Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Standardiserad mätning av näsans membran Transepithelial Potential skillnad (NPD)

doi: 10.3791/57006 Published: September 13, 2018

Summary

Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för att mäta nasal potentialskillnaden (NPD). Cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR) och epitelial natrium kanal (ENaC) funktion utvärderas av förändringen i spänningen över nasal epitelet efter superfusion av lösningar som ändra ion kanal aktivitet, som ger en effektmåttet.

Abstract

Vi beskriver en standardiserad mätning av nasal potentialskillnaden (NPD). Den här tekniken cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR) och funktionen epitelial natrium kanal (ENaC) övervakas av förändringen i spänning över nasal epitelet efter superfusion av lösningar som ändra jonkanal verksamhet. Detta aktiveras genom mätning av potentialskillnaden mellan den subkutana facket och luftvägarna epitelet i näsborren, utnyttja en kateter i kontakt med den sämre nasalen Concha.

Testet tillåter mätning av stabil baslinje spänningen och de successiva netto spänningsändringar efter genomblödning av 100 µM amilorid, en hämmare av Na+ reabsorption i Ringers lösning; en klorid-fri lösning som innehåller amilorid till drive klorid sekretion och 10 µM isoproterenol i en klorid-free lösning med amilorid att stimulera de cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)-beroende klorid konduktans relaterade till CFTR.

Denna teknik har fördelen att demonstrera två viktiga komponenter att upprätta hydratisering av airway surface vätskan av respiratoriskt epitel, ENaC och CFTR elektrofysiologiska egenskaper. Därför, det är en användbar forskningsverktyg för fas 2 och bevis på konceptet prövningar av agenter som rikta CFTR och ENaC verksamhet för behandling av cystisk fibros (CF) lungsjukdom. Det är också en viktig uppföljning förfarande för att fastställa CFTR dysfunktion när genetisk testning och svett testa är tvetydiga. Till skillnad från svettklorid är testet relativt mer tidskrävande och kostsamma. Det krävs också utbildning av operatörer och expertis för att genomföra testet effektivt. Inter - och mellan - individuell variabilitet har rapporterats hos denna teknik speciellt hos unga eller samarbetsovilliga patienter. För att bistå med denna oro, har tolkning förbättrats genom en nyligen validerade algoritm.

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att mäta nasal potentialskillnaden (NPD) som syftar till att undersöka trans-epitelial ion transport i vivo1. Denna teknik tillåter mätning av natrium (Na+) och klorid (Cl) transport. NPD har använts som ett verktyg för forskning sedan slutet av 1980 och godkändes 1998 som en diagnostisk procedur av cystisk fibros Foundation (CFF) samförstånd uttalande2 och 2017 i cystisk fibros Foundation (CFF) samförstånd diagnostiska riktlinjer 3. faktiskt biologiska CFTR dysfunktion, vilket är orsaken till CF, framgår av en ökad Na+ absorption vid det apikala membranet och en defekt i Cl sekretion. Detta funktionella test ger fördelen av en ytterligare diagnos verktyg när genetik är inkonklusiva hos patienter med obestämt mellanliggande svett test resultat3. Även om denna information kan även erhållas av intestinal nuvarande mätning biopsier (ICM), ICM är dock endast tillgänglig i några centra globalt och ytterligare behöver standardisering. NPD är mer tillgänglig i ungefärligt 60 globala centers och dessutom riktar respiratoriskt epitel som är den främsta platsen av sjukdomen.

Med tanke på den information som uppges på CFTR aktivitet, används det också i proof-of-concept studier som syftar till att bedöma funktionella restaurering av CFTR-proteinet i modulatorn terapier4,5,6,7, 8. Ja, data från studier med CFTR mRNA/gen redigering, CFTR förstärkare och corrector terapier, markera betydande ändringar i Cl och Na+ transporter med terapi6,9 och bekräftar att NPD kan vara en lyhörd endpoint i kliniska prövningar. Eftersom vi saknar känsliga kliniska effektmått kunna upptäcka en subtil förändring i patientens kliniska status på kort sikt, kan detta prekliniska biomarkör vara mycket informativ. Fältet av CFTR modulator terapier breddar snabbt och vi behöver omgående tester i vivo som klarar att snabbt tolka aktiva föreningar innan du går till stora fas 3 studier10.

Den fysiologiska grunden för tekniken är baserad på mätning av potentialskillnaden mellan luftvägarna epitelet i näsborren och subkutan facket. Ion kanal aktiviteter utforskas genom att mäta stabil maximal baslinje potentialskillnaden (PD), dess förändringar efter blockerar ENaC relaterade Na+ absorption och körning Cl sekretion via olika apikala Cl transportörer inklusive CFTR. CFTR dysfunktion framgår potentialskillnaden vid stimulering av Cl sekretion via en cAMP beroende av vägen av en minimal förändring och en ökad ENaC medierad Na+ absorption som upptäcks av en mer negativ baslinje potentiella skillnad och en förbättrad respons på amilorid. Den mekanistiska grunden för CF kontra normal PD sammanfattas i figur 1.

Figure 1
Figur 1: sammanfattande figur jonkanal aktivitet. (A) Ion aktivitet i den respiratoriskt epitel visar balanserad aktivitet ENaC och CFTR i normala individer och (B) förlust av CFTR verksamhet vilket resulterar i ökad ENaC medierad natrium transporter och minskad CFTR beroende av klorid transport. ENaC: epitelial natrium kanal, Na+: natrium, CFTR: cystisk fibros transmembrane regulator, CL: natriumklorid, mV: millivolt, PD: potentialskillnaden, min: minut/s vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Detta test visar dock en viss variation både vid upprepade mätningar inom samma patient och bland patienter med samma genotyp. Detta är av yttersta vikt att underlätta tolkningen av ändringarna efter modulator behandling. Dessutom saknar vi fortfarande validerade tröskelvärden diskriminera mellan CF och friska försökspersoner. Detta kan bero delvis på skillnader mellan tillgängligheten av kliniska faciliteter och de tekniker som används. Därför pågår en betydande internationell insats syftar till standardisering av testet. Både oss CFF-TDN (cystisk fibros Foundation-Therapeutics Development Network) och riskkapitalfonderna-CTN (Europeiska cystisk fibros Society-kliniska prövningar Network) skapade en NPD normalförfarande (SOP) för användning i multicenter och forskning prövningar. Denna senaste kollaborativt arbete av CTN och TDN har resulterat i en kombination, internationella SOP, sammanföra expertis av CTN och TDN (2014)11. Detta dokument presenterar de protokoll och testa teknikerna för att anställa NPD för CF diagnos eller utredare-initierade proof-of-concept prövningar. Varje center implementera tekniken ansvarar för tillämpning på dess institutionella mänskliga forskningsetisk kommitté för godkännande.

Figure 2
Figur 2: Schematisk bild av hela rekommenderas NPD setup. Observera att den rekommendera installationen visas, inklusive sekventiell perfusion pumpar och inställningen för 4-stopp-kuk-serien. Specifika anslutningar och exempel på komponenter visas i SOP. (Diagram modifierad med tillstånd från Solomon, G.M. bröstet, 2010-13) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Det allmänna experimentella flödet beskrivs i figur 2, whereby NPD mäts mellan utforska bron placerad på epitel yta och referens bron placeras i subkutan rymden, båda anslutna till elektroder och en hög impedans voltmeter.

Detta säkerställs genom 2 olika system: det finns 2 godtagbar referens elektrod uppställningar: (i) balanserad Ag/Granulatfyllda elektroder och ett elektrokardiogram (EKG) grädde-fylld bro ansluten till subkutan utrymmet med liten nötning eller (ii) mättad kalomel Half-cells och en agar fyllde 22 till 24-gauge nål introducerade subkutant. Kontakten till nässlemhinnan är aktiverad som en dubbel lumen kateter. En lumen är fylld med agar eller ECG grädde och ansluten till mätning elektroden, andra tillåter perfusion på nässlemhinnan av olika lösningar.

Spetsen av utforska slangen placeras på slemhinnan i luftvägarna under den sämre nasala Concha (figur 3).

Figure 3
Figur 3: placering av utforska slangar till respiratoriska slemhinnan. (A) externa vyn visar placering. (B) Rhinoscopic vy visar placering. (C) Diagram som visar det anatomiska läget för placering av katetern. PD: potentialskillnaden

För att studera PD svar på flera läkemedel, tillämpas de superfusion lösningarna via andra lumen av katetern. I området i närheten finns det flera viktiga steg när det gäller förberedandet och genomförandet av NPD mätningar, som beskrivs nedan i protokollet, från inledande förberedelser genom att analysera data.

Efter beredning av lösningar och elektroder möjliggör adekvat kvalitetstester av elektroder och katetrar grundläggande utförandet av testet. Basala mätningar görs längs sämre Concha, som tillåter val av den bästa platsen för mätning, oftast som med mest negativa mätningen. Sedan bestämma sekventiell perfusioner Na+ (ENaC) och Cl (CFTR-beroende) ion flux via en förändring av spänningen över det nasala epitelet.

Protocol

Protokollet med mänskliga försökspersoner godkändes av alla deltagande institut forskningsutskottet. Varje center implementera tekniken ansvarar för tillämpning på dess institutionella mänskliga forskningsetisk kommitté för godkännande.

1. lösningen förberedelse

  1. Bered lösningar #1, #2 och #3, som är bas lösningar, i 1 L partier före förfarandet och lagrade på plats (tabell 1).
    Obs: Amilorid är ljuskänsligt och måste förvaras i mörker (se tabell 1 för lösning sammansättning) (se SOP för detaljerad lösning förberedelse11).
    1. Buffra alla lösningar vid pH 7,4 och filter med 0,22 µm flaska-top filter.
    2. Lösning #3, lägga till fosfat-innehållande salter först, tillåta dem att jonisera för att förhindra kristallisering (se tabell 2 för lösning sammansättning).
      Obs: Sekvensen av blandning är avgörande för lösning #3.
    3. Lagra dessa lösningar vid 4 ° C (stabila i 3 månader) eller vid-20 ° C (stabila i 6 månader).
    4. Bereda lösningar #4 och #5 genom att lägga till ombud på dagen för NPD testet. Isoproterenol är ljus och oxidation känsliga och förlorar sin verksamhet vid rumstemperatur (visar 4% förfall över 4 h vid 4 – 8 ° C). Förvaras vid 4 ° C.
      Obs: ATP är ljus och oxidation känsliga (se tabell 3).
Förening Molekylvikt Koncentration (mM) Sammansättning (g/L)
NaCl 58 148 8,58
CaCl2 2 H2O 147 2,25 0,33
JCM 75 4.05 0,3
K2HPO4 174 2.4 0,42
KH2 PO4 136 0,4 0,05
MgCl2 6 H2O 203 1.2 0,24

Tabell 1: Lösning sammansättning.

Förening Molekylvikt Koncentration (mM) Sammansättning (g/L)
Na glukonat 218 148 33,26
Ca glukonat 430 2,25 0,97
K glukonat 234 4.05 0,95
K2 HPO4 174 2.4 0,42
KH2 PO4 136 0,4 0,05
MgSO4 7 H2O 246 1.2 0,24

Tabell 2: Lösning sammansättning.

Lösning Lösning nummer Innehåll EDC Mark
Ringers injektion Lösning #1/A Buffrad ringers injektionsvätska RINGERS
Ringers + amilorid Lösning nr 2/B Buffrad ringers + 100 μM amilorid AMIL
Noll Cl + amilorid Lösning nr 3/C Buffrad noll Cl + 100 μM amilorid OCL
Noll Cl + amilorid + isoproterenol Lösning nr 4/D Buffrad noll Cl + 100 μM amilorid + 10 μM isoproterenol ISO
Noll Cl+ amilorid + isoproterenol + ATP Lösning nr 5/E Buffrad noll Cl + 100 μM amilorid + 10 μM isoproterenol + 100 μM ATP ATP

Tabell 3: Lösning lista.

2. katetern

  1. Använd en PVC, steril, engångsbruk, 2 lumen (0.7 mm inre Ø) kateter med en runda och släta extremitet (2,5 mm yttre Ø), som är speciellt utformad för NPD.
    1. Knyta kontakter med slemhinnan av en sida hål, 2 mm avlägsen till spets med ett hål på toppen för perfusion (se steg 10.1).
    2. Anslut en av de två Luer-lock-anslutningarna av katetern till mätning elektroden och den andra till perfusion pumpen. Använda kanal färgade i blått som mäter lumen. Tagga katetern vid varje 0,5 cm intervall för 10 cm.
      Obs: Döda utrymmet är 0,3 mL. Det är bättre att använda ovanstående procedur för beredning av katetern om detta inte är möjligt följa nästa två steg.
    3. Skär lika (~ 76 cm) längder PE50 och PE90 kateter slang.
    4. Anbringa dessa tillsammans i en 1 cm bit av kisel gummi slangar. Infoga en 25 G trubbig spets nål snuggly i den motsatta änden av PE-90 slangen. Infoga en 25 G fjäril nål snuggly i den motsatta änden av PE50 slangen att göra säker på att inte punktera slangen som den är placerad.

Figure 4
Figur 4: katetern används för NPD mätningar. Infälld box visar kateterspetsen med mäta hål.

3. beredning av Agar hud Bridge (fjärilsnål) och katetern

Obs: Manipulering av smält agar kan orsaka brännskador, och detta bör ske med försiktighet.

  1. Förbered 3% agar genom att blanda 3 g agar med 100 mL lösning #1 i en bred mun flaska. Smälta ägarn i mikron tills lösliga (transparent).
    1. Fyll 10 mL sprutan med varma agar.
    2. Anslut sprutan därefter till fjäril injektionsnålen (23 G) och markerade lumen av katetern. Injicera agar tills det visas på spetsen.
    3. Låt den svalna i minst 10 min.
    4. Se till att huden bron och katetern är helt fyllda och visualiseras för att vara fri från luftbubblor.
    5. Lagra bulk hud broarna i lösning #1 vid 4 ° C och Använd inte efter 1 vecka.

4. om använda ECG grädde

  1. Späd ECG krämen med lösning #1 (1:1, v/v Ringer). Låt den vila tills den är fri av luftbubblor.
    1. Fyll 10 mL sprutan med utspädda ECG grädde.
    2. Anslut sprutan till markerade lumen av katetern och injicera långsamt ECG krämen tills den visas på nedre sidan hålet.
    3. Kontrollera att katetern är helt fyllda och fri från luftbubblor.

5. System för datainsamling

Obs: De allmänna inställningarna av datainsamlingssystemet visas i figur 5.

Figure 5
Figur 5: uppsättning upp datainsamlingssystemet. Visar anslutningar av bioamplifier och headstage till datorgränssnitt samt elektrod anslutningarna till headstage11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Anslutningar
    1. Anslut datorn till datainsamlingssystemet (Tabell för material) med en USB-kabel.
    2. För att ansluta datainsamlingssystemet till bioamplifier, Anslut BNC kabeln från kanal 1 ingång på datainsamlingssystemet (fram) till utgången på bioamplifier (tillbaka).
    3. Ansluta bioamplifier till headstage med en anpassad kabel pre ansluten till headstage skruvarna till den ingående delen framsidan av bioamplifier.
    4. Ansluta headstage till elektroderna och marken elektroden. Använd standard 2 mm hona-hona kontakter för att ansluta på framsidan av headstage till elektroderna.
      Obs: Porten är infällda och passar endast en riktning av 2 mm kabeln: röd-mätning elektroden till patientens näsa (via nasal kateter); Svart-referenselektrod till patientens hud bron; Vitt till EKG-elektrod jordad till motivets hy.
    5. Ange bioamplifier som beskrivs: Offset: dra för att aktivera, tur att justera, lämna i draget positionen efter justering; Spänning: DC; 1 mV cal: neutralläge; Effekt: Om att samla in data, utanför för att ladda batteriet; Gain: Ställ till 10; Band passera: LoFreq (yttre knopp): DC; Band passera: HighFreq (inre knopp): 1kHz; Volym: Off.

6. Justera huvud-stegs förskjutning

  1. Anslut den bärbara datorn och förstärkaren i sekvensen som anges i SOP11. Slå på datainsamlingssystemet och sedan den bärbara datorn (sekvensen är viktigt för programmet att känna igen den apparat som används för datainsamling).
    1. Justera den huvud-stegs förskjutning enligt SOP sekvensen.

7. förskjutningar

Obs: Det finns flera förskjutningar testas för att säkerställa stabiliteten av elektriska mätsystemet. (se figur 6)

  1. För den elektrod Offset, placera referenselektrod (negativa) och mäta (positiva) elektroden tillsammans i utspädda ECG krämen eller den 3 M KCl. se till att potentialskillnaden läsning mellan elektroderna är nära noll på headstage.
    1. För att ställa in kateter eller hud bridge offset, placera Luer-lock slutet av nasal katetern eller Luer-lock slutet av bron hud in i badet med mätning (positiv) elektroden. Placera den andra änden av katetern i ECG grädde bad eller 3 M KCL som innehåller referens (negativ) elektrod säkerställa att potentialskillnaden är nära noll på headstage.
    2. Ställ in en sluten slinga förskjutning, se till att banan är stängd när du byter nasal katetern i badet av elektroderna. Kontrollera att sluten uppväga läsningar nära 0 mV (= 'offset'; ±2.5 mV). Justera headstage offset vredet för att föra offset 0 mV.
      Obs: Detta bekräftar att alla anslutningar inom kretsen är intakta. Om detta inte är fallet, nasal katetern inte kan vara intakt (luftbubblor i ägarn eller ECG krämen). Ändra bron agar eller driva ECG krämen i setup. Elektroden offset måste utföras först, följt av det slutna systemet (slutna offset) med elektroden och bron (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Inställning av (A) elektrod offset, (B) kateter (eller bridge) förskjutning, (C) slutna offset.

8. spruta Set-up

Obs: Följande är rekommenderade set-up.

  1. Tina lösningar #1, #2 och #3 ca 1 h innan mätningen.
    1. Anslut raden förlängning till Avstängningskranen närmast av katetern.
    2. Växla på alla pumpar och Spola katetern med lösning #1 att helt rensa bort katetern tills Avstängningskranar är tydliga bubblor.

9. placering av referens- och mätning elektroden

Figure 7
Figur 7: Ämne med mäta elektrod och subkutan bron redo för mätningar.

  1. Har studie ämnet ta sittande ställning inför operatorn NPD. För mer komfort, placera fötterna på valfria antistatisk matta och orthoptic hakstödet med huvud.
    1. Anslut marken bly elektroden till ECG pad placeras på motivets arm (figur 7).
    2. Antingen in subkutan nålen i dorsala underarmen (agar system) eller gälla EKG grädde på en tidigare minimalt skadad yta på underarmen referenselektroden (se punkterna 7 till 10 nedan).
    3. Kontrollera anslutningen till subkutan utrymmet genom att mäta den potentiella skillnaden med huden (Finger PD) och be motivet för att stänga ”Mät hålet” genom att nypa katetern mellan spetsen på sin tumme och pekfinger.
    4. Om Finger PD inte -30 mV eller mer negativa, kontrollera införandet av fjäril nålen. Upprepa nötning (för ECG grädde set-up) och kontrollera broar.
    5. Starta sprutpumpen lösning #1 på 80 mL/h. Start med den högra näsborren.
    6. Mäta Finger PD som en stadig negativ spänning (typisk räckvidd -40 till -80 mV).
    7. Om använder EKG grädde System: Späd ECG krämen 1:1 och fylla katetern efter en komplett spola bort ur sonden hålet som tidigare sett för Agar.
    8. Koppla katetern till en 50 mL spruta halva fylld med ECG krämen att bada elektroderna, vilket gör att en kontroll av elektroden offset och bron av set.
    9. Anslut hänvisningen Ag/Cl elektrod till subkutan utrymme genom liten tidigare minimal nötning av huden, huden visas 'rosa och glänsande' när dermis är nått.
    10. Placera mätning elektroden, täckt med ECG grädde, på den skadad hud. Kontrollera finger PD som tidigare visat för Agar-systemet.

10. mätning av Basal PD

  1. Infoga nasal katetern i högra näsborren med en lysande rhinoscope (eller motsvarande) för att visualisera underlägsen Concha. Använda den främre spetsen som ett landmärke, fram katetern inriktning sämre platsen för sämre Concha på slemhinnan i luftvägarna. Om placeringen är svårt, kan alternativt sonden hålet placeras i kontakt med golvet i näsborren.
    Obs: Katetern är tillräckligt styv för att ledas in i näsborren av operatören. För att underlätta placeringen, en kanal av katetern är färgad i blått och innehåller sond-sidan hålet i kontakt med sämre Concha. Detta förhindrar katetern rotation. De märken som anges på katetern från 1 till 10 cm ger lätt referenspunkter.
    1. Mät PD på sämre Concha. För detta ändamål, se till att mäta hålet av katetern är stängd av dess placering mot slemhinnan av sämre Concha (Markera rätt basala på).
    2. Mäta PD på 3.0, 2.0, 1,5, 1,0 och 0,5 cm (avstånd inom den underlägsna meatus från sämre Concha): Markera rätt basala PDs.
    3. Underhålla varje mätning vid det angivna avståndet för ungefär 5 s varje att säkerställa en stadig läsning (± 1 mV) och för att underlätta korrekt tolkning av basala PD-värden.
    4. Upprepa stegen ovan i vänster näsborren, använda funktionstangenten för att markera vänster Basal PDs (3 cm, 2 cm, etc.) och den vänstra Basal på.
    5. Med basala PD åtgärder som en guide, sätt i sonden av nasal katetern till platsen för mest negativ signal (upp till 3 cm från den främre spetsen av den sämre nasalen Concha), och säkert med en liten tejpbit på spetsen av näsan (eller motsvarande).

11. NPD spårning sekventiell perfusioner

  1. För den högra näsborren
    1. Kontrollera att lösningen droppande från patientens näsa. Har ämnet antar en bekväm ställning med huvudet nedåt (ofta hjälpt genom att ha ämnet vila huvudet på sin hand eller Använd en chinrest eller andra immobilisera enhet). Påminna om att minimera rörelsen och Undvik att vidröra näsan eller slangen och att undvika att prata.
    2. Slå lösning #1 (ringsignaler) pump på (5 mL/min eller 300 mL/h). Spela in tills ett stabilt värde erhålls (< 1 mV förändring/30 s).
      Anmärkning: Detta tar ca 3 min att uppnå stabilitet.
    3. Stäng av perfusionen med lösning #1.
    4. Starta perfusionen med lösning #2 (amilorid). Spela in NPD för minst 3 min (om platån spänningen är i tvivel, fortsätta inspelningen för upp till 5 min totala).
    5. Starta perfusionen med lösning #3 (noll klorid). Spela in NPD för minst 3 min (om platån spänningen inte är stabil, fortsätta inspelningen för upp till 5 min totala).
    6. Starta perfusionen med lösning #4 (Isoproterenol). Spela in NPD för minst 3 min [om platån spänningen inte är stabil (en jämn spänning spårning för minst 30 s < 1 mV drift), fortsätta inspelningen för upp till 5 min totala].
    7. Börja perfusionen med lösning #5 (ATP). Spela in NPD för minst 1 min, tills en topp hyperpolarizing svar erhålls.
    8. Slå på perfusionen med lösning #1 (ringsignaler) och tillåter 30 s att spola katetern.
    9. Stäng av lösning #1 perfusionen.
    10. Upprepa proceduren för den vänstra näsborren.

12. slutet av testet

  1. Kontrollera och registrera stabil Finger PD (”Post Finger”) för 5 s.
    1. Ta bort motivets kutan bridge och bandaget från insticksstället på huden. För Granulatfyllda/ECG grädde System, ta bort elektroden från armen.
    2. Spela in ”slutliga stängd slinga Offset” spänningen som beskrivs för att mäta första slutna offset (se steg 7.1.3).
    3. Markera slutliga offset med funktionsknappen.
    4. Stoppa datainsamling (tryck på ”Starta).
      Obs: Nuvarande SOP rekommenderar användning av 100 µM ATP att aktivera purinergic kalcium beroende Cl utsöndringen, att fungera som en positiv kontroll för provet. Detta är dock en frivillig test.

Representative Results

I normala luftvägarna epitel är Na+ absorption primära ion transportverksamheten. Detta resulterar i en negativ airway surface potentialskillnad när det gäller interstitium. Perfusion av ENaC kanal blockerare amilorid leder till en mindre negativ potentialskillnad. Sedan superfusion cl-gratis lösning skapar en kemisk toning för Cl-, vilket skapar en mer negativ potentialskillnad och aktiverar alla Cl transportörerna, inklusive CFTR. Isoproterenol, vilket ökar intracellulära cAMP, ytterligare Cl utsöndringen ökar genom att specifikt aktivera CFTR och ökar den potentiella skillnaden.

Däremot i CF ämnen medierad frånvarande eller dysfunktionella CFTR resulterar i en ökad ENaC Na+ absorption12. Som ett resultat, är baslinjen potentialskillnaden mer negativ. Den depolarisation som observerats med tillämpning av amilorid är större, det finns minimal eller ingen förändring av potentialskillnaden vid stimulering av Cl sekretion via CFTR beroende vägar. Detta kan ses i de representativa tracings i figur 8visar 'friska' vs 'CF' tracings.

Figure 8
Figur 8: representativa tracings 'friska' föremål och föremål med CF. PD: potentialskillnaden, ΔAmiloride: delta amilorid, 0 Cl/Iso: låg klorid: förändringen i PD mellan slutförandet av lösning #2 och lösning #4 perfusion, S1-S4: steg 1-4, grön linje diagrammen A och B ange NPD spårning och svart pilarna anger skillnaden i potentialskillnaden

Discussion

In vivo, NPD ger en unik mätning som kan utföras flera gånger på basis av längsgående och visar att med upprepade mätningar, liknande längsgående resultat observeras på en tredagars och individuell basis14, 15. Det finns starka bevis att NPD har utmärkt diskriminering giltighet för att skilja CF från icke-CF. 25 studier visade genomgående en statistiskt signifikant skillnad i Cl och Na+ konduktans mellan patienter med CF och friska kontroller10. Medan flera tidigare utvecklade index visar denna kapacitet, räknar vi med att nya uppdateringar är nödvändiga med tanke på senaste standardiseringar av metod7,8.

Modifieringar och felsökning

Detta test kräver flera viktiga steg för att säkerställa noggranna mätningar. Detta inkluderar elektroder och katetrar slutna offset för att säkerställa att systemet fungerar rekommenderade normer. Patienter måste vara stilla och avstå från att prata eftersom det minimerar artefakter och katetern se om de rubbas. Detta gör att testet är svårt i icke samarbetsvilliga patienter och tekniken har endast rapporterats i en studie på barn under 6 års ålder7.

Före inspektion av nasal epitel är nödvändigt att säkerställa att det finns inga skorpor eller slem på epitelet, vilket kan påverka mätningarna.

Mycket viktigt, måste det påpekas att platsen för placeringen av katetern är föremål för debatt. SOP presenteras här använder tredjeparts mätning under sämre Concha (IT). Placeringen av katetern under det. har standardiserats och bedrivs i multicenter studier och därför är detta Rekommenderad teknik. Mätning under det. utförs med sida-håls katetern, som kan vara svårt att upprätthålla i fast kontakt med nässlemhinnan, samtidigt som de är i kontakt med lösningarna. Andra grupper kan mäta PD på nasal golvet, som är tekniskt enklare. Ännu viktigare, visade Vermeulen (2011) att 2 metoderna är jämförbara16.

Uppvärmningen av lösningarna förblir diskussion mellan Europeiska och amerikanska-centers17,18. Det har förespråkat att använda lösningar vid 37 ° C i stället för 22 ° C ökar observerade totala klorid svaret med cirka 25% och isoproterenol-beroende klorid svaret ungefär 95%18. Men ökar uppvärmningen variabilitet, enligt bedömning av en större standardavvikelse av totala klorid svar17. Därför, eftersom uppvärmningen lösningarna är ytterligare en faktor av variabilitet, rekommenderas inte att värma lösningarna om det inte krävs på grundval av studien.

Vi har tidigare jämfört både av elektroden tekniker och fann att både Granulatfyllda och kalomel elektrodsystem drivs på samma sätt i basal som stimulerad strömmar i normala individer13.

Begränsningar av tekniken

Detta test är föremål för betydande inomindividuella variationen. Variabilityen av scoring är särskilt vanligt hos patienter med obestämt tracings och detta skall redovisas i diagnostiska program19. Faktorer av variabilitet är akut övre luftvägsinfektion, omfattande näspolyper, tidigare sinus kirurgi och CF-relaterade inflammation, som minskar dess specificitet och känslighet20,10. Dessutom, tolkning av tracings kan vara olika mellan läsarna, men expert läsare visar utmärkt överenskommelse av kvantitativa scoring och tolkningsbarhet i CF och icke-CF tracings, kontrasterande med en betydande variabilitet i de förtroende av spårning19.

Inneboende variabilitet kontra betydande tröskelvärden

Mycket viktigt, fysiologiska variabilityen av mätningen är betydande, vilket illustreras i olika studier10, såsom de CFTR genterapeutiska prövningar som uppvisade betydande fluktuationer i förändringar i klorid totala transport och amilorid sträcker sig21,22. Tvärsnittsdata utvärdering tyder på att noll Cl plus isoproterenol svar över tröskelvärdet på -5 -7 mV är cut-off mellan CF och icke-CF patienter10.

Vi saknar dock tydlig kunskap om omfattningen av förändringen av denna parameter som representerar en effektiv CFTR korrigering i fas-II studier med sjukdomsmodifierande terapier. För att bedöma enskilda svaret, kan upprepade tester övervakning att bemöta en intervention krävas att skilja betydande förändringar från inneboende variabilitet. Mycket viktigt, behöver framtida långsiktiga studier med sjukdomsmodifierande läkemedel Visa att förbättring av CFTR funktion korrelerar med förbättring av kliniskt relevanta resultat eller surrogat utfall (såsom förbättring av FEV1) CF sjukdom. Faktiskt, en nyligen fas II ivakaftor studie visade märkt klinisk nytta trots en liten förbättring i klorid sekretion23.

Sådana studier hjälper till att fastställa om en cut-off värdet av förbättring i trans-epitelial Clkonduktans kan vara en surrogat parameter för klinisk nytta. Detta skulle vara en viktig parameter för att styra utvecklingen av CFTR ändra terapier.

Betydelse med avseende på befintliga metoder: svett Test och Intestinal aktuella mätningar (ICM)

Hos patienter med '' tvivelaktiga '' cystisk fibros, som bedöms av en mellanliggande svett Cl koncentration mellan 30 och 60 mM, NPD sammansatta noter som tillhandahålls ett mycket känsliga verktyg för att diagnostisera patienter lika '' CF-sannolikt '' och '' CF-osannolikt ''10 . Intestinal strömmätning (ICM), vilket ger en ex vivo -mätning av net Cl flöden över rektal epitelet, tillåter också bestämning av CFTR restfunktion med en hög känslighet eftersom CFTR uttrycks mycket i Detta epitel.

Med tanke på modifiering av CFTR funktionen av CFTR modulatorer, förhållandet mellan dessa olika CFTR biomarkör förändringar är i dagsläget oklart. Även om senaste arbete baserat på bestäms ivakaftor att NPD och svett test är korrelerade4, det har ännu inte fastställts om en mätning i luftvägarna är en bättre prediktor för respiratoriska resultatet än exempelvis, svett testa24 , 25 eller förändring i ICM. Modifieraren droger kan också skiljer sig åt, i sin orgel specifika efficacies. När det gäller NPD är det viktigt att notera att förändringar i basala PD och amilorid svar uttrycka Na+ transport, medan förändringar i 0 Cl och isoproterenol reaktion express Cl transport. Det är ännu för att konstatera vilken av dessa är viktigare för sjukdom förbättringen.

Framtida tillämpning av denna teknik

Användningen av denna teknik förväntas utanför fältet CF. Eftersom denna teknik är unikt lämpade för att demonstrera Na+ och Cl jonkanal, kan det användas för att demonstrera dysfunktion i airways sjukdomar inklusive astma26, kronisk bronkit27, icke-CF-bronkiektasi28 och återkommande pankreatit29. Ändringar av denna teknik har dessutom använts i de nedersta luftvägarna (LAPD) för att demonstrera nedre luftvägarna-fokuserad CFTR dysfunktion i kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol) patienter med kronisk bronkit30.

NPD ger en känslig i vivo biomarkör för CFTR funktion, som kan användas för både diagnos och dessutom för proof-of-concept studier som syftar till att korrigera CFTR och ENaC kanal aktivitet i translationell forskning. Detta gör längsgående bedömning av trans-epitelial funktion och håller löftet som en strategi för personlig medicin att skräddarsy den effektivaste corrector för varje patient med CF.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av den funktionsdugliga gruppen för CFTR funktion av Standardization kommittén (kliniska prövningar nätverk, Europeiska cystisk fibros Society) och nationella resurser Center Working Group (Therapeutics Development Network, cystisk fibros Foundation). Ytterligare stöd tillhandahölls av stiftelsen CF (Clancy FY09 till GMS) och NIH (DK072482 till SMR och GMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) Fisher Scientific
Powerlab 4/30 AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 AD Instruments
Windows compatible PC - Minimum requirements of Windows XP or higher Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject) Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes Fisher Scientific 13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode BIOPAC Systems UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream Fisher Scientific Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device PROMED Feeling Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing Fisher Scientific 427411
Becton Dickinson PE 90 tubing Fisher Scientific 427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD Fisher Scientific 508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) 3M 1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US Marquat I0202US
1" X 10 yards silk tape 3M Durapore 1538-1
IV extension tubing (30", 50/box) International Limited IMN30
Three-way stopcock (50/box) Medex MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50 pk; 0.22-μm or smaller filters; or equivalent) Fisher Scientific 09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20 G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 427564
Becton Dickinson 23 G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 367283
Becton Dickinson Syringe 60 mL without needle Luer-Lok tip (40/Box) Fisher Scientific 309653
Becton Dickinson Syringe 10 mL without needle Luer-Lok tip (100/Box) Fisher Scientific 309604
Single use sterile wipes (per institutional availability) Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 L volumes acceptable) Fisher Scientific 430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23" x 36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) SureCare
23 G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) Becton Dickinson 367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional) Richmond Products, Inc 629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting  (or equivalent) Fisher Scientific No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl Spectrum Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2 •2H2O – USP Spectrum Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, KH2PO4 – USP Spectrum Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) Spectrum Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) Spectrum Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) Spectrum Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) Spectrum Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O Spectrum Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP Spectrum Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) Spectrum Formula Weight: 551; Size: 5 gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O) Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection - USP 1 mg/5 mL ampule Hospital Pharmacy Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 5 L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenstein, B. What is a Cystic Fibrosis Diagnosis? Clinics in Chest Medicine. 19, 423-441 (1998).
  2. Rosenstein, B., Cutting, G. R. The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The Journal of Pediatrics. 132, 589-595 (1998).
  3. Farrell, P. M., et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. The Journal of Pediatrics. 181, S4-S15 (2017).
  4. Mesbahi, M., et al. Changes of CFTR functional measurements and clinical improvements in cystic fibrosis patients with non-p.Gly551Asp gating mutations treated with ivacaftor. Journal of Cystic Fibrosis. 16, 45-48 (2017).
  5. Accurso, F., et al. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  6. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in Persons with Cystic Fibrosis and the G551D-CFTR Mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  7. Sermet, I., et al. Measurement of nasal potential difference in young children with an equivocal sweat test following newborn screening for cystic fibrosis. Thorax. 65, (6), 539-544 (2010).
  8. Wilschanski, M., et al. Mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene and In vivo Transepithelial Potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174, (7), 787794 (2006).
  9. Sermet-Gaudelus, I., et al. Clinical Phenotype and Genotype of Children with Borderline Sweat Test and Abnormal Nasal Epithelial Chloride Transport. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182, (7), 929-936 (2010).
  10. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate endpoint? European Respiratory Journal. 14, 38 (2013).
  11. US CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) and the ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society- Clinical Trials Network). Standard Operating Procedure 528.01. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). (2014).
  12. Knowles, M., et al. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in CF. New England Journal of Medicine. 305, (25), 1489-1493 (1981).
  13. Solomon, G. M., et al. An international Randomised Multicentre Comparison of NPD Techniques. Chest. 138, 919-928 (2010).
  14. Sermet, I., et al. Chloride Transport in Nasal Ciliated Cells of Cystic Fibrosis Heterozygotes. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171, 1026-1031 (2005).
  15. Naehrlich, L., et al. Nasal potential difference measurements in diagnosis of cystic fibrosis: an international survey. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (1), 24-28 (2014).
  16. Vermeulen, F., et al. Nasal potential measurements on the nasal floor and under the inferior turbinate: Does it matter? Pediatric Pulmonology. 46, (2), 145-152 (2011).
  17. Bronsveld, I., et al. Influence of perfusate temperature on nasal potential difference. European Respiratory Journal. 42, 389-393 (2013).
  18. Boyle, M., et al. A multi-center study on the effect of solution temperature on nasal potential difference measurements. Chest. 124, (2), 482-489 (2003).
  19. Solomon, G. M., et al. A Multiple Reader Scoring System for Nasal Potential Difference Parameters. Journal of Cystic Fibrosis. 16, (5), 573-578 (2017).
  20. Beekman, J. M., et al. CFTR functional measurements in human models for diagnosis, prognosis and personalized therapy: Report on the pre-conference meeting to the 11th ECFS Basic Science Conference, Malta, 26-29 March 2014. Journal of Cystic Fibrosis. 13, 363-372 (2014).
  21. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  22. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38, 59-69 (2011).
  23. Accurso, F., et al. Sweat Chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and Ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  24. Rowe, S., et al. Clinical Mechanism of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator Ivacaftor in G551D-mediated Cystic Fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190, (2), 175-184 (2014).
  25. Boyle, M., et al. A CFTR corrector lumacaftor and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 2, (7), 527-538 (2014).
  26. Schulz, A., Tummler, B. Non-allergic asthma as a CFTR-related disorder. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (5), 641-644 (2016).
  27. Sloane, P. A., et al. A pharmacologic approach to acquired cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction in smoking related lung disease. PLoS One. 7, (6), e39809 (2012).
  28. Bienvenu, T., et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Channel Dysfunction in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181, (10), 1078-1083 (2010).
  29. Werlin, S., et al. Genetic and electrophysiological characteristics of recurrent acute pancreatitis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 60, (5), 675-679 (2015).
  30. Dransfield, M. T., et al. Acquired Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Dysfunction in the Lower Airways in COPD. Chest. 144, (2), 498-506 (2013).
Standardiserad mätning av näsans membran Transepithelial Potential skillnad (NPD)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).More

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter