Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لإظهار كيف يتحقق فوتوكونفيرسيون الخلية من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى مناطق محددة معربا عن البروتين الفلورسنت، ايوس، في الحيوانات الحية.
Abstract
الأنسجة الحيوانية والنباتية تتكون من السكان متميزة من الخلايا. هذه الخلايا تتفاعل مع مرور الوقت لبناء وصيانة الأنسجة، ويمكن أن يسبب المرض عندما تعطلت. وقد طور العلماء تقنيات ذكية للتحقيق في الخصائص والديناميات الطبيعية من هذه الخلايا داخل أنسجة سليمة بالإعراب عن البروتينات الفلورية في مجموعات فرعية خلايا. ومع ذلك، في بعض الأحيان، تتطلب تجارب أكثر التصور المحدد من الخلايا داخل الأنسجة، أحياناً في طريقة وحيدة الخلية أو السكان من الخلايا. لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لخلايا مفردة ضمن عدد خلايا، وقد استخدمت العلماء فوتوكونفيرسيون خلية واحدة من البروتينات الفلورية. وللتدليل على هذا الأسلوب، نعرض هنا كيفية توجيه الأشعة فوق البنفسجية إلى خلية ايوس-الإعراب عن اهتمامها حالها، تعيش الزرد. ثم أننا صورة تلك الخلايا ايوس+ فوتوكونفيرتيد 24 ساعة في وقت لاحق لتحديد كيف غيروا في الأنسجة. يمكننا وصف تقنيات اثنين: واحد فوتوكونفيرسيون الخلايا وفوتوكونفيرسيونس من سكان خلية. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصور التفاعلات خلية خلية، والخلية-مصير والتمايز، والهجرات الخلية، مما يجعل من أسلوب الذي يطبق في العديد من الأسئلة البيولوجية.
Introduction
تتفاعل عدة خلايا متميزة لبناء وصيانة الأنسجة الحيوانية والنباتية المعقدة. غالباً ما تكون هذه الخلايا المقحم وصعوبة التمييز بين الدول المجاورة على مستوى خلية واحدة دون الفحص المجهري عالية الدقة التي تتطلب تثبيت أنسجة. بيد نفهم كيف أن هذه النماذج الأنسجة، والحفاظ على، وتصبح المريضة، لقد كان ضرورية للتحقيق في كيفية وحيدة الخلايا داخل الأنسجة تتفاعل مع مرور الوقت. ومن الناحية المثالية، تتطلب هذه التجارب تسمية الخلايا المفردة داخل أنسجة بطريقة غير الغازية دون الشرط للتثبيت. وقد طور العلماء الآن العديد من التقنيات لإنجاز هذه المهمة1،2،،من34.
اكتشاف والتنفيذ للبروتين قنديل أخضر نيون (بروتينات فلورية خضراء) هو أحد النهج مثيرة يسمح بوصفها خلايا متميزة في بيئة أنسجة1. استخدام المروجين خلية على حدة، من الممكن تحديد مجموعة فرعية خلايا المسماة1وراثيا. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تستخدم التعبير المستحث الفيروسية للتجارة والنقل للتعبير المستخدم المحدد من بروتينات فلورية خضراء3،4. على الرغم من أن مفيدة للغاية، التعبير وساطة الوراثية للتجارة والنقل لا يسمح بالتعبير المستخدم المحدد ضمن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة؛ والفيروسية للتجارة والنقل، على الرغم من أن ميزة، يمكن أن يكون التعبير الغازية. مع ظهور مشتقات التجارة والنقل وتقنيات ذكية مثل برينبوو للتعبير عن البروتينات الفلورية متميزة أكثر قليلة داخل الأنسجة، فقد أصبح من الممكن تصور الخلايا المفردة والتفاعلات فيما بينها في نسيج معقد2، 5-ومع ذلك، هذه النهج تسمية الخلايا بطريقة عشوائية. إذا التجربة المرجوة يتطلب تصور خلية مفردة أو السكان من الخلايا التي يتم تعريفها بالمجرب، لذلك محدودة. مع مثل هذه التجارب، وأنه سيكون من المفيد أن يكون بروتين فلوري أعرب وراثيا التي يمكن التلاعب بها للتمييز، بطريقة وحيدة خلية، فمن الخلايا الفلورسنت وغير الفلورية الأخرى.
لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لبيولوجيا الخلية من الخلايا المفردة داخل أنسجة حية معقدة، يستخدم المجتمع العلمي فوتوكونفيرسيون خلية مفردة متميزة من البروتينات الفلورية6،،من78. استخدام جينياً الخاضعة للتعبير عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي (أي eos، كايد، إلخ) بالانتقال من أخضر إلى الأحمر الدولة الفلورسنت عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية (488 نانومتر) الخفيفة، يمكننا أن نميز خلية واحدة من به المسمى فلوريسسينتلي الجيران6،،من78. وهذا النهج يستخدم جهاز يلحق بنا مجهر [كنفوكل] الذي يمكن توجيه الضوء من كدسة ليزر لمنطقة حيود محدودة الفائدة. مع هذا الأسلوب، ونحن أما تسمية الخلايا المفردة أو عدد أكبر من السكان في طريقة المعرفة من قبل المستخدم10،،من911. هذا الأسلوب مينيملي مقارنة بحقن خلية مفردة من الفيروسية بروتينات فلورية خضراء. كدليل على المفهوم، نظهر أننا يمكن فوتوكونفيرت الخلايا المفردة داخل العقدة في الجهاز العصبي المحيطي وعدد أكبر من السكان فوتوكونفيرت مثل الخلايا الموجودة في الجانب البطني الحبل الشوكي9،10، 11،12. أننا ثم تصور هذه فوتوكونفيرتيد خلية السكان 24 ساعة في وقت لاحق إلى التبصر في حركتهم والتمايز أثناء التطوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافقت جامعة Notre Dame الرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع الدراسات الحيوانية.
1-إعداد العينات الزرد
- ضع ذكر بالغ واحد وواحد تيراغرام الإناث الكبار (بروتين القابلة للتحويل) إلى غرفة التزاوج كل الإجراءات القياسية13. في هذه المخطوطة، استخدم Tg(sox10:eos) الأسماك9 بسبب الوصول ولكن الخطوط الأخرى المعدلة وراثيا مع البروتين فوتوكونفيرتيبلي يمكن استخدامها على قدم المساواة. قم بإعداد غرفة واحدة أو أكثر في حال لم تضع الأسماك. السماح للأسماك بالبقاء في الدائرة بين عشية وضحاها.
- في صباح اليوم التالي، جمع البيض في أطباق بتري 100 مم. تسمح البيض الناضجة للاخصاب بعد 24 ساعة (hpf) قبل الفحص.
- إذا كانت الحيوانات أعلاه heterozygotes للتحوير، الشاشة 24 هبف الأطباق للأجنة Tg(sox10:eos) + مع 488 نانومتر مصدر الضوء وبروتينات فلورية خضراء تصفية مجموعات في مجهر تشريح. عزل Tg(sox10:eos) + الأجنة والسماح لتنضج إلى 48 هبف.
- ديتشوريوناتي الأجنة يدوياً باستخدام إبرة أو الملقط.
- إعداد والموجات الدقيقة 5 مل من 0.8% الحل [اغروس] نقطة انصهار منخفضة.
- مرة واحدة [اغروس] باردة إلى اللمس، ضع تيراغرام 3-4 أنيسثيتيزيد (sox10:eos) + 48 السمك هبف في وسط زجاج 10 مم-ساترة أسفل طبق بيتري.
- إضافة [اغروس] ما يكفي لتغطية سطح ساترة، حوالي 1 مل. استخدام إبرة مسبار لترتيب السمك على الجانبين. يسمح [اغروس] ترسيخ لضمان متصاعدة حيوانات. قد يكون من الضروري باستمرار إعادة ترتيب الزرد حتى أجار يتصلب14. ويأخذ التجميد حوالي 2 دقيقة.
- بعد وقد توطد [اغروس] لمدة 2 دقيقة، ببطء إضافة المتوسطة الجنين الذي يحتوي على إستر حامض امينوبنزويك 0.02 في المائة (تريكيني) لطبق حتى هي مغمورة السطح السفلي لاجار وطبق. وهذا ينبغي أن يكون حوالي 3 مل.
2-المجهر التركيب والتحويل قبل التصوير
- افتح برنامج [كنفوكل] وحدد windows التقاط والتركيز [الشكل 1]. إطار التقاط نافذة، حدد إعداد التحويل الخاصة بمختبر التصوير تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة علامة التبويب [الشكل 1]. هنا، والإعداد الخاصة بمختبر يسمى "التصوير الأسماك".
- ضع العينة على نطاق [كنفوكل] ويجلب إلى التركيز باستخدام مسار والمقابض التكيف غرامة.
- فتح إطار التركيز وتحديد المنطقة المطلوب للفائدة (أي العقد الجذرية الظهرية).
- حدد الليزر c488 ضمن القائمة "تعيين عامل التصفية". ضبط التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 300 والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2].
- تحقق من مربع 3D تحت المقطع التقاط نوع . في المقطع التقاط 3D ، حدد استخدام الموقف الحالي والتحقق من النطاق حول الحالية. في نفس القسم، تعيين النطاق إلى 35، عدد الطائرات إلى 36، وحجم الخطوة 1. يمكن زيادة النطاق أو إنقاصه لاستيعاب لعمق منطقة التصوير. للحبل الشوكي هو قيمة تتراوح بين 35-40 مكدسات عادة كافية [الشكل 5].
- تحديد الموقع الحالي [الشكل 5].
- انقر فوق ابدأ في الجزء السفلي من إطار التقاط للحصول على الصورة.
3-خلية واحدة فوتوكونفيرسيون
- افتح برنامج [كنفوكل] وحدد windows التقاط والتركيز [الشكل 1]. إطار التقاط نافذة، حدد إعداد التحويل الخاصة بمختبر التصوير تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة علامة التبويب [الشكل 1]. هنا، والإعداد الخاصة بمختبر يسمى "الأسماك يجتذ رقاقة كاملة".
- حدد الليزر c488 و c541 تحت قائمة "تعيين عامل التصفية". إذا لم تكن تستخدم نفس البرمجيات المجهر، العثور على القائمة لتحديد أشعة الليزر المختلفة وحدد 488 نانومتر و 541 نانومتر الليزر. ضبط التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 300 والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2]. يتم تحديد هذه الإعدادات الليزر استناداً إلى إنتاج ما يكفي من الإشارات الفلورسنت دون التسبب في فوتوبليتشينج أو سمية. إذا كان هو تصور سمية أو فوتوبليتشينج، تقليل قوة الليزر أو التعرض.
- فتح إطار التركيز، وانقر فوق علامة التبويب photomanipulation في إطار التركيز. ضبط معلمات الليزر تبعاً لذلك. تغيير السلطة المكدس الليزر إلى 2 ومن ثم انقر فوق انتقال. تغيير حجم الكتلة النقطية إلى 1، ثم انقر فوق تعيين. قم بتغيير حجم انقر نقراً مزدوجاً فوق إلى 4. قم بتغيير السطر الليزر إلى v405 [الشكل 3].
- فتح إعدادات التقاط متقدمة في إطار الالتقاط. حدد علامة التبويب photomanipulation وتغيير التكرار انقر نقراً مزدوجاً فوق 2. انقر فوق "موافق" [الشكل 4].
- حدد علامة التبويب تخطيط س وص في إطار التركيز. الاختيار مزدوج المعلمات الليزر من الخطوة 2 في علامة التبويب photomanipulation [الشكل 3، الشكل 4]. تعيين إعدادات الليزر فوتوكونفيرت خلية الفائدة دون فوتوكونفيرسيون للخلايا المحيطة.
- في حالة وجود فوتوكونفيرسيون خلايا المجاورة، تقليل قوة الليزر. إذا لم يحدث فوتوكونفيرسيون خلايا، يمكن زيادة صلاحيات الليزر. على النحو الأمثل، تعيين السلطة الليزر فوتوكونفيرت المنطقة الفائدة والمناطق المحيطة بها وليس فقط.
- تحقق من مربع timelapse إطار التقاط نوع. ثم، انقر فوق بدء تشغيل [الشكل 6A].
- بمجرد فتح إطار timelapse حية، حدد أداة الدائرة على شريط الأدوات أعلى [الرقم 7]
- رسم دائرة في منطقة سينتيرموست في الخلية. الحق فوق دائرة مرسومة وحدد المنطقة فراب، وانتظر لمدة 3 ثوان. المساحة المحددة ينبغي أن تصبح باهتة [الشكل 8]. انقر فوق التوقف عن الالتقاط.
- إذا كان التصوير أكثر من الحيوان، والعودة إلى علامة التبويب تخطيط س وص في قائمة التركيز وتحديد موقف 2. ثم، كرر الخطوات 4، 1-4.6.
- لتحويل عدد خلايا، اتبع معايير البروتوكول والليزر للخطوات 4، 4، 1-4 باستثناء بدلاً من رسم دائرة اربط منطقة الفائدة، استخدم أداة سطر. رسم خط في منطقة اهتمام واربط المنطقة باستخدام نفس المعلمات المذكورة أعلاه.
4-وظيفة-فوتوكونفيرسيون التصوير
- بمجرد كافة النقاط فوتوكونفيرتيد. حدد المكدس الصورة القياسية الخاصة بمختبر الإعداد الموصوفة في بريكوفيرسيون التصوير في الخطوة 3. هذا ويوجد تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة في علامة التبويب في نافذة التقاط [الشكل 5].
- حدد الليزر c488 وضبط التعرض إلى 300ms والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2].
- حدد الليزر c541 وجدت تحت نفس القائمة كالليزر c488. ضبط التعرض إلى 500 مللي والليزر الطاقة إلى 10، وتكثيف إلى 75 [الرقم 9].
- تحقق من مربع 3D تحت المقطع التقاط نوع . في المقطع التقاط 3D ، حدد استخدام الموقف الحالي والتحقق من النطاق حول الحالية. في نفس القسم، تعيين النطاق إلى 35، عدد الطائرات إلى 36، وحجم الخطوة 1. عدد النطاق قد زيادة أو إنقاص لاستيعاب عمق التصوير المطلوب [الشكل 5].
- إذا كانت هناك نقاط متعددة في علامة التبويب التركيز XY، حدد خيار قائمة متعددة في إطار الالتقاط. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بتحديد الموقع الحالي.
- انقر فوق ابدأ في الجزء السفلي من إطار التقاط للحصول على الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام فوتوكونفيرسيون للبروتينات الفلورية لتسمية خلايا مميزة داخل أنسجة6. وللتدليل على ذلك، استخدمت Tg(sox10:eos) الأسماك9 للتعبير عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي Eos تحت تسلسل sox10التنظيمية. كانت الحيوانات Tg(sox10:eos) في 48 هبف شنت أول ومن ثم تصويرها للكشف عن أي فوتوكونفيرسيون غير محددة قد تكون وقعت. تصور Eos إشارة الفلورية غير المحولة مع القليل ايوس فوتوكونفيرتيد إشارة نيون آنذاك (الشكل 10). وأبقى في الظلام لضمان فوتوكونفيرسيون غير محدد الحد الأدنى للحيوانات. ثم تعرضت لضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مجهر [كنفوكل] الإنشاء مناطق الاهتمام. للتأكد من أن الخلايا المفردة فوتوكونفيرتيد نتيجة التعرض للأشعة فوق البنفسجية، أخذنا z-رزمة منطقة تمتد من منطقة فوتوكونفيرتيد. تمشيا مع فوتوكونفيرسيون ناجحة، وكان هناك كشف القليل من غير تحويل ايوس خارج المنطقة لمصلحة وفوتوكونفيرتيد Eos حضر واضح داخل منطقة الفائدة. وتوضح الصورة الناتجة خلية واحدة ضمن العقدة المسماة بالتأكيد من جيرانه (الشكل 10).
وللتدليل على فائدة هذا الأسلوب فوتوكونفيرسيون، تعرضت أيضا أن خلايا للأشعة فوق البنفسجية. في هذا النموذج، وأخذ الصور قبل فوتوكونفيرسيون ولا توجد إشارة ايوس فوتوكونفيرتيد الأمم المتحدة الحالية. المقبل، تعرضت في الجانب البطني من النخاع الشوكي للأشعة فوق البنفسجية باستخدام خط (الشكل 11). لتأكيد نجاح فوتوكونفيرسيون، أخذت صور بوست-فوتوكونفيرسيون وفوتوكونفيرتيد ايوس في خلايا النخاع الشوكي البطني في موقع سطر الفائدة التي يمكننا لفت كانت تصور (الشكل 11). وكان ايوس فوتوكونفيرتيد عدم إشارة مرئية في جميع المجالات الأخرى. لتوسيع هذا الأسلوب ثم أخذنا الصور متطابقة 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون. في هذه الصور، وخلايا ايوس+ فوتوكونفيرتيد شوهدت متناثرة في جميع أنحاء منطقة الحبل الشوكي في مواقع كل الظهري والبطني (الشكل 12). وتتسق هذه البيانات مع الفرضية القائلة بأن نقل خلايا العمود الفقري البطني إلى مواقع الظهرية كما سبق وصف10. معا هذه التقنيات اثنين تثبت أن فوتوكونفيرسيون من ايوس يمكن استخدامها لتمثيل الخلايا المفردة أو السكان من الخلايا داخل منطقة أنسجة بطريقة المعرفة من قبل المستخدم. قد أسهم هذا إلى فهم أفضل للخصائص الخلوية مثل الهجرة الخلية، والاتصال، وديناميات.
الشكل 1 : التقاط وتركز Windows. لقطة لشاشة البرمجيات التي تصور موقع windows التقاط والتركيز ومختبر محددة "يجتذ شريحة كاملة من الأسماك" المنسدلة علامة التبويب. انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : "معلمات الليزر" c488- لقطة شاشة لالتقاط نافذة عرض معلمات محددة لليزر c488. التعرض السيدة 300 طاقة الليزر هو 5. تكثيف هو 75. انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : معلمات الليزر فوتوكونفيرسيون- لقطة شاشة من علامة التبويب photomanipulation في إطار التركيز تحدد إعدادات محددة الليزر اللازمة فوتوكونفيرسيون. السلطة لاسيرستاك هو 2. انقر نقراً مزدوجاً فوق حجم هو 4. حجم كتلة النقطية هو 1. انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : متقدم معلمات الليزر فوتوكونفيرسيون- لقطة شاشة الإعدادات المتقدمة الليزر في التقاط نافذة. وهذا يفتح نافذة تفضيلات الالتقاط مع علامة التبويب photomanipulation. التكرار انقر نقراً مزدوجاً فوق تعيين إلى 2. انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تحويل قبل التصوير المعلمات. لقطات ويندوز التركيز والتقاط. ويسلط الضوء على التقاط نافذة المعلمات المحددة اللازمة لتصوير ما قبل التحويل. إعداد الالتقاط هو "تصوير الأسماك". يتم فحص مربع ثلاثي الأبعاد تحت نوع الالتقاط. ويتم تحديد إعدادات التقاط ثلاثي الأبعاد ك؛ النطاق هو 35 و "عدد من الطائرات" هو 36، وهو "حجم الخطوة" 1 وهو إزاحة-15. كما يتم تحديد "الوضع الحالي" ومربعات "تتراوح حول الحالية". انظر مربعات حمراء. يصف كيفية تحديد نقاط مفرد أو متعدد في التقاط نافذة (يسار)، وكيفية تحديد نقاط منفردة في إطار التركيز (على اليمين). انظر مربعات خضراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : فتح نافذة فوتوكونفيرسيون. يتم تحديد الصورة التي تصور نوع الالتقاط timelapse وفقا للمعايير المحددة مسبقاً. انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : إعداد فوتوكونفيرسيون- لقطة شاشة عرض موقع أداة الدائرة (أعلى) ومراقبة التقاط النافذة التي تظهر (على اليمين). انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : فوتوكونفيرسيون خلية واحدة- لقطة للشاشة التي تصور استخدام الأداة فوتوكونفيرسيون الدائرة وحق انقر القائمة المنسدلة. عمل تحويل "اربط جميع المناطق" يقع داخل القائمة المنسدلة فوق الحق. انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 9 : معلمات c561Laser بوست-فوتوكونفيرسيون- لقطة شاشة لالتقاط نافذة عرض معلمات محددة لليزر c561. التعرض السيدة 500 السلطة الليزر هو 10. تكثيف هو 75. انظر مربعات حمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 10 : فوتوكونفيرسيون خلية واحدة- (أ)-z التخطيطي و [كنفوكل]-إسقاطات الزرد Tg(sox10:eos) في العقد الجذرية الظهرية إظهار هبف 48 في الجهاز العصبي المحيطي قبل فوتوكونفيرسيون. خط متقطع بشرط يشير إلى الموقع التقريبي لدخول النخاع الشوكي الرسم... (ب)-z التخطيطي و [كنفوكل]-إسقاطات الزرد Tg(sox10:eos) في العقد الجذرية الظهرية إظهار هبف 48 في الجهاز العصبي المحيطي أثناء فوتوكونفيرسيون. خط متقطع بشرط يشير إلى دخول النخاع الشوكي DRG. دائرة صفراء إلى موقع التحويل والترباس الإضاءة تشير إلى التعرض للضوء للأشعة فوق البنفسجية. (ج)-z التخطيطي و [كنفوكل]-إسقاطات الزرد Tg(sox10:eos) في العقد الجذرية الظهرية إظهار هبف 48 في الجهاز العصبي المحيطي بوست-فوتوكونفيرسيون. خط متقطع بشرط يشير إلى دخول النخاع الشوكي DRG. الجهاز العصبي المركزي اختصار للجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي اختصار للجهاز العصبي المحيطي (أ-ج). شريط مقياس يساوي 10 أم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 11 : فوتوكونفيرسيون الداخلي في منطقة حبل الشوكي أكبر. (أ)-z التخطيطي و [كنفوكل]-إسقاطات الزرد Tg(sox10:eos) في 48 إظهار هبف المعاونة والعقد الجذرية الظهرية في منطقة البطني في الحبل الشوكي قبل فوتوكونفيرسيون. خط متقطع بشرط يشير إلى المنطقة الظهرية للنخاع الشوكي. (ب)-z التخطيطي و [كنفوكل]-إسقاطات الزرد Tg(sox10:eos) في 48 إظهار هبف المعاونة والعقد الجذرية الظهرية في منطقة البطني في الحبل الشوكي أثناء فوتوكونفيرسيون. يشير الخط الأصفر الخالص إلى المنطقة المحددة فوتوكونفيرسيون. خط متقطع بشرط يشير إلى المنطقة الظهرية للنخاع الشوكي. (ج)-z التخطيطي و [كنفوكل]-إسقاطات الزرد Tg(sox10:eos) في 48 إظهار هبف المعاونة والعقد الجذرية الظهرية في منطقة البطني في الحبل الشوكي بعد فوتوكونفيرسيون. تشير الخطوط المتقطعة إلى المنطقة الظهرية للنخاع الشوكي. شريط مقياس يساوي 10 أم.
الرقم 12 : فوتوكونفيرسيون وظيفة التتبع والتصور الخلوية. (أ)-التخطيطي Tg(sox10:eos) الحبل الشوكي الزرد في 48 إظهار هبف المعاونة والعقد الجذرية الظهرية في منطقة البطني في الحبل الشوكي بعد فوتوكونفيرسيون. صاعقة يشير إلى تحويل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. (ب)-z [كنفوكل]-إسقاطات الحبل الشوكي الزرد Tg(sox10:eos) ابتداء من الساعة 48 إظهار هبف المعاونة والعقد الجذرية الظهرية في منطقة البطني في الحبل الشوكي بعد فوتوكونفيرسيون. صاعقة يشير إلى تحويل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. شريط مقياس يساوي 10 أم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الأنسجة المعقدة، تنظيم أنواع الخلايا متميزة في مجالات محددة. واستخدمت تقنيات مؤخرا إلى تسمية الخلايا الفردية داخل هذه الأنسجة الكبيرة هياكل1،،من23. هنا نظهر اثنين من التقنيات التي يمكن استخدامها كذلك لتصور التفاعلات وحيد الخلية والخلية السكان التفاعلات داخل أنسجة معقدة. وميزة هذا الأسلوب فوتوكونفيرسيون هو عنصر التحكم المكانية الباحث بوضوح تسمية خلية. مع مجهر الذي لديه القدرة على كشف أصغر التصوير مناطق ضمن إطار التصوير أكبر، مناطق صغيرة كما يمكن المسمى خلايا مفردة أو المناطق من الخلايا المفردة بشكل مختلف عن الخلايا الأخرى. وقد أدخلت عدة فوتوكونفيرتيبلي البروتينات الآن للمجتمع مما يجعل هذا أسلوب أكثر انتشارا7. مع القدرة على فوتوكونفيرت البروتينات داخل الخلايا، وقد استخدمت العلماء هذا الأسلوب أو النهج المشابهة للتحقيق في الهجرة الخلية، والخلية التمايز وتحليل الدوائر العصبية.
على الرغم من أن البرامج والمعلمات الليزر محددة محددة لدينا مختبر، يوضح هذا المقال العالمي القدرة على استخدام البروتين فوتوكونفيرتابل ايوس في تمييز الخلايا المفردة داخل العقدة. لسوء الحظ، معظم الوراثية التنظيمية المناطق التي يمكن استخدامها لمحرك البروتينات الفلورية صريحة على نطاق واسع داخل ganglia في مراحل النمو المبكرة. هذا المرجح لأن يتم إنشاء هذه الخلايا من تجمعات مماثلة في السلف، والتعرف على علامات تلك الدول السلف9. ولذلك من الصعب تصور التفاعلات بين الخلايا المفردة داخل ganglia أكبر خلال هذه المراحل الإنمائية في وقت سابق. وتمثل النهج المبين هنا إحدى التقنيات التي يمكن تسمية الخلايا الفردية داخل العقدة و وبالتالي يمكن أن تستخدم في تشريح المسائل العلمية حول التنمية ganglia.
ومع ذلك، لا يقتصر هذا الأسلوب فوتوكونفيرسيون لدراسات التنمية ganglia. على سبيل المثال، في الدراسات المتعلقة بالتجديد، يمكن استخدامها فوتوكونفيرسيون لظروف ما قبل الإصابة لتحديد كيفية الخلايا المحددة داخل استجابة العقدة بعد إصابة. يمكن أن تساعد هذه الدراسات توضيح إمكانات السلف مثل خلايا معينة في العقدة. وبالمثل، فوتوكونفيرسيون الخلايا السرطانية محددة، وتتبع تلك الخلايا مع مرور الوقت يمكن أن تكشف عن خصائص الخلايا المفردة داخل الأورام المعقدة. هذا التطبيق من خلية واحدة فوتوكونفيرسيون ولذلك يوسع إمكانات التقنية لجعل الاكتشافات ذات مغزى في مجال الطب الحيوي.
يمكن تسمية هذا النهج أيضا بشكل انتقائي خلايا داخل منطقة الحبل الشوكي. في التنمية، وترحيل الخلايا غالباً من المناطق السلائف لإنتاج خلايا متمايزة في مواقع ناضجة11،14. وقد استخدمت كفاءة تعيين مصير طويلة الأجل مع لجنة المساواة العرقية تشريح مثل هذه العمليات. مع تقنيات لجنة المساواة العرقية، والقرار المكانية المحدودة في المناطق التنظيمية الجينوم التي تدفع Cre النسخ15. مع فوتوكونفيرسيون، ويمكن تحقيق هذا القرار المكانية جنبا إلى جنب مع القدرة على اختيار الوقت عندما يحدث فوتوكونفيرسيون وفي الأزمنة. ولذلك، قد هذا الأسلوب فوتوكونفيرسيون لمصير الأجل أقصر-رسم الخرائط، العديد من المزايا على مصير لجنة المساواة العرقية ورسم الخرائط. ومع ذلك، في عينات فيها الأشعة فوق البنفسجية لا يمكن أن يتحقق بسهولة، مثل ماوس سليمة، هذا النهج فوتوكونفيرسيون المرجح أن تعمل15. بالإضافة إلى ذلك، تسميات مصير لجنة المساواة العرقية ورسم الخرائط بشكل دائم الخلايا تسمح بتعيين مصير طويلة الأجل أكثر مما فوتوكونفيرسيون أن يفقد التسمية الخاصة به كما تبدد الإصدار فوتوكونفيرتيد من البروتين والبروتين غير المحولة الجديدة هي التي تنتجها الخلية. ومع ذلك، اعتماداً على مسألة علمية، فوتوكونفيرسيون يمكن أن يكون أداة مفيدة لرسم الخرائط ذات الصلة-مصير سكان الخلية.
على الرغم من أن تقدم أمثلة اثنين فقط من تطبيق فوتوكونفيرسيون، العديد من الدراسات قد أثبت فعاليته. اعتماداً على الدقة المكانية المطلوبة، يمكن إجراء فوتوكونفيرسيون مع الوصول إلى مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. إذا كانت الرغبة في تسمية واحدة قد يلزم خلايا أكثر تقدما من التصوير مثل الفحص المجهري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون. ومع ذلك، جعلت القدرة على تحديد منطقة المكانية والزمانية للخلايا المسماة واضح من خلايا أخرى داخل أنسجة سليمة المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية فوتوكونفيرسيون تقنية قوية لتشريح المسائل البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر برنارد كوليماكا وأعضاء المختبر سميث لتعليقات مفيدة وتوجيهات الكاشف، سام كونيل وريدفورد برنت من 3i لإيفاد التصوير الأسئلة والدوي ديبورا وتعير كارين ستيوارت كاي للرعاية الزرد. أيده هذا العمل في جامعة نوتردام، أن إليزابيث ومايكل غالاغر الأسرة، ومؤسسة الفريد سلون ص، مركز للبحوث الزرد في جامعة نوتردام ومركز للخلايا الجذعية والطب التجديدي في جامعة نوتردام سيدة. وأجريت جميع الدراسات الحيوانية امتثالا لجامعة نوتردام IACUC للدكتور سميث كودي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
