Este trabalho descreve um protocolo para a geração de alta resolução em situ Hi-C bibliotecas de encenado firmemente pre-gastrulação Drosophila melanogaster embriões.
Investigando a arquitetura tridimensional da cromatina oferece inestimável insight sobre os mecanismos de regulação gênica. Aqui, descrevemos um protocolo para a realização da cromatina conformação captura técnica em situ Hi-C na encenado populações do embrião de Drosophila melanogaster . O resultado é uma biblioteca de sequenciamento que permite o mapeamento de todas as interações de cromatina que ocorrem no núcleo em uma única experiência. Classificação do embrião é feito manualmente, usando um microscópio estéreo fluorescente e uma linha de mosca transgénica contendo um marcador nuclear. Usar esta técnica, as populações de embrião de cada ciclo de divisão nuclear e com o status do ciclo celular definido, pode ser obtido com altíssima pureza. O protocolo também pode ser adaptado para classificar os embriões mais velhos além da gastrulação. Classificada de embriões usados como entradas em situ Hi-C. Todos os experimentos, incluindo sequenciamento preparação da biblioteca, podem ser concluídos em cinco dias. O protocolo tem requisitos de entrada baixos e funciona usando confiantemente 20 embriões de estágio de Drosophila como material de entrada. O resultado final é uma biblioteca de sequenciamento para sequenciamento de próxima geração. Após o sequenciamento, os dados podem ser processados em mapas de interação de todo o genoma da cromatina que podem ser analisados usando uma ampla gama de ferramentas disponíveis para obter informação sobre topologicamente associando a estrutura de domínio (TAD), loops de cromatina e cromatina compartimentos durante o desenvolvimento da drosófila .
Captura de conformação da cromatina (3c) surgiu como um método extremamente útil para o estudo da topologia da cromatina no núcleo1. A variante 3C Hi-C permite medir as frequências de contato de todas as interações de cromatina que ocorrem no núcleo em um único experimento2. Aplicação do Hi-C tem desempenhado um papel importante na descoberta e caracterização de muitos princípios fundamentais de organização da cromatina, como TADs, compartimentos e loops3,4,5.
Estudos de arquitetura de cromatina no contexto das transições do desenvolvimento e diferenciação celular são cada vez mais usados para desvendar os mecanismos de regulação gênica durante estes processos6,7,8, 9. Um dos organismos modelo de grande interesse é a Drosophila melanogaster, cujo desenvolvimento e genoma são bem caracterizadas. No entanto, alguns estudos que investigam a arquitetura da cromatina em Drosophila fora em vitro tecido cultura configurações foram realizadas10,11. Em embriões, fertilização post de 16 – 18 h, Tad e compartimentos reminiscentes de estruturas semelhantes em mamíferos foram identificados10, que levanta a questão de qual o papel que eles estão jogando no Regulamento do gene durante o embrião da drosófila desenvolvimento. Especialmente nas fases iniciais de desenvolvimento, antes da gastrulação, tais estudos são tecnicamente desafiadoras. Antes de gastrulação, embriões da drosófila passam por 13 divisões nucleares síncronas que produziam a um ritmo extremamente rápido de 8 – 60 min por ciclo de12,13. Além disso, a falta de recursos visuais para distinguir as diferentes fases tornam difícil obter material de embrião firmemente encenado em quantidades suficientes.
A fim de desenvolver um protocolo que permite estudar arquitetura da cromatina no desenvolvimento adiantado de Drosophila em resolução do ciclo nuclear, nós combinamos duas técnicas existentes: em situ Hi-C, que permite a geração de alta resolução toda genoma contato mapas5e encenação de embrião usando uma linha de Drosophila transgênica expressando uma eGFP-PCNA transgene13,14. Este transgene localiza-se no núcleo durante a interfase e dispersa por toda a Drosophila sincicial durante a mitose. Usando essa propriedade, é possível facilmente distinguir diferentes fases por sua densidade nuclear e mitóticos embriões pela dispersão do sinal de GFP.
Juntas, estas técnicas permitem estudar a estrutura tridimensional da cromatina em alta resolução de até 20 embriões da drosófila . Este protocolo inclui as instruções para colheita e classificação de embriões da drosófila para obter populações de embriões de um ciclo de divisão nuclear. Mais descreve como os embriões obtidos são usados para executar em situ Hi-C. O resultado final é uma biblioteca de nucleotídeo apropriada para sequenciamento em máquinas de sequenciamento na próxima geração. As leituras de sequenciamento resultante então podem ser processadas em cromatina detalhadas interação mapas cobrindo todo o genoma de Drosophila .
O protocolo aqui apresentado é muito eficaz na geração de mapas de alta qualidade da arquitetura da cromatina em embriões adiantados da drosófila . Comparado a um anterior protocolo34, a abordagem descrita aqui usa um atualizado em situ Hi-C procedimento5, resultando em processamento mais rápido, maior resolução e menos uso de reagente. O procedimento geral, incluindo o protocolo em situ Hi-C é esperado para trabalhar em uma grande variedade de fases e sistemas experimentais, além de Drosophila. Desde que o protocolo tem um requisito de entrada baixo, também poderia ser usado em populações de células isoladas. Em Drosophila, quando usando o protocolo de embriões fora do intervalo descrito aqui, alguns parâmetros, nomeadamente a fixação do material, talvez precise ser ajustado. Desde que os embriões mais velhos desenvolvem uma cutícula altamente impermeável, aumentando a concentração de formaldeído e prolongar a fixação podem ser apropriados. Para coleta de embriões em estágios diferentes do ciclo nuclear 14, os tempos de incubação de embriões a 25 ° C na etapa 1.4 precisam ser ajustado da seguinte maneira: ciclo nuclear 12, 70 min; ciclo nuclear 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 03:30 h.
Durante as divisões de 13 clivagem (fase 1-4), a densidade de núcleos mais ou menos duplas com cada divisão. Os núcleos podem ser facilmente identificados por sua fluorescência de GFP. Durante a mitose, eGFP-PCNA não está localizado no núcleo, e seu sinal é dispersa em todo o embrião. Esta característica torna a identificação de embriões que estão passando por uma divisão de clivagem síncrono possível. Para estudar a conformação da cromatina, estes embriões mitóticas geralmente não são desejáveis, desde que a organização mitótica da cromatina é drasticamente diferente do que a organização de interfase35. É possível adaptar o protocolo para selecionar especificamente embriões submetidos a uma divisão mitótica síncrona. Neste caso, somente embriões com distribuição dispersa, não-nucleares de eGFP-PCNA devem ser mantidos, e todos os outros embriões devem ser descartados. Desde que a densidade nuclear não pode ser determinada, devem ser empregados métodos alternativos para o estágio de embriões por sua morfologia visualizados em microscopia de luz transmitida. Presença de células do polo e núcleos na periferia de embrião indicam que o embrião completou o ciclo nuclear pelo menos 9, Considerando que celularização visível na periferia indica ciclo nuclear 1412.
Oi-C experiências podem ser executadas com êxito usando uma grande variedade de enzimas de restrição5. As abordagens atuais normalmente usam enzimas que reconhecem ou uma sequência de 4-base, tais como MboI, ou um site de reconhecimento 6-base, tais como HindIII. A vantagem de 4-base cortadores sobre cortadores 6-base é que eles oferecem maior resolução potencial, dada a profundidade suficiente sequenciamento e uma cobertura mais uniforme dos sítios de restrição em todo o genoma. Não há nenhuma vantagem clara na hora de escolher um cortador 4-base sobre outro5,23,36,37. As duas enzimas mais comumente usadas, MboI e DpnII, ambos reconhecem o mesmo site de reconhecimento do GATC. DpnII é menos sensível a metilação de CpG, que é de nenhum interesse em Drosophila. O protocolo apresentado aqui pode também ser concluído com êxito usando DpnII como uma enzima de restrição. Na seção 4.2. enzima de restrição e reserva tem que ser ajustado para compatibilidade de DpnII, de acordo com as recomendações do fabricante.
Se o tamanho do fragmento da biblioteca de sequenciamento diverge significativamente o intervalo, mostrado na Figura 2A, formação de cluster durante o sequenciamento pode ser menos eficiente ou falhar completamente. Neste caso, a distribuição de tamanho após a tosquia deve ser verificada e parâmetros de corte ajustada em conformidade. Picos na distribuição de fragmentos de DNA do muito pequeno ( 1.000 bp) tamanhos indica problemas com a seleção de tamanho, tais como transportar ao longo de grânulos ou sobrenadante que deveriam ser descartados. Muitas vezes essas bibliotecas com pequenos picos a esses tamanhos indesejáveis, tais como o retratado, é ainda sequenciados com sucesso com apenas uma menor diminuição na eficiência de clustering.
Altas taxas de duplicação de PCR devem ser evitadas porque isso reduz drasticamente o número de leituras de sequência utilizável. A taxa de PCR duplicatas está diretamente relacionada à quantidade de material de entrada. Usar mais entrada, portanto, geralmente alivia problemas com duplicação de PCR.
Os números mais altos de leituras filtradas devido à orientação de leitura (,Figura 2B) indicam insuficiente digestão, que pode ser o resultado de usar pouca enzima, material muito entrada ou homogeneização incompleta dos embriões.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada pela sociedade Max Planck. C.B.H foi apoiado por uma bolsa de estudos da escola International Max Planck Research – Biomedicina Molecular. Agradecemos Shelby Blythe e Eric Wieschaus gentilmente fornecendo linha eGFP-PCNA Drosophila melanogaster.
Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
MboI | New England Biolabs | R0147L | |
DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
M165 FC DFC camera | Leica | ||
Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
NaCl | AppliChem | A2942 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
EDTA 0.5M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
Sodium acetate 3M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |