempio, membrana riparare difetti nei fibroblasti e miotubi derivato da disferlinopatia pazienti sono stati valutati usando questa tecnica22,23. Inoltre, singole fibre muscolari isolate da topi sono state utilizzate per monitorare la riparazione patch formazione13,24,25. Il movimento delle proteine fluorescente contrassegnati può essere osservato anche durante la riparazione della membrana in singole fibre muscolari9. Inoltre, il processo di riparazione sarcolemma seguendo due fotoni laser ferendo negli embrioni di zebrafish può essere osservato in tempo reale in vivo26.
In questo articolo, descriviamo una metodologia per la valutazione dinamica di riparazione della membrana cellulare in fibroblasti utilizzando due fotoni laser ferendo, anche se questa metodologia può essere applicata a vari tipi di cellule allo scopo di quantificare la membrana plasmatica chiusura della capacità in vitro. In questo metodo, le cellule vengono incubate con FM4-64, un colorante lipofilico, cella-impermeabile che reagisce rapidamente in quanto si lega al negativamente caricata fosfolipidi all'interno del citoplasma al momento di entrare nella cellula attraverso la lesione della membrana (Figura 2& 3). quantificazione della fluorescenza di tintura adiacente alla lesione della membrana permette di monitorare il tempo che occorre per la membrana cellulare sigillare stessa. Per esemplificare l'utilità di questo metodo, usiamo disferlinopatia transfettati con i plasmidi GFP-coniugato full-length dysferlin (DYSF) nei fibroblasti del paziente per valutare il salvataggio di riparazione della membrana cellulare.
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Protocol
Cellule umane del fibroblasto utilizzate in questo studio sono state utilizzate con l'approvazione del Comitato di etica umana della facoltà di medicina e odontoiatria presso l'Università di Alberta.
1. transfezione delle celle con Full-Length del plasmide DYSF
- Cellule di cultura del fibroblasto in un pallone di T225 contenente 40 mL di coltura - per volta Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco 36 mL, 4 mL di siero bovino fetale (FBS) e 20 µ l di penicillina/streptomicina (P/S) - in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
Nota: Le cellule dovrebbero essere coltivate a confluency di circa 70-80% e non dovrebbero essere consentite di diventare completamente confluenti. - Per preparare le celle per il seeding, sciacquare le cellule con 40 mL di tampone fosfato salino (PBS) due volte, quindi aggiungere 5 mL di tripsina 0.05% per staccare le cellule. Restituire le cellule a 37 ° C CO2 incubator e incubare le cellule per 5 min.
- Quando le cellule sono completamente distaccate, aggiungere 40 mL di terreno di crescita per arrestare la reazione di tripsina.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro o un'altra cella dispositivo di conteggio.
- Semi di 2 mL di cellule a 1 x 105 cellule/mL in piatti con fondo di vetro rivestite con collagene 35 mm. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
Nota: Le cellule dovrebbero essere circa 50-60% confluenti il giorno successivo. - Rimuovere il supporto di crescita e sostituirlo con 2 mL di siero-sfavorite media (crescita media senza FBS).
- Transfect le cellule con Full-Length dysferlin plasmide utilizzando presenti.
- Preparare 150 µ l di siero-sfavorite media in una provetta da 1,5 mL (un tubo per ogni piatto per essere transfected).
- Aggiungere 3 µ l di reagente di transfezione per ogni provetta da 1,5 mL contenente siero-sfavorite media. Incubare per almeno 5 minuti a temperatura ambiente.
- In un tubo separato da 1,5 mL, aggiungere 175 µ l di siero-sfavorite media e 3,5 µ g di DNA plasmidico.
Nota: Moltiplicare gli importi di cui sopra per ogni piatto aggiuntivo essere transfected. - Unire 150 µ l di supporti contenenti DNA plasmidico in una provetta con 150 µ l di siero-sfavorite media e reagente di transfezione. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Distribuire uniformemente il piatto 300 µ l di media con reagente plasmide e transfezione. Incubare i piatti per 24 h in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
- Sostituire il supporto con mezzi freschi di sviluppo contenente siero e incubare per altre 24 h in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
2. preparazione delle celle per dosaggio ferendo due-fotone
- Rimuovere il supporto di pipettaggio e sciacquare le cellule una volta con 1 mL di soluzione di Tyrode, quindi aggiungere 1 mL di soluzione di Tyrode fresco contenente 1 µ l di 2,5 mM FM 4-64 tintura.
Nota: La concentrazione finale di tintura di FM 4-64 è 2,5 µM. - Se si desidera la valutazione della riparazione della membrana in un ambiente del calcio-vuotati, sciacquare le cellule con 1 mL di PBS e quindi aggiungere 1 mL di PBS contenente 1 mM EGTA.
Nota: Come PBS farà sì che le cellule a staccare nel corso del tempo, il saggio ferentesi deve essere completato più rapidamente possibile.
3. due-fotone laser ferentesi dosaggio
- Utilizzando un microscopio confocale rovesciato e software di programma associato, creare una destinazione di µm 0,2 µm x 2 e posizionarlo al bordo della membrana cellulare in modo che la linea di obiettivo si sovrappone e si trova perpendicolare alla direzione della membrana cellulare (Figura 2).
- Utilizzare un laser HeNe 543 nm per eccitare il segnale FM tintura e impostare l'intervallo di rilevamento per 600-760 nm. Utilizzare un laser di Argon 488 nm per eccitare il segnale di GFP (Figura 4) e impostare l'intervallo di rilevamento per 500-550 nm.
- Creare una serie temporale di 5 min di scansioni di immagini sequenziali, cellule di imaging ogni 5 s.
- Per generare una lesione della membrana, candeggina celle utilizzando un laser del due-fotone impostato su 820 nm, utilizzando 15% laser di potenza con 10 iterazioni e candeggina cellule 25 s dopo l'inizio della serie temporale.
- Per quantificare FM 4-64 di fluorescenza di colorante, è necessario utilizzare il software per disegnare una regione di µm 6 µm x 6 di interesse (ROI) e posizionarlo adiacente al percorso ferimento e all'interno della cellula (Figura 3).
Nota: Evitare le zone di campionamento di sovrasaturazione pixel utilizzando la funzione "Gamma indicatore" nel software - in questa applicazione, pixel rossi rappresentano pixel troppo saturi. Esportare valori di fluorescenza crudo in un foglio di calcolo elettronico per l'analisi statistica. - Calcolare i valori di fluorescenza relativa per ciascun punto di tempo sottraendo il valore di sfondo (valore di fluorescenza media di punti temporali prima del ferimento di membrana) e dividendo l'incremento netto per la fluorescenza valore a t = 0 (Figura 5, 6) .
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Representative Results
Fibroblasti umani sani, nei fibroblasti del paziente non trattato disferlinopatia e nei fibroblasti del paziente transfettati con un plasmide contenente la sequenza di dysferlin full-length sono stati sottoposti a due fotoni laser ferendo per valutare la chiusura della capacità di membrana in tempo reale. Le cellule del fibroblasto umano sano visualizzato bassi livelli di attivazione di fluorescenza FM 4-64 segue laser ferendo e fibroblasti di pazienti non trattati hanno esibito un alto grado di intensità di fluorescenza relativa dopo la lesione (Figura 5& 6 ). Le cellule pazienti che sono state trasfettate con Full-Length dysferlin plasmide ha mostrato ridotta relativa FM 4-64 l'intensità di fluorescenza rispetto ai comandi non trattati pazienti ed erano comparabile con i valori di fluorescenza osservati nel controllo sano (Figura 5& 6).
Figura 1 . Uno-fotone contro microscopia del due-fotone. In un sistema di microscopio tradizionale di un fotone, un fotone singolo ad alta energia (spettro visibile o UV) viene utilizzato per eccitare un fluoroforo (A). In un sistema del due-fotone, due fotoni di bassa energia (vicino infrarosso) sono usate per eccitare un fluoroforo (B). Raffigurato all'interno dei cilindri è il segnale di fluorescenza generato in tutto il piano focale, dimostrando come il sistema del due-fotone laser può concentrare eccitazione leggero da all'interno di una regione specifica (B) ed esclusione luce da out-of-focus piani (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Immissione di una destinazione alla membrana delle cellule. Utilizzando il software, una destinazione di µm 0,2 µm x 2 è disegnata e collocata sovrapposti e perpendicolare alla membrana cellulare. La freccia indica la destinazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Segnale di fluorescenza da tintura di FM come esso si infiltra la cellula attraverso la rottura della membrana. Come le rotture della membrana cellulare, tintura lipofilica FM 4-64 si infiltra la cella e reagisce in quanto si lega i fosfolipidi caricati negativamente all'interno del citoplasma. Utilizzando il software, una regione di interesse (ROI) può essere disegnato (scatola bianca) e valori di fluorescenza all'interno della casella possono essere utilizzati per calcolare le modifiche di fluorescenza relativa all'interno della cellula. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Segnale di fluorescenza da GFP-coniugato Full-Length del plasmide DYSF. A seguito di transfezione di plasmide, paziente del fibroblasto cellule esprimono proteina DYSF full-length. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Quantificazione della fluorescenza nel corso del tempo. Fluorescenza valori calcolati da un software all'interno il ROI possono essere utilizzati per determinare relativa fluorescenza cambia nel tempo per ciascun gruppo di trattamento. La freccia indica il tempo di ablazione laser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Cambiamento nella relativa fluorescenza nel corso del tempo. I valori di fluorescenza relativa (RF) per ciascun punto di tempo sono calcolati sottraendo il valore di fluorescenza di fondo (calcolato come la media dei valori di fluorescenza dai punti temporali prima del ferimento di membrana) dai valori di fluorescenza determinata (segnale Intensità - Background = ΔF) e di dividere la rete aumentare (ΔF) il valore di fluorescenza a t = 0 (F0). Di conseguenza, RF = ΔF/F0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ferendo due fotoni laser della membrana cellulare è una tecnica versatile e precisa per valutare le dinamiche della membrana una chiusura in vitro. In questo articolo, abbiamo descritto un protocollo per la determinazione della membrana cellulare chiusura della capacità in disferlinopatia paziente cellule utilizzando il laser del due-fotone ferendo dosaggio. I nostri risultati indicano che le cellule pazienti disferlinopatia sono difettose in chiusura della membrana cellulare, che è coerente con i risultati di altri ricercatori e che evidenzia ulteriormente le somiglianze nella membrana cellulare risigillazione dinamiche tra muscolo e tipi di non-muscolo cellule3,11,15,22. Abbiamo anche osservato che paziente cellule transfettate con un plasmide contenente la sequenza di dysferlin full-length sono state salvate dalla loro membrana difettosa chiusura della fenotipo, dimostrando che plasmide dysferlin full-length può salvare il fenotipo in non muscolo- tipi di cellule così come nel muscolo27.
Insieme, i nostri risultati rafforzano la fattibilità e l'affidabilità del dosaggio ferendo due-fotone membrana come un gold-standard nella misurazione delle cellule della membrana risigillazione capacità in vitro. Tuttavia, il costo e disponibilità associati con microscopia del due-fotone potrebbe essere un potenziale fattore per alcuni gruppi di ricerca che cercano di utilizzare la membrana del due-fotone ferendo analisi di limitazione. Inoltre, il nostro programma di installazione utilizza un microscopio confocale invertito, che è adatta al lavoro in vitro ma potrebbe essere meno appropriato per l'imaging in vivo .
È importante notare che la precisione dell'allineamento laser del due-fotone è fondamentale per il successo della tecnica. Nella nostra esperienza, la risoluzione dei problemi di allineamento laser era il problema più comune incontrato. Altri problemi che potrebbero influenzare la capacità di segnare successi durante laser ferendo includono il livellamento del piatto con fondo di vetro sul palco, come pure l'orientamento delle cellule in soluzione.
L'analisi è applicabile a studi attuali e futuri Stati di malattia in cui l'integrità della membrana delle cellule o una chiusura viene perturbata e l'efficacia delle terapie, quali la terapia genica e terapia a base di oligonucleotidi antisenso, che beneficerebbero da avere un dosaggio efficace per la caratterizzazione dinamica di membrana affinché nuove opzioni terapeutiche possono essere esplorato28,29.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla University of Alberta facoltà di medicina e odontoiatria, The gli amici di Garrett Cumming ricerca sedia, HM Toupin neurologici scienza ricerca sedia fondo, distrofia muscolare Canada, Canada Fondazione per l'innovazione (CFI), Alberta educazione e tecnologia avanzata (AET), istituti canadesi di Health Research (CIHR), viaggio di Jesse - la Fondazione per Gene e terapia cellulare, donne e Health Research Institute bambini (WCHRI), e Alberta innova soluzioni di salute (AIHS ).
Vorremmo ringraziare il Dr. Steven Laval per la fornitura di noi con il plasmide dysferlin full-length. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Katsuya Miyake per consulenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
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