Vi beskriver en detaljert protokoll for isolering av tumor-initiere celler fra humant sarkom pasient-avledet xenotransplantater av fluorescens celle sortering, ved hjelp av humant leukocytter antigen-1 (HLA-1) som en negativ markør, og for ytterligere validering og karakterisering av disse HLA-1-negative tumor-initiere celler.
Eksistensen og viktigheten av tumor-initiering celler (rykninger) har blitt støttet av økende bevis i løpet av det siste tiåret. Disse rykninger har vist å være ansvarlig for tumor initiering, metastasering, og resistens. Derfor er det viktig å utvikle spesifikk TIC-målretting terapi i tillegg til dagens kjemoterapi strategier, som hovedsakelig fokuserer på mesteparten av ikke-rykninger. For ytterligere å forstå mekanismen bak den menneskelige rykninger, beskriver vi en metode for å isolere og karakterisere rykninger i humant sarkomer. Heri, viser vi en detaljert protokoll for å generere pasient-avledet xenotransplantater (PDXs) av menneskelig sarkomer og å isolere rykninger av fluorescens celle sortering (FACS) ved hjelp av humant leukocytter antigen klasse I (HLA-1) som en negativ markør. Også beskriver vi hvordan du funksjonelt karakterisere disse rykninger, inkludert en sfære formasjon analysen og en svulst formasjon analysen, og å indusere differensiering langs mesenchymal trasé. Isolasjonen og karakterisering av PDX-rykninger gir ledetråder til oppdagelsen av potensielle målrettings reagenser for behandling. Videre tyder det på økende bevis på at denne protokollen kan bli ytterligere utvidet til å isolere og karakterisere rykninger fra andre typer av menneskelig kreft.
Intratumoral Cellular heterogenitet av menneskelig kreft har blitt støttet av økende bevis i løpet av det siste tiåret1. I likhet med normalt vev består kreft vev av en liten pasientpopulasjonen av rykninger (også kalt kreft stamceller), som viser tumor-forming evne; i mellomtiden, hoveddelen av kreftceller viser differensiert fenotyper2. Disse rykninger viser stilk celle-lignende egenskaper, inkludert uttrykk for en stilk cellen markør og evnen til både selv-fornyelse og asymmetrisk celledeling, og dermed kan starte dannelsen av en mobilnettet heterogen tumor3. Nyere studier har avdekket at rykninger er ikke bare ansvarlig for tumor initiering, men er også forbundet med tumor aggressivitet4, metastasering5, og resistens6. Derfor er det viktig å forstå hvor biologisk det er, og dermed utvikle en spesifikk behandlings strategi rettet mot disse.
FACS-baserte metoder har blitt brukt til å identifisere rykninger ved hjelp av rykninger-markører, inkludert CD133, CD24 og CD441. De fleste av disse markørene er også uttrykt i normale stamceller7. Men ingen av disse markørene bare merke rykninger. Rollene disse molekylene spiller i den kreft av rykninger er fortsatt ikke klart. For eksempel kan CD133 ofte deaktiveres av DNA-metylering, og dermed kan denne intertumoral heterogenitet gjengi nøyaktigheten av disse markørene8. ALDH1 er en markør som også fungerer for å opprettholde stemness i den9. Det synes å være mer effektiv i å identifisere brystkreft, men er fortsatt tvilsom i andre tumor typer9. Noen signalering trasé spille viktige roller i stilk cellen biologi, inkludert wnt (vingeløse-relatert integrering nettsted), TGF-β (transformere vekstfaktor Beta), og Hedgehog1. Men det er vanskelig å bevise at disse banene er TIC-spesifikke og å bruke aktiviteten på disse veiene for å isolere rykninger fra primære svulster. Dermed er en pålitelig roman TIC markør presserende behov.
Human MHC klasse jeg, også kalt HLA-1, er en celle overflate protein uttrykt i nesten alle kjerne celler10. HLA-1 fungerer som et antigen presentere et molekyl som er spesielt anerkjent av CD8 T-celler10. Den cytotoksisk effekten av CD8 T-celler kan aktiveres når kreftceller presentere en svulst antigen av HLA-1. Derfor, mangler HLA-1 på celleoverflaten av kreftceller kan føre til en immun flukt fra cytotoksisk CD8 T-celler. Downregulation av HLA-1 har blitt beskrevet i ulike typer av menneskelig kreft og er korrelert med dårlig prognose, metastasering, og resistens11. Vi har vist at tapet av HLA-1-uttrykket på celleoverflaten kan brukes til å identifisere rykninger i sarkomer, så vel som i prostata kreft6,12.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere rykninger fra humant sarkom PDXs av FACS, ved hjelp av HLA-1 som en negativ markør, og for ytterligere å validere og karakterisere disse HLA-1-negative rykninger.
Det er flere viktige trinn som begrenser suksessen til denne protokollen til å isolere og karakterisere tumor-initiere celler fra menneskelige sarkom PDXs. Human sarkom inkluderer mange forskjellige under typer. Vi observerte at PDX-formasjonen er svært avhengig av sarkom under typer. Klinisk aggressiv sarkomer med en histologisk udifferensierte fenotype (f. eks, pleomorphic udifferensierte sarkomer [suksess rate 100%, n = 2], dedifferentiated Liposarcomas [suksess rate 100%, n = 2], og synovial sarkomer [ suksessraten 100%, n = 3]) har en høy suksess rate på PDX-formasjonen. I mellomtiden, sarkomer med differensiert fenotyper (f. eks, godt differensiert Liposarcomas [suksess rate 0%, n = 3]) viser lavere PDX formasjon priser. Det er mulig at celler med tumor Start finnes i flere ondartede under typer på en høyere prosentandel enn i mindre ondartede, differensiert under typer. I tillegg anbefaler vi å fullføre tumor-initiere celle isolasjon prosedyre i løpet av en dag uten stopp for å minimere tap av celle levedyktighet.
Vi har identifisert at HLA-1-negative celler finnes mye i menneskelig sarkomer. Men andelen av HLA-1-negative celler kan variere mellom prøver fra forskjellige pasienter. Ved denne metoden har vi med hell isolert tumor-initiere celler fra prøver som har HLA-1-negative celler som spenner fra mindre enn 0,5% til mer enn 30%12. Det er viktig å karakterisere HLA-1-negative celler funksjonelt ved sfære dannelse og tumor formasjon analyser for å bekrefte tumor-initiering celle identitet av isolerte HLA-1-negative celler.
Imidlertid har protokollen som presenteres her også begrensninger. Tidligere data viste at HLA-1 uttrykk er epigenetically regulert, som er forenlig med observasjon av HLA-1 uttrykket mobilnettet heterogenitet innenfor samme tumor12. HLA-1 genomisk mutasjoner ble påvist i sarkomer og andre krefttyper. Mutasjoner i HLA-1 gener kan føre til fullstendig tap av HLA-1 på celleoverflaten i hele svulsten eller å uttrykke fungerende mutert HLA-1. I begge tilfeller kan HLA-1 negativitet ikke brukes til å identifisere rykninger i svulsten.
Ved hjelp av HLA-1 som en negativ markør, har vi lykkes isolert rykninger fra en rekke menneskelige sarkom under typer og validert våre resultater ved funksjonell analyse. Dermed var vi i stand til å utføre molekylære studier inkludert genuttrykk analyse på rykninger, for å utvikle spesifikk behandling rettet mot disse rykninger.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av NCI-p01-CA087497 (til C.C.-C. og D.H.) og NIH-U 54-0OD020353 (til C.C.-C., D.H. og JD-D.), Agilent trodde Leader Award (til C.C.-C.), og Martel Foundation (til C.C.-C. og JD-D.).
0.2 μm cell culture filter | ThermoFisher | 450-0020 | |
100 mm Petri dish | Falcon | 353003 | |
15 mL conical tube | Falcon | 352196 | |
35 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 mL polystyrene tube | Falcon | 352070 | |
96-well ultra-low attachment cell culture plate | Corning | 7007 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
B-27 | Gibco | 08-0085SA | |
bFGF | Invitrogen | PHG0021 | |
dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
HLA-1-PE antibody | Abcam | ab43545 | |
hMSC growth medium | ATCC | PCS-500-030 | |
indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
isobutylmethylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
Isotype Control Antibody | Abcam | ab103534 | |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
lithium chloride | Sigma-Aldrich | 62476 | |
Matrigel basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
MEM Alpha | Gibco | 12571-063 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
NSG mice | The Jackson Lab | 005557 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
PBS | Corning | 21-040-CM | |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Syringe with needle | BD | 309626 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |