इस कार्य में उच्च संकल्प की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है सीटू हाय-सी पुस्तकालयों से कसकर मंचन पूर्व gastrulation Drosophila melanogaster भ्रूण.
क्रोमेटिन के तीन आयामी वास्तुकला की जांच जीन विनियमन के तंत्र में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । यहां, हम सीटू हाय में क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा तकनीक प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन Drosophila melanogaster भ्रूण आबादी मंचन पर सी । परिणाम में एक एकल प्रयोग में नाभिक में होने वाली सभी क्रोमेटिन बातचीत की मैपिंग की अनुमति देता है कि एक sequencing पुस्तकालय है. भ्रूण छंटाई मैंयुअल रूप से एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एक ट्रांसजेनिक मक्खी एक परमाणु मार्कर युक्त लाइन का उपयोग किया जाता है । इस तकनीक का प्रयोग, प्रत्येक परमाणु विभाजन चक्र से भ्रूण आबादी, और परिभाषित कोशिका चक्र की स्थिति के साथ, बहुत उच्च शुद्धता के साथ प्राप्त किया जा सकता है । प्रोटोकॉल भी gastrulation से परे पुराने भ्रूण तरह अनुकूलित किया जा सकता है । हल भ्रूण सीटू हाय-सी में के लिए आदानों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. sequencing लाइब्रेरी तैयारी सहित सभी प्रयोगों, पांच दिनों में पूरा किया जा सकता है । प्रोटोकॉल कम इनपुट आवश्यकताओं है और मज़बूती से इनपुट सामग्री के रूप में 20 blastoderm स्टेज भ्रूण का उपयोग कर काम करता है । अंतिम परिणाम अगली पीढ़ी sequencing के लिए एक अनुक्रमण पुस्तकालय है । अनुक्रमण के बाद, डेटा जीनोम में संसाधित किया जा सकता चौड़ा क्रोमेटिन संपर्क नक्शे कि उपलब्ध उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कर topologically डोमेन (बालक) संरचना, क्रोमेटिन छोरों, और क्रोमेटिन संबद्ध के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता Drosophila विकास के दौरान कंपार्टमेंट आई ।
क्रोमेटिन क्षेऽ कैप्चर (3 सी) नाभिक1में क्रोमेटिन की टोपोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक असाधारण उपयोगी विधि के रूप में उभरा है । 3 सी संस्करण उच्च सी एक प्रयोग2में नाभिक में होने वाले सभी क्रोमेटिन बातचीत के संपर्क आवृत्तियों को मापने की अनुमति देता है. Hi-C के अनुप्रयोग ने क्रोमेटिन संगठन के कई मूलभूत सिद्धांतों, जैसे TADs, डिब्बों और छोरों3,4,5की खोज और लक्षण वर्णन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
विकास संक्रमण और कोशिका विभेद के संदर्भ में क्रोमेटिन वास्तुकला का अध्ययन तेजी से इन प्रक्रियाओं के दौरान जीन विनियमन के तंत्र को जानने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं6,7,8, 9. महान ब्याज के मॉडल जीवों में से एक Drosophila melanogaster, जिसका विकास और जीनोम अच्छी तरह से विशेषता है । हालांकि, कुछ अध्ययनों कि Drosophila में क्रोमेटिन वास्तुकला की जांच के बाहर इन विट्रो ऊतक संस्कृति सेटिंग्स10,11आयोजित किया गया है । भ्रूण में 16 – 18 ज पद निषेचन, TADs और स्तनधारियों में इसी तरह की संरचनाओं की याद ताजा डिब्बों10, जो की भूमिका वे Drosophila भ्रूण के दौरान जीन विनियमन में खेल रहे है जो सवाल उठाती की पहचान की गई विकास. विशेष रूप से विकास के प्रारंभिक दौर में, gastrulation से पहले, ऐसे अध्ययन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं । gastrulation से पहले, Drosophila भ्रूण 13 तुल्यकालिक परमाणु प्रभाग है कि 8 के एक अत्यंत तीव्र गति से आगे बढ़ना-12चक्र,13प्रति 60 मिनट से गुजरना । इस के अलावा, दृश्य सुविधाओं की कमी के विभिन्न चरणों भेद करने के लिए यह मुश्किल पर्याप्त मात्रा में कसकर मंचन भ्रूण सामग्री प्राप्त करने के लिए बनाते हैं ।
आदेश में एक प्रोटोकॉल है कि परमाणु चक्र के प्रस्ताव पर जल्दी Drosophila विकास में क्रोमेटिन वास्तुकला का अध्ययन करने की अनुमति देता है विकसित करने के लिए, हम दो मौजूदा तकनीक संयुक्त: सीटू में हाय-सी है, जो उच्च संकल्प की पीढ़ी की अनुमति देता है पूरे जीनोम संपर्क5नक्शे, और भ्रूण मचान एक ट्रांसजेनिक Drosophila लाइन का उपयोग कर एक eGFP-PCNA transgene13,14व्यक्त । यह transgene स्थानीयकरण के दौरान नाभिक को और syncytial blastoderm में बँटवारा के दौरान भर में फैलाता है । इस गुण का प्रयोग, यह संभव है आसानी से अपने परमाणु घनत्व और GFP संकेत के फैलाव से mitotic भ्रूण द्वारा विभिंन चरणों भेद ।
साथ में, इन तकनीकों के रूप में कुछ के रूप में 20 Drosophila भ्रूण से उच्च संकल्प में क्रोमेटिन के तीन आयामी संरचना का अध्ययन कर सकें । इस प्रोटोकॉल कटाई और छंटाई Drosophila भ्रूण के लिए निर्देश भी शामिल है एक परमाणु विभाजन चक्र से भ्रूण की आबादी प्राप्त करते हैं । इसका आगे वर्णन है कि प्राप्त भ्रूण को सीटू हाय-सी में परफॉर्म करने के लिए कैसे इस्तेमाल किया जाता है । अंतिम परिणाम एक न्यूक्लियोटाइड अगली पीढ़ी अनुक्रमण मशीनों पर अनुक्रमण के लिए उपयुक्त पुस्तकालय है । परिणामी अनुक्रमण पढ़ता है तो विस्तृत क्रोमेटिन सहभागिता मैप्स पूरे Drosophila जीनोम को कवर में संसाधित किया जा सकता है ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल जल्दी Drosophila भ्रूण में क्रोमेटिन वास्तुकला के उच्च गुणवत्ता वाले नक्शे पैदा करने में बहुत प्रभावी है । एक पूर्व प्रोटोकॉल३४की तुलना में, यहां वर्णित दृष्टिकोण एक अप-टू-डेट का उपयोग करता है सीटू हाय-C प्रक्रिया5, जल्दी प्रसंस्करण में जिसके परिणामस्वरूप, उच्च संकल्प, और कम एजेंट का उपयोग. सीटू हाई-सी प्रोटोकॉल में शामिल समग्र प्रक्रिया Drosophilaके अलावा चरणों और प्रयोगात्मक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर काम करने की उम्मीद है. चूंकि प्रोटोकॉल एक कम इनपुट की आवश्यकता है, यह भी अलग कोशिका आबादी पर इस्तेमाल किया जा सकता है । Drosophilaमें, जब सीमा के बाहर भ्रूण के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, कुछ मानकों, विशेष रूप से सामग्री के निर्धारण में समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । के बाद से बड़े भ्रूण एक उच्च अभेद्य छल्ली का विकास, formaldehyde और लंबे समय तक निर्धारण की एकाग्रता की स्थापना उचित हो सकता है । परमाणु चक्र के अलावा अंय चरणों में भ्रूण के संग्रह के लिए 14, १.४ कदम में 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण की मशीन समय इस प्रकार के रूप में समायोजित करने की आवश्यकता: परमाणु चक्र 12, ७० मिनट; नाभिकीय चक्र 13, ९० min; ३ – ४ hpf, 3:30 एच.
13 क्लीवेज डिवीजनों (स्टेज 1-4) के दौरान, नाभिक घनत्व मोटे तौर पर प्रत्येक प्रभाग के साथ डबल्स । नाभिक को आसानी से उनकी ब्राइट GFP प्रतिदीप्ति से पहचाना जा सकता है । बँटवारा के दौरान, eGFP-PCNA नाभिक में स्थित नहीं है, और इसके संकेत भ्रूण भर में फैलाया जाता है. इस सुविधा का भ्रूण है कि एक तुल्यकालिक दरार संभव विभाजन के दौर से गुजर रहे है की पहचान करता है । क्रोमेटिन अनुरूप अध्ययन के लिए, इन mitotic भ्रूण आम तौर पर वांछनीय नहीं हैं, क्रोमेटिन के mitotic संगठन के बाद से भारी है चरण संगठन३५से अलग है । यह विशेष रूप से एक तुल्यकालिक mitotic विभाजन के दौर से गुजर भ्रूण का चयन करने के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन संभव है । इस मामले में, केवल फैलाया हुआ, eGFP-PCNA के गैर-परमाणु वितरण के साथ भ्रूण रखा जाना चाहिए, और अन्य सभी भ्रूण को छोड़ दिया जाना चाहिए । परमाणु घनत्व निर्धारित नहीं किया जा सकता है के बाद से, उनके संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोपी में देखा आकृति विज्ञान द्वारा मंच भ्रूण के लिए वैकल्पिक तरीकों कार्यरत होना चाहिए. ध्रुव कोशिकाओं और भ्रूण परिधि में नाभिक की उपस्थिति से संकेत मिलता है कि भ्रूण कम परमाणु चक्र 9 पूरा कर लिया है, जबकि दिखाई cellularization परिधि में परमाणु चक्र 1412इंगित करता है ।
उच्च सी प्रयोगों सफलतापूर्वक प्रतिबंध एंजाइमों की एक विस्तृत चयन5का उपयोग कर किया जा सकता है । वर्तमान approaches आमतौर पर कोई 4-आधार अनुक्रम, जैसे MboI, या कोई 6-आधार पहचान साइट, जैसे कि HindIII पहचान एंजाइमों का उपयोग करें । 6-आधार कटर पर 4-आधार कटर का लाभ यह है कि वे उच्च क्षमता के संकल्प की पेशकश, पर्याप्त अनुक्रमण गहराई दी, और एक अधिक भी कवरेज के जीनोम भर में प्रतिबंध साइटों की । एक और5,23,३६,३७पर एक 4-बेस कटर चुनने में कोई स्पष्ट लाभ नहीं है । दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंजाइमों, MboI और DpnII, दोनों एक ही GATC मांयता साइट पहचान । DpnII CpG मिथाइल के प्रति कम संवेदनशील है, जो Drosophilaमें कोई चिंता का विषय नहीं है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को भी सफलतापूर्वक एक प्रतिबंध एंजाइम के रूप में DpnII का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है । धारा ४.२ में । प्रतिबंध एंजाइम और बफर DpnII संगतता के लिए समायोजित किया जा करने के लिए है, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार.
यदि sequencing लायब्रेरी का अंश आकार काफी संख्या में चित्र 2aदिखाया गया से विचलित, अनुक्रमण के दौरान क्लस्टर गठन कम कुशल या पूरी तरह से विफल हो सकता है । इस मामले में, बाल काटना के बाद आकार वितरण की जांच की जानी चाहिए और कतरनी मानकों तदनुसार समायोजित । बहुत छोटा ( 1, 000 bp) के डीएनए अंशों के वितरण में चोटियों आकार चयन के साथ समस्याओं को इंगित करता है, जैसे मोतियों या supernatant के ऊपर ले जाने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए रहे हैं । अक्सर इन पुस्तकालयों पर छोटे चोटियों के साथ इन अवांछनीय आकार, इस तरह के एक चित्र के रूप में, अभी भी clustering दक्षता में केवल एक छोटी सी कमी के साथ सफलतापूर्वक अनुक्रम ।
पीसीआर दोहराव की उच्च दरों से बचना चाहिए क्योंकि यह काफी प्रयोग करने योग्य अनुक्रम की संख्या को कम कर देता है पढ़ता है । पीसीआर डुप्लीकेट की दर सीधे इनपुट मटेरियल की मात्रा से संबंधित है । अधिक इनपुट का उपयोग इसलिए आमतौर पर पीसीआर दोहराव के साथ समस्याओं को दूर ।
पढ़ने के उंमुखीकरण के कारण फ़िल्टर की उच्च संख्या (चित्रा बी) अपर्याप्त पाचन, जो बहुत कम एंजाइम, बहुत अधिक इनपुट सामग्री, या भ्रूण के अधूरे homogenization का उपयोग करने का परिणाम हो सकता है संकेत मिलता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को मैक्स प्लैंक सोसाइटी ने वित्त पोषित किया । C.B.H. इंटरनेशनल मैक्स प्लैंक रिसर्च स्कूल से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था-आणविक चिकित्सा । हम Shelby Blythe और एरिक Wieschaus धंयवाद के लिए कृपया eGFP-PCNA Drosophila melanogaster लाइन प्रदान करते हैं ।
Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
MboI | New England Biolabs | R0147L | |
DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
M165 FC DFC camera | Leica | ||
Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
NaCl | AppliChem | A2942 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
EDTA 0.5M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
Sodium acetate 3M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |