हम एक नकारात्मक मार्कर के रूप में मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन-1 (HLA-1) का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मानव सार्कोमा रोगी व्युत्पन्न xenografts से ट्यूमर शुरू कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन, और आगे सत्यापन के लिए और इन HLA-1-नकारात्मक ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता.
ट्यूमर शुरू कोशिकाओं (TICs) के अस्तित्व और महत्व पिछले एक दशक के दौरान सबूत बढ़ाने के द्वारा समर्थित किया गया है. इन TICs ट्यूमर दीक्षा, मेटास्टेसिस, और दवा प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार होना दिखाया गया है. इसलिए, वर्तमान रसायन चिकित्सा रणनीतियों के अलावा विशिष्ट टीआईसी-लक्ष्यीकरण चिकित्सा विकसित करना महत्वपूर्ण है, जो ज्यादातर गैर-टीआईसी के थोक पर ध्यान केंद्रित करते हैं। आदेश में आगे TICs की द्रोह के पीछे तंत्र को समझने के लिए, हम एक विधि को अलग करने के लिए और मानव सार्क में TICs की विशेषता का वर्णन. इसमें, हम मानव सार्कोमा के रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) उत्पन्न करने के लिए और एक नकारात्मक मार्कर के रूप में मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन वर्ग मैं (HLA-1) का उपयोग कर फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा TICs को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिखा। इसके अलावा, हम वर्णन कैसे कार्यात्मक इन TICs की विशेषता के लिए, एक क्षेत्र के गठन परख और एक ट्यूमर गठन परख सहित, और mesenchymal रास्ते के साथ भेदभाव प्रेरित करने के लिए. अलगाव और PDX TICs की विशेषता संभावित लक्ष्यीकरण चिकित्सा अभिकर्मकों की खोज के लिए सुराग प्रदान करते हैं. इसके अलावा, बढ़ते सबूत पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल को और अधिक अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और मानव कैंसर के अन्य प्रकार से TICs की विशेषता.
मानव कैंसर के इंट्राट्यूमरल सेलुलर विषमता को पिछले दशक1के दौरान साक्ष्य में वृद्धि करके सहायता प्रदान की गई है . सामान्य ऊतक के समान, कैंसर के ऊतकों में TICs (जिसे कैंसर स्टेम सेल भी कहा जाता है) की एक छोटी सी उपजनसंख्या होती है, जो ट्यूमर बनाने की क्षमता प्रदर्शित करती है; इस बीच, कैंसर कोशिकाओं के थोक विभेदित phenotypes2प्रदर्शन. इन TICs स्टेम सेल की तरह गुण दिखाने के लिए, एक स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति और दोनों आत्म-नवीकरण और असममित सेल विभाजन की क्षमता सहित, और इस प्रकार, एक सेलुलर विषम ट्यूमर3के गठन आरंभ कर सकते हैं. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि टीआईसी न केवल ट्यूमर दीक्षा के लिए जिम्मेदार हैं बल्कि ट्यूमर आक्रामकता4, मेटास्टेसिस5, और दवा प्रतिरोध6के साथ भी जुड़े हुए हैं . इसलिए, यह TICs के जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और, इस प्रकार, इन TICs को लक्षित एक विशिष्ट उपचार रणनीति विकसित.
FACS-आधारित विधियों का उपयोग TICs मार्करका उपयोग करके TICs की पहचान करने के लिए किया गया है, जिसमें CD133, CD24 और CD441शामिल हैं। इनमें से अधिकांश मार्कर सामान्य स्टेम कोशिकाओं7में भी व्यक्त किए जाते हैं . हालांकि, इन मार्करों में से कोई भी केवल TICs निशान. TICs की द्रोह में इन अणुओं की भूमिकाएँ अभी भी स्पष्ट नहीं हैं। उदाहरण के लिए, CD133 डीएनए मिथाइलेशन द्वारा अक्सर निष्क्रिय किया जा सकता है, और इस प्रकार, इस intertumoral विषमता इन मार्करों8की सटीकता प्रदान कर सकते हैं. ALDH1 एक मार्कर है कि भी TICs9के स्टेमनेस बनाए रखने के लिए कार्य करता है. यह स्तन कैंसर TICs की पहचान करने में अधिक प्रभावी लगता है, लेकिन अभी भी अन्य ट्यूमर प्रकार9में संदिग्ध है . कुछ संकेतन रास्ते स्टेम सेल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, Wnt (wingless से संबंधित एकीकरण साइट), TGF-जेड (परिवर्तन विकास कारक बीटा), और हेजहॉग1सहित. लेकिन यह साबित करना मुश्किल है कि इन रास्ते टीआईसी-विशिष्ट हैं और प्राथमिक ट्यूमर से TICs को अलग करने के लिए इन रास्ते की गतिविधि का उपयोग करें। इस प्रकार, एक विश्वसनीय उपन्यास टीसी मार्कर तत्काल जरूरत है.
मानव MHC वर्ग मैं, भी HLA-1 कहा जाता है, एक सेल सतह प्रोटीन लगभग सभी नाभिकीय कोशिकाओं में व्यक्त10है. एचएलए-1 एक प्रतिजन के रूप में कार्य करता है जो एक अणु पेश करता है जिसे विशेष रूप से CD8 T कोशिकाओं10द्वारा मान्यता प्राप्त है। सीडी 8 टी कोशिकाओं के cytotoxic प्रभाव सक्रिय किया जा सकता है जब कैंसर की कोशिकाओं HLA-1 द्वारा एक ट्यूमर प्रतिजन मौजूद. इसलिए, कैंसर कोशिकाओं की कोशिका सतह पर HLA-1 की कमी साइटोटॉक्सिक सीडी 8 टी कोशिकाओं से प्रतिरक्षा से बचने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एचएलए-1 के डाउनरेगुलेशन को विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर में वर्णित किया गया है और यह खराब पूर्वानुमान, मेटास्टेसिस और दवा प्रतिरोध11के साथ सहसंबद्ध है। हमने दिखाया है कि कोशिका की सतह पर एचएलए-1 अभिव्यक्ति के नुकसान का उपयोग सार्कोमा में टीआईसी की पहचान करने के साथ-साथ प्रोस्टेट कैंसर6,12में किया जा सकता है।
यहाँ, हम एक नकारात्मक मार्कर के रूप में HLA-1 का उपयोग कर, और आगे मान्य और इन HLA-1-नकारात्मक TICs की विशेषता के लिए, FACS द्वारा मानव सार्कोमा PDXs से TICs को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
मानव सार्कोमा से ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं को अलग करने और उनकी विशेषता के लिए इस प्रोटोकॉल की सफलता को सीमित करने वाले कई महत्वपूर्ण कदम हैं। मानव सार्कोमा में कई अलग-अलग उपप्रकार शामिल हैं। हमने देखा कि पीडीएक्स का गठन सार्कोमा उपप्रकारों पर अत्यधिक निर्भर है। नैदानिक आक्रामक सार्कोमा एक हिस्टोलॉजिकल रूप से अलग-अलग फीनोटाइप के साथ (जैसे, प्लेमॉर्फिक अपृथक्करणीय सार्कोमा [सफलता दर 100%, n ] 2], अलग-अलग liposarcomas [सफलता दर 100%, n ] 2], और synovial सार्कोमा ] सफलता दर 100%, n [ 3]) PDX गठन की एक उच्च सफलता दर है. इस बीच, विभेदित phenotypes के साथ सार्कोमा (जैसे, अच्छी तरह से अलग liposarcomas [सफलता दर 0%, n ] 3]) कम PDX गठन दर दिखा. यह संभव है कि ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाएं कम घातक, विभेदित उपप्रकारों की तुलना में अधिक प्रतिशत पर अधिक घातक उपप्रकारों में मौजूद हों। इसके अलावा, हम सेल व्यवहार्यता के किसी भी नुकसान को कम करने के लिए किसी भी रोक के बिना एक दिन के भीतर ट्यूमर शुरू सेल अलगाव प्रक्रिया खत्म करने की सलाह देते हैं।
हमने पहचान की है कि मानव सार्कोमा में एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं व्यापक रूप से मौजूद हैं। लेकिन HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत विभिन्न रोगियों से नमूनों के बीच भिन्न हो सकते हैं. इस विधि से, हमने सफलतापूर्वक ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं को उन नमूनों से अलग कर दिया है जिनमें एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं हैं जो 0.5% से अधिक 30%12तक होती हैं। अलग HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं के ट्यूमर शुरू सेल पहचान की पुष्टि करने के लिए क्षेत्र गठन और ट्यूमर गठन assays द्वारा कार्यात्मक HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण है।
हालांकि, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी सीमाएं हैं। पिछले डेटा से पता चला है कि HLA-1 अभिव्यक्ति epigeneticly विनियमित है, जो एक ही ट्यूमर12के भीतर HLA-1 अभिव्यक्ति के सेलुलर विषमता के अवलोकन के साथ संगत है. एचएलए-1 जीनोमिक उत्परिवर्तनों का पता सार्कोमा और अन्य कैंसर प्रकारों में पाया गया। HLA-1 जीन में उत्परिवर्तन पूरे ट्यूमर में सेल सतह पर HLA-1 का पूरा नुकसान करने के लिए या nonfunctional उत्परिवर्तित HLA-1 व्यक्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. किसी भी मामले में, एचएलए-1 नकारात्मकता का उपयोग ट्यूमर के भीतर टीआईसी की पहचान करने के लिए नहीं किया जा सकता है।
एक नकारात्मक मार्कर के रूप में HLA-1 का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक मानव सार्कोमा subtypes की एक किस्म से TICs अलग है और कार्यात्मक विश्लेषण द्वारा हमारे परिणामों को मान्य. इस प्रकार, हम इन TICs को लक्षित विशिष्ट उपचार विकसित करने के लिए, TICs पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सहित आणविक अध्ययन करने में सक्षम थे.
The authors have nothing to disclose.
इस शोध NCI-P01-CA087497 द्वारा समर्थित किया गया था (C.C.-C करने के लिए. और डी.एच.) और NIH-U 54-0OD020353 (C.C.-C., D.H., और J.D.-D.), एगिलेंट सोचा नेता पुरस्कार (सी.सी.-सी. को), और Martel फाउंडेशन (सी.सी.-सी. और जे.डी.-डी.)
0.2 μm cell culture filter | ThermoFisher | 450-0020 | |
100 mm Petri dish | Falcon | 353003 | |
15 mL conical tube | Falcon | 352196 | |
35 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 mL polystyrene tube | Falcon | 352070 | |
96-well ultra-low attachment cell culture plate | Corning | 7007 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
B-27 | Gibco | 08-0085SA | |
bFGF | Invitrogen | PHG0021 | |
dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
HLA-1-PE antibody | Abcam | ab43545 | |
hMSC growth medium | ATCC | PCS-500-030 | |
indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
isobutylmethylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
Isotype Control Antibody | Abcam | ab103534 | |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
lithium chloride | Sigma-Aldrich | 62476 | |
Matrigel basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
MEM Alpha | Gibco | 12571-063 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
NSG mice | The Jackson Lab | 005557 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
PBS | Corning | 21-040-CM | |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Syringe with needle | BD | 309626 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |