우리는 형광 활성화 세포 선별에 의한 인간 육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 자극하는 세포의 분리를 위한 상세한 프로토콜을 설명하고, 인간 백혈구 항원-1(HLA-1)을 음성 마커로 사용하고, 추가검증및 이러한 HLA-1 음성 종양 을 자극 하는 세포의 특성.
종양 을 자극하는 세포의 존재와 중요성 (TICs)는 지난 10 년 동안 증가 증거에 의해 지원되었습니다. 이러한 TICs종양 개시, 전이 및 약물 내성에 대한 책임이 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 현재 화학요법 전략 이외에 특정 TIC 표적 치료를 개발하는 것이 중요합니다, 이는 주로 비 TiCs의 대량에 집중합니다. TiCs의 악성 종양 뒤에 있는 기계장치를 더 이해하기 위하여는, 우리는 인간 육종에 있는 TiCs를 격리하고 특성화하는 방법을 기술합니다. 본 명세서에서, 인간 육종의 환자 유래 이종이식(PDXs)을 생성하고 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-1)를 음의 마커로서 사용하여 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의해 TiCs를 분리하는 상세한 프로토콜을 보여준다. 또한, 구형 형성 분석및 종양 형성 분석법을 포함하는 이러한 TICs를 기능적으로 특성화하고 중간엽 경로를 따라 분화를 유도하는 방법을 설명합니다. PDX TICs의 격리 및 특성화는 잠재적인 표적 치료 시약의 발견을 위한 단서를 제공합니다. 더욱이, 증가하는 기록은 이 프로토콜이 인간적인 암의 그밖 모형에서 TICs를 격리하고 특성화하기 위하여 더 확장될 수 있다는 것을 건의합니다.
인간 암의 종양 내 세포 이질성은 지난 10 년 동안증가 증거에 의해 지원되고있다 1. 정상 조직과 유사하게, 암 조직은 종양 형성 능력을 전시하는 TICs (또한 암 줄기 세포라고도 함)의 작은 소집단으로 구성됩니다; 한편, 암세포의 대부분은 분화된 표현형2를나타낸다. 이러한 TICs는 줄기 세포 마커의 발현 및 자가 재생 및 비대칭 세포 분열의 능력을 포함하는 줄기 세포 유사 특성을 나타내며,따라서, 세포 이종 종양 3의 형성을 시작할 수 있다. 최근 연구에 따르면 TICs는 종양 개시에 대한 책임이있을뿐만 아니라 종양 공격성4,전이5및약물 내성과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 따라서, TICs의 생물학을 이해하고, 따라서, 이 TiCs를 표적으로 하는 특정 처리 전략을 개발하는 것이 중요합니다.
FACS 기반 방법은 CD133, CD24 및 CD441을포함한 TICs 마커를 사용하여 TIC를 식별하는 데 사용되었습니다. 이러한 마커의 대부분은 또한 정상 줄기세포7에서 발현된다. 그러나 이러한 마커 중 어느 것도 전적으로 TiC를 표시하지 않습니다. 이 분자가 TiCs의 악성에서 재생하는 역할은 아직도 명확하지 않습니다. 예를 들어, CD133은 DNA 메틸화에 의해 빈번하게 비활성화될 수 있으며, 따라서, 이러한 종양간 이질성은 이들 마커8의 정확도를 렌더링할 수 있다. ALDH1은 또한 TICs 9의 줄기를 유지하는기능을 하는 마커입니다. 그것은 유방암 TICs를 확인하는 에서 더 효과적인 것처럼 보이지만 그밖종양 모형 9에서 아직도 의심스럽습니다. 몇몇 신호 통로는 Wnt (날개 없는 관련 통합 사이트), TGF-β (변형 성장 인자 베타),및 고슴도치 1을 포함하여 줄기 세포 생물학에 있는 중요한 역할을 합니다. 그러나 이 통로가 TIC 특이적임을 증명하고 1 차적인 종양에서 TiCs를 격리하기 위하여 이 통로의 활동을 이용하기 어렵습니다. 따라서, 신뢰할 수 있는 새로운 TIC 마커가 절실히 필요하다.
HLA-1이라고도 불리는 인간 MHC 클래스 I은 거의 모든 핵세포에서발현되는 세포 표면 단백질(10)이다. HLA-1은 CD8 T 세포(10)에 의해 특별히인식되는 분자를 제시하는 항원으로서의 기능을 한다. CD8 T 세포의 세포독성 효과는 암세포가 HLA-1에 의해 종양 항원을 제시할 때 활성화될 수 있다. 따라서, 암세포의 세포 표면에 HLA-1이 결여되면 세포독성 CD8 T 세포로부터의 면역탈출을 유도할 수 있다. HLA-1의 하향 조절은 인간 암의 상이한 모형에서 기술되고 나쁜 예후, 전이 및 약 저항성11와상관됩니다. 우리는 세포 표면에 HLA-1 발현의 손실이 육종에서뿐만 아니라 전립선 암6,12에서TICs를 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여 주었다.
여기에서는 HLA-1을 음성 마커로 사용하여 FACS에 의한 인간 육종 PDX에서 TiCs를 분리하고 이러한 HLA-1 음성 TICs를 더욱 검증하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.
인간 육종 PDXs에서 종양 개시 세포를 분리하고 특성화하기 위하여 이 프로토콜의 성공을 제한하는 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 우리는 PDX 대형이 육종 아류형에 매우 의존한다는 것을 관찰했습니다. 조직학적으로 미분화 된 표현형을 가진 임상 적 육종 (예를 들어, 다형성 미분화 육종 [성공률 100%, n = 2], 탈분화 지방 육종 [성공률 100%, n = 2], 및 활액 육종 [ 성공률 100%, n = 3])는 PDX 형성의 높은 성공률을 가지고 있다. 한편, 분화된 표현형(예를 들어, 잘 분화된 지방육종[성공률 0%, n=3])을 가진 육종은 더 낮은 PDX 형성률을 보여준다. 종양 을 자극하는 세포가 덜 악성, 분화 된 아류형보다 더 높은 비율로 더 악성 아류형에 존재할 수 있습니다. 또한, 우리는 세포 생존의 손실을 최소화하기 위해 어떤 정지없이 하루 이내에 종양 을 자극하는 세포 격리 절차를 마무리하는 것이 좋습니다.
우리는 HLA-1 음성 세포가 인간 육종에서 넓게 존재한다는 것을 확인했습니다. 그러나 HLA-1 음성 세포의 백분율은 다른 환자에게서 견본 사이에서 변화할 수 있습니다. 이 방법으로, 우리는 HLA-1 음성 세포가 0.5% 미만에서 30% 12 이상에 구역 수색하는 견본에서종양 자극 세포를 성공적으로 격리했습니다. 단리된 HLA-1-음성 세포의 종양-자극 세포 정체성을 확인하기 위해 구체 형성 및 종양 형성 분석에 의해 HLA-1-음성 세포를 기능적으로 특성화하는 것이 중요하다.
그러나 여기에 제시된 프로토콜에도 제한이 있습니다. 이전 데이터는 HLA-1 발현이 후성유전학적으로 조절되는 것으로 나타났으며, 이는 동일한종양(12)내에서 HLA-1 발현의 세포 이질성의 관찰과 일치한다. HLA-1 게놈 돌연변이는 육종 및 그밖 암 모형에서 검출되었습니다. HLA-1 유전자의 돌연변이는 전체 종양에서 세포 표면상에서 HLA-1의 완전한 손실로 이어질 수 있거나 또는 비기능성 돌연변이 HLA-1을 발현한다. 두 경우 모두, HLA-1 부정성은 종양 내의 TIC를 확인하기 위해 사용될 수 없다.
HLA-1을 음성 마커로 사용하여 다양한 인간 육종 하위 형으로부터 TiC를 성공적으로 분리하고 기능 분석을 통해 결과를 검증했습니다. 따라서, 우리는 이러한 TiCs를 표적으로 하는 특정 처리를 개발하기 위하여, TiCs에 유전자 발현 분석을 포함하여 분자 연구를 능력을 발휘할 수 있었습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NCI-P01-CA087497 (C.C.-C에 의해 지원되었습니다. 및 NIH-U 54-0OD020353 (C.C.C., D.H., J.D.D.), 민첩한 사고 리더 상 (C.C.C.에), 마르텔 재단 (C.C.C.와 J.D.D.).
0.2 μm cell culture filter | ThermoFisher | 450-0020 | |
100 mm Petri dish | Falcon | 353003 | |
15 mL conical tube | Falcon | 352196 | |
35 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 mL polystyrene tube | Falcon | 352070 | |
96-well ultra-low attachment cell culture plate | Corning | 7007 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
B-27 | Gibco | 08-0085SA | |
bFGF | Invitrogen | PHG0021 | |
dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
HLA-1-PE antibody | Abcam | ab43545 | |
hMSC growth medium | ATCC | PCS-500-030 | |
indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
isobutylmethylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
Isotype Control Antibody | Abcam | ab103534 | |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
lithium chloride | Sigma-Aldrich | 62476 | |
Matrigel basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
MEM Alpha | Gibco | 12571-063 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
NSG mice | The Jackson Lab | 005557 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
PBS | Corning | 21-040-CM | |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Syringe with needle | BD | 309626 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |