Summary
Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.
Abstract
Des tissus animaux et végétaux sont composée de populations distinctes de cellules. Ces cellules interagissent au fil du temps pour bâtir et maintenir les tissus et peuvent provoquer des maladies lorsque perturbés. Les scientifiques ont développé des techniques intelligents afin d’étudier les caractéristiques et la dynamique naturelle de ces cellules dans les tissus intacts en exprimant des protéines fluorescentes en sous-ensembles de cellules. Toutefois, à certains moments, expériences nécessitent plus sélectionnée visualisation des cellules dans les tissus, parfois à la manière monocellulaires ou population-de-cells. Pour atteindre cet objectif et visualiser les cellules individuelles au sein d’une population de cellules, les scientifiques ont utilisé unicellulaires photoconversion de protéines fluorescentes. Pour illustrer cette technique, nous montrons ici comment diriger la lumière UV à une cellule exprimant l’Eos d’intérêt dans un état intact, vit le poisson-zèbre. Nous avons ensuite image ces cellules de Eos+ photoconverted 24 h plus tard pour déterminer comment ils ont changé dans le tissu. Nous décrivons deux techniques : simple cellule photoconversion et photoconversions des populations de cellules. Ces techniques permettent de visualiser les interactions cellule-cellule, cellule-destin et différenciation et les migrations cellulaires, ce qui en fait une technique qui s’applique à nombreuses questions biologiques.
Introduction
Plusieurs cellules distinctes interagissent pour construire et entretenir des tissus animaux et végétaux complexes. Ces cellules sont souvent intercalés et difficiles à distinguer des voisins au niveau unicellulaire sans microscopie haute résolution qui nécessitent la fixation du tissu. Cependant, pour comprendre comment ces forment les tissus, sont maintenus et deviennent malades, il a été essentiel pour étudier comment simple cellules dans les tissus sont en interaction avec le temps. Idéalement, ces expériences exigent l’étiquetage des cellules individuelles au sein d’un tissu, d’une manière non invasive sans l’exigence de fixation. Les scientifiques ont maintenant développé de nombreuses techniques pour accomplir cette tâche1,2,3,4.
La découverte et la mise en œuvre de la protéine fluorescente méduse verte (GFP) était une approche passionnante qui a permis pour l’étiquetage des cellules distinctes dans un tissu environnement1. À l’aide de promoteurs spécifiques des cellules, il est possible de sélectionner génétiquement un sous-ensemble de cellules qui sont étiquetés1. Alternativement, expression induite virale de GFP peut être utilisée pour expression sélectionné par l’utilisateur de GFP3,4. Bien que très utile, expression génétique de médiation de GFP ne permet pas d’expression sélectionné par l’utilisateur dans un sous-ensemble de cellules dans les tissus ; et l’expression virale de GFP, bien qu’avantageuse, peut être envahissante. Avec l’avènement des dérivés de la GFP et habiles techniques comme Brainbow pour exprimer les protéines fluorescentes distinctes plus faiblement dans les tissus, il est devenu possible de visualiser les cellules individuelles et les interactions entre eux en tissu complexe2, 5. Toutefois, ces approches étiqueter les cellules de façon aléatoire. Si l’expérience désirée exige la visualisation d’une seule cellule ou d’une population de cellules qui est définie par l’expérimentateur, elles sont donc limitées. Avec de telles expériences, il serait avantageux d’avoir une protéine fluorescente génétiquement explicite qui peut être manipulée pour distinguer, d’une façon unique cellule, d’autres cellules fluorescentes et non fluorescent.
Pour atteindre cet objectif et visualiser la biologie cellulaire de cellules individuelles au sein d’un tissu vivant complexe, la communauté scientifique utilise seule cellule photoconversion distinctes de protéines fluorescentes6,7,8. Vous utilisez génétiquement contrôlé d’expression d’une protéine et (c.-à-d., eos, kaede, etc.) qui passe du vert au rouge État fluorescente lorsqu’ils sont exposés aux UV (488 nm) léger, on distingue une seule cellule de ses fluorescent étiquetés voisins6,7,8. Cette approche utilise un appareil attaché à notre microscope confocal qui peut diriger la lumière d’une pile de laser à une région limitée par la diffraction d’intérêt. Avec cette technique, nous pouvons soit l’étiquette cellules individuelles ou des populations plus importantes dans une manière définie par l’utilisateur9,10,11. La technique est peu invasive par rapport à des injections de cellule unique de GFP virale. Comme une preuve de concept, nous montrons que nous pouvons photoconvert des cellules individuelles au sein d’un ganglion dans le système nerveux périphérique et de la photoconvert des populations plus importantes comme les cellules situées sur la face ventrale de la moelle épinière9,10, 11,12. Ensuite, nous pouvons visualiser ces populations de cellules photoconverted 24h plus tard pour avoir un aperçu de leur mouvement et de la différenciation au cours du développement.
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Protocol
Toutes les études animales ont été approuvés par l’Université de Notre Dame institutionnels et animalier Comité d’urbanisme.
1. préparation de l’éprouvette de poisson-zèbre
- Placez un mâle adulte et un adulte femelle Tg (protéine convertible) dans une chambre accouplement par procédures standard13. Dans ce manuscrit, utilisez Tg(sox10:eos) poisson9 en raison de l’accès mais autres lignées transgéniques avec les protéines et peut être utilisée indifféremment. Mis en place plus d’une chambre dans le cas où ne pas placer de poissons. Laissez le poisson à rester dans la salle pendant la nuit.
- Le lendemain matin, ramasser les œufs dans des boîtes de Petri de 100 mm. Laisser les oeufs à maturité à la fertilisation après 24h (hpf) avant de dépistage.
- Si les animaux ci-dessus est hétérozygotes pour le transgène, plats hpf écran 24 pour les embryons Tg(sox10:eos) + avec un 488 nm source lumineuse et GFP filtrent ensembles sur un microscope à dissection. Isoler les embryons Tg(sox10:eos) + et laisser pour mûrir à 48 hpf.
- Dechorionate embryons manuellement avec une aiguille ou une pince à épiler.
- Préparer et chauffer 5 mL de solution de gel d’agarose point bas point de fusion 0,8 %.
- Une fois que l’agarose est froid au toucher, placer 3-4 Tg anesthésiés (sox10:eos) + 48 Pétri de fond de poisson hpf au centre d’une lamelle de verre de 10 mm.
- Ajouter assez d’agarose pour couvrir la surface de la lamelle, environ 1 mL. Utilisez une aiguille sonde pour disposer les poissons sur leurs côtés. Permettre d’agarose solidifier pour assurer le montage des animaux. Il peut être nécessaire de continuellement ré-arranger le poisson-zèbre, jusqu'à ce que l’agar solidifie14. Solidification prend environ 2 min.
- Une fois l’agarose a solidifié pendant 2 min, ajouter lentement milieu d’embryon contenant 0,02 % acide aminobenzoïque ester (tricaïne) à plat jusqu'à ce que la surface inférieure de l’agar et le plat est immergée. Cela devrait être environ 3mL.
2. microscope montage et imagerie de pré-conversion
- Ouvrez le logiciel confocal et sélectionner les fenêtres de capture et de mise au point [Figure 1]. Sous la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifiques lab sous la capture réglage menu déroulant onglet [Figure 1]. Ici, le paramètre de laboratoire spécifique est appelé «poisson Imaging. »
- Placer l’échantillon sur la portée confocale et donner le focus à l’aide de cours et les boutons de réglage fin.
- Ouvrez la fenêtre de discussion et localiser la région souhaitée d’intérêt (c.-à-d. les ganglions rachidiens).
- Sélectionnez le laser c488 sous le menu filtre défini. Régler l’exposition à 300 ms, laser de puissance à 5 et intensifier à 75 [Figure 2].
- Cocher la case 3D sous la section type de capture . Dans la section Capture 3D , sélectionnez utiliser la position actuelle et vérifier la plage autour de courant. Dans la même section, définissez la plage à 35 le nombre d’avions à 36 et la taille de palier 1. La gamme peut être augmentée ou diminuée pour tenir compte de la profondeur de la zone d’imagerie. Pour la moelle épinière, une valeur de plage entre 35-40 piles est généralement suffisant [Figure 5].
- Sélectionnez l’emplacement actuel [Figure 5].
- Cliquez sur Démarrer en bas de la fenêtre de capture, d’acquisition d’image.
3. cellule unique Photoconversion
- Ouvrez le logiciel confocal et sélectionner les fenêtres de capture et de mise au point [Figure 1]. Sous la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifiques lab sous la capture réglage menu déroulant onglet [Figure 1]. Ici, le paramètre de laboratoire spécifique est appelé « Poisson ablation complète puce. »
- Sélectionnez le laser c488 et c541 sous le menu filtre défini. Si ce n’est pas le cas, en utilisant le même logiciel de microscope, trouver le menu pour sélectionner les différents lasers et de sélectionner les 488 nm et de 541 nm lasers. Définir les expositions à 300 ms, laser de puissance à 5 et intensifier à 75 [Figure 2]. Ces paramètres laser seront choisis sur la production assez signal fluorescent sans causer de photoblanchiment ou toxicité. Si toxicité ou photoblanchiment est visualisé, réduire la puissance laser ou l’exposition.
- Ouvrez la fenêtre de discussion et cliquez sur l’onglet photomanipulation dans la fenêtre de discussion. Ajuster les paramètres du laser en conséquence. Changer la puissance du laser pile à 2 et puis cliquez sur OK. Changer la taille du bloc Raster à 1, puis cliquez sur définir. Changer la taille de double-clic à 4. Remplacez la ligne laser v405 [Figure 3].
- Ouvrez les paramètres avancés de capture dans la fenêtre de capture. Sélectionnez l’onglet photomanipulation et définissez les répétitions de double-clic sur 2. Cliquez sur OK [Figure 4].
- Sélectionnez l’onglet XY dans la fenêtre de discussion. Vérifiez les paramètres du laser de l’étape 2 dans l’onglet photomanipulation [Figure 3, Figure 4]. Définir les paramètres de laser à photoconvert la cellule des intérêts sans photoconversion des cellules environnantes.
- Se photoconversion de cellules adjacentes, réduire la puissance du laser. Si photoconversion des cellules ne se produit pas, les puissances de laser peuvent être augmentées. La valeur optimale, puissance du laser photoconvert seule de la région d’intérêt et ne pas les régions avoisinantes.
- Cochez la case timelapse sous type de capture. Puis, cliquez sur Démarrer [Figure 6].
- Une fois que la fenêtre de timelapse direct s’ouvre, sélectionnez l’outil cercle sur la barre d’outils supérieure [Figure 7]
- Tracez un cercle dans la région centrale de la cellule. Cliquez avec le bouton droit sur le cercle dessiné, sélectionnez la région FRAPet attendre 3 secondes. La zone sélectionnée doit devenir gradateur [Figure 8]. Cliquez sur arrêter la capture.
- Si plus d’un animal de l’imagerie, revenir à l’onglet XY dans le menu de mise au point et sélectionnez position 2. Ensuite, répétez les étapes 4.1 à 4.6.
- Pour convertir une population de cellules, suivre les paramètres de protocole et laser pour obtenir la procédure 4.1 à 4.4 sauf au lieu de dessiner un cercle pour FRAP la région d’intérêt, utilisez l’outil en ligne. Tracez une ligne sur la région d’intérêt et FRAP la région en utilisant les mêmes paramètres énumérés ci-dessus.
4. post-photoconversion Imaging
- Une fois que tous les points sont photoconverted. Sélectionnez la pile d’image standard de laboratoire spécifiques définissant décrit dans la precoversion d’imagerie étape 3. Cela se trouve sous la capture définissant le menu déroulant onglet dans la fenêtre de capture [Figure 5].
- Sélectionnez le laser c488 et régler l’exposition à 300ms, puissance 5 laser et intensifier à 75 [Figure 2].
- Sélectionnez le laser c541 trouvé sous le même menu que le laser c488. Régler l’exposition à 500 ms, puissance de 10 de laser et d’intensifier à 75 [Figure 9].
- Cocher la case 3D sous la section type de capture . Dans la section Capture 3D , sélectionnez utiliser la position actuelle et vérifier la plage autour de courant. Dans la même section, définissez la plage à 35 le nombre d’avions à 36 et la taille de palier 1. Le numéro de série peut augmenter ou diminuer pour s’adapter à la profondeur désirée d’imagerie [Figure 5].
- S’il y a plusieurs points dans l’onglet de discussion XY, sélectionnez l’option liste multipoint dans la fenêtre de capture. Si ce n’est pas le cas, sélectionnez l’emplacement actuel.
- Cliquez sur Démarrer en bas de la fenêtre de capture, d’acquisition d’image.
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Representative Results
Photoconversion de protéines fluorescentes peut être utilisée pour étiqueter des cellules distinctes au sein d’un tissu6. Pour illustrer cela, Tg(sox10:eos) poisson9 ont été utilisés pour exprimer la protéine et Eos sous les séquences régulatrices de sox10. Les animaux Tg(sox10:eos) à 48 hpf ont monté tout d’abord et ensuite imagés pour détecter n’importe quel photoconversion non spécifique qui peut avoir eu lieu. L’Eos non-convertis signal fluorescent peu Eos photoconverted signal fluorescent est alors visualisée (Figure 10). Animaux était maintenus dans l’obscurité pour photoconversion non spécifique soit minime. Ensuite, les régions d’intérêt ont été exposées aux rayons ultraviolets, à l’aide de la configuration de microscope confocal. Pour confirmer que les cellules individuelles ont été photoconverted à la suite de l’exposition aux UV, nous avons pris z-cheminées de la zone s’étendant sur la région de photoconverted. Compatible avec succès photoconversion, il y avait peu de détection des Eos non converti à l’extérieur de la région d’intérêt et photoconverted Eos a été nettement présent dans la région d’intérêt. L’image résultante montre une cellule unique dans un ganglion qui est étiqueté définitivement de ses voisins (Figure 10).
Pour démontrer l’utilité de cette technique de photoconversion, une population de cellules a été également exposée à la lumière UV. Dans ce paradigme, pré-photoconversion images ont été prises et aucun signal de Eos ONU-photoconverted n’était présent. Ensuite, la partie ventrale de la moelle épinière a été exposée aux UV, à l’aide d’une ligne (Figure 11). Pour confirmer le succès photoconversion, post-photoconversion images ont été prises et photoconverted Eos dans les cellules de la moelle épinière ventrale à l’emplacement de la ligne d’intérêt que nous avons puisé ont été visualisées (Figure 11). Non-photoconverted Eos signal était visible dans tous les autres domaines. Pour étendre cette technique, nous avons alors pris des images identiques 24 heures après la photoconversion. Dans ces images, les cellules Eos+ photoconverted ont été vus éparpillés dans toute la région de la moelle épinière dans des endroits dorsales et ventrales (Figure 12). Ces données concordent avec l’hypothèse que les cellules de la colonne vertébrale ventrales déplacés aux endroits dorsales que précédemment décrit10. Ensemble, ces deux techniques montrent que photoconversion de Eos peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles ou des populations de cellules dans une région de tissu d’une manière définie par l’utilisateur. Cela a contribué à une meilleure compréhension des caractéristiques cellulaires tels que la migration cellulaire, la communication et la dynamique.
Figure 1 : Capture et concentrer Windows. Capture d’écran du logiciel illustrant l’emplacement des fenêtres de capture et de mise au point et le laboratoire spécifique « Poisson l’ablation complète puce » déroulant onglet. Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : paramètres Laser c488. Capture d’écran de la fenêtre de capture montrant les paramètres spécifiques au laser c488. L’exposition est Mme 300 puissance du Laser est 5. Intensifier est 75. Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Paramètres Laser Photoconversion. Capture d’écran de l’onglet photomanipulation dans la fenêtre de discussion décrivant les paramètres laser spécifiques nécessaires pour photoconversion. Laserstack puissance est 2. Taille du double-clic est 4. Taille de bloc Raster est 1. Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Avancée des paramètres Laser Photoconversion. Capture d’écran des paramètres laser de pointe dans la fenêtre de capture. Cela ouvre la fenêtre de préférences de capture avec l’onglet photomanipulation. Les répétitions de double-clic est définie sur 2. Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Imagerie des paramètres avant la Conversion. Captures d’écran des fenêtres focus et la capture. Met en évidence les paramètres spécifiques de fenêtre de capture nécessaires pour l’imagerie avant la conversion. La capture est « Poisson Imaging. » La 3D est cochée sous le type de capture. Et les paramètres de capture 3D sont spécifiés comme ; Se situe entre 35, nombre d’avions est 36, taille d’étape est 1 et Offset est de -15. Les cases « "gamme autour de courant » et « position actuelle » sont également sélectionnés. Voir les cases rouges. Décrit comment sélectionner un ou plusieurs points sur la fenêtre de capture (à gauche) et comment sélectionner des points individuels sur la fenêtre de discussion (à droite). Voir les cases vertes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Ouverture de la fenêtre de Photoconversion. Capture d’écran illustrant le type de capture timelapse est sélectionnée conformément aux paramètres définis précédemment. Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Mise en place de la Photoconversion. Capture d’écran montrant l’emplacement de l’outil cercle (en haut) et la fenêtre de contrôle de capture qui s’affiche (à droite). Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Cellule unique Photoconversion. Capture d’écran illustrant l’utilisation de l’outil de photoconversion circle et le clic droit menu déroulant. L’action de conversion « FRAP de toutes les régions » est située dans le menu déroulant clic droit. Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Paramètres c561Laser post-Photoconversion. Capture d’écran de la fenêtre de capture montrant les paramètres spécifiques au laser c561. L’exposition est Mme 500 puissance du Laser est de 10. Intensifier est 75. Voir les cases rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Cellule unique Photoconversion. (A). schématiques et confocale z-projections du poisson-zèbre de Tg(sox10:eos) à 48 hpf montrant les ganglions rachidiens dans le système nerveux périphérique avant photoconversion. Ligne pointillée indique l’emplacement approximatif de l’entrée de la moelle épinière DRG... B. schématiques et confocale z-projections du poisson-zèbre de Tg(sox10:eos) à 48 hpf montrant les ganglions rachidiens dans le système nerveux périphérique au cours de la photoconversion. Ligne pointillée indique entrée de moelle épinière DRG. Cercle jaune indique le site de conversion et foudre exposition aux rayons ultraviolets. C. schématiques et confocale z-projections du poisson-zèbre de Tg(sox10:eos) à 48 hpf montrant les ganglions rachidiens dans le système nerveux périphérique post-photoconversion. Ligne pointillée indique entrée de moelle épinière DRG. CNS est une abréviation pour le système nerveux central et PNS est l’abréviation de (A-C) du système nerveux périphérique. Barre d’échelle est égale à 10 um. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : Procédure de Photoconversion dans une grande région de la moelle épinière. (A). schématiques et confocale z-projections du poisson-zèbre de Tg(sox10:eos) à 48 montrant hpf OPCs et ganglions des racines dorsales dans la région ventrale de la moelle épinière avant photoconversion. Ligne pointillée indique la région dorsale de la moelle épinière. B. schématiques et confocale z-projections du poisson-zèbre de Tg(sox10:eos) à 48 montrant hpf OPCs et ganglions des racines dorsales dans la région ventrale de la moelle épinière au cours de la photoconversion. Une ligne jaune continue indique une zone sélectionnée pour photoconversion. Ligne pointillée indique la région dorsale de la moelle épinière. C. schématiques et confocale z-projections du poisson-zèbre de Tg(sox10:eos) à 48 montrant hpf OPCs et ganglions des racines dorsales dans la région ventrale de la moelle épinière après photoconversion. Les lignes pointillées indiquent la région dorsale de la moelle épinière. Barre d’échelle est égale à 10 um.
Figure 12 : Cellulaire visualisation et suivi post-photoconversion. (A). schématique de Tg(sox10:eos) poisson zèbre la moelle épinière à 48 montrant hpf OPCs et ganglions des racines dorsales dans la région ventrale de la moelle épinière après photoconversion. Éclair indique la conversion de lumière UV. B. Confocal z-projections de Tg(sox10:eos) poisson zèbre la moelle épinière à partir de 48 montrant hpf OPCs et ganglions des racines dorsales dans la région ventrale de la moelle épinière après photoconversion. Éclair indique la conversion de lumière UV. Barre d’échelle est égale à 10 um.
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Discussion
Dans les tissus complexes, différents types de cellules organisent dans des domaines spécifiques. Récemment, des techniques ont été utilisées pour marquer les cellules individuelles au sein de ces tissus de grandes structures1,2,3. Nous démontrons ici deux techniques qui peuvent de même être utilisées pour visualiser les interactions cellulaires unique et interactions entre population de cellules dans les tissus complexes. L’avantage de la technique de photoconversion est le contrôle spatial, que le scientifique a pour marquer nettement une cellule. Avec un microscope qui a la possibilité d’exposer plus petite imagerie des zones au sein de la plus grande fenêtre d’imagerie, aussi petites comme les cellules individuelles ou des zones de cellules individuelles peuvent être étiquetés différemment des autres cellules. Plusieurs protéines et ont maintenant été introduites à la Communauté, ce qui en fait un plus répandue technique7. Avec la possibilité de photoconvert des protéines dans les cellules, les scientifiques ont utilisé cette technique ou des approches similaires pour enquêter sur la migration cellulaire, différenciation cellulaire et l’analyse de circuits neuronaux.
Bien que le logiciel et les paramètres spécifiques laser sont spécifiques à notre laboratoire, cet article démontre la capacité universelle à utiliser la protéine photoconvertable Eos pour distinguer les cellules individuelles au sein d’un ganglion. Malheureusement, la plupart génétiques régions régulatrices qui peuvent être utilisées pour piloter des protéines fluorescentes express largement dans les ganglions au cours des premières phases du développement. C’est probablement parce que ces cellules sont générés à partir de pools d’ancêtre similaire et les marqueurs identifient ces progéniteurs États9. Il est donc difficile de visualiser les interactions des cellules individuelles dans les ganglions plues pendant ces stades de développement plus tôt. Les approches ci-contre représente une technique qui peut marquer des cellules individuelles dans un ganglion et donc pourrait servir à disséquer des questions scientifiques sur le développement des ganglions.
Cependant, cette technique de photoconversion n’est pas limitée à des études de développement de ganglions. Par exemple, dans les études de la régénération, photoconversion des conditions avant l’accident peut être utilisée pour déterminer comment spécifiques des cellules dans une réponse de ganglion après une blessure. Ces études peuvent aider à élucider le potentiel ancêtre-comme des cellules spécifiques dans un ganglion. De même, photoconversion de cellules tumorales spécifique et le suivi de ces cellules au fil du temps pourraient révéler des propriétés de cellules individuelles au sein de tumeurs complexes. Cette application de cellule unique photoconversion élargit donc le potentiel de la technique pour faire des découvertes significatives dans la communauté biomédicale.
Cette approche peut marquer aussi sélectivement les cellules dans une région de la moelle épinière. En développement, les cellules migrent souvent des zones de précurseur pour produire des cellules différenciées en emplacements mature11,14. Cartographie de sort à long terme avec la Cre a été efficacement utilisée pour disséquer ces processus. Avec les techniques de la Cre, la résolution spatiale est limitée aux régions génomiques réglementaires qui animent les Cre transcription15. Avec photoconversion, cette résolution spatiale peut être obtenue avec la possibilité de choisir le moment où survient la photoconversion et la résolution temporelle. Donc, à plus court terme sort-cartographie, cette technique de photoconversion présente de nombreux avantages sur le sort de Cre-cartographie. Toutefois, dans les échantillons où la lumière UV ne peut être facilement atteint, comme chez une souris intacte, cette approche photoconversion est peu probable au travail15. En outre, Cre sort-cartographie étiquettes en permanence des cellules permettant la cartographie sort à plus long terme que photoconversion qui perd son étiquette comme la version photoconverted de la protéine se dissipe et nouvelle protéine non converti est produite par la cellule. Néanmoins, selon la question scientifique, photoconversion peut être un outil utile pour le mappage de sort de populations cellulaires.
Bien que seulement deux exemples de l’application de photoconversion sont fournis, de nombreuses études ont démontré son efficacité. Selon la précision spatiale requise, photoconversion peut être effectuée avec accès à une source de lumière UV. Si le désir est d’étiqueter les simples cellules plus avancées d’imagerie comme la microscopie confocale ou deux photons peuvent être nécessaires. Néanmoins, la possibilité de sélectionner la zone à la fois spatiale et temporelle de cellules marquées distinctement des autres cellules au sein d’un tissu intact a fait photoconversion par les rayons UV, une technique puissante pour disséquer les questions biologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire Smith pour leurs commentaires utiles et les conseils de réactif, Sam Connell et Brent Redford de 3i pour mise en service d’imagerie questions et Deborah Bang, Karen Heed et Kay Stewart pour les soins de poisson-zèbre et Bernard Kulemaka. Ce travail a été soutenu par l’Université de Notre Dame, le Elizabeth et Michael Gallagher Family, l’Alfred P. Sloan Foundation, Centre pour la recherche de poisson-zèbre à l’Université de notre-Dame et le Centre des cellules souches et médecine régénérative à l’Université de Notre Dame. Toutes les études animales ont été effectuées dans le respect de l’Université de Notre Dame IACUC au docteur Cody Smith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
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