Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vise, hvordan cellen photoconversion er opnået gennem UV eksponering for specifikke områder at udtrykke de fluorescerende proteiner, Eos, med levende dyr.
Abstract
Dyre- og plantearter væv er sammensat af forskellige populationer af celler. Disse celler interagerer over tid at opbygge og vedligeholde væv og kan forårsage sygdom når forstyrret. Forskere har udviklet smarte teknikker til at undersøge karakteristika og naturlige dynamik i disse celler i intakt væv ved at udtrykke fluorescerende proteiner i delmængder af celler. Dog til tider kræver eksperimenter mere valgte visualisering af celler inden for væv, undertiden på den encellede eller befolkning af celler måde. For at opnå dette og visualisere enkelt celler i en befolkning på celler, har forskere udnyttet encellede photoconversion af fluorescerende proteiner. For at demonstrere denne teknik, viser vi her hvordan direkte UV-lys til et Eos-udtrykker celle af interesse i en intakt, lever zebrafisk. Vi image derefter disse photoconverted Eos+ celler 24 timer senere for at afgøre, hvordan de ændrede i vævet. Vi beskrive to teknik: enkelt celle photoconversion og photoconversions af populationer af celle. Disse teknikker kan bruges til at visualisere celle-celle interaktioner, celle-skæbne og differentiering og celle migrationer, hvilket gør det en teknik, der er gældende i mange biologiske spørgsmål.
Introduction
Flere forskellige celler interagere at opbygge og opretholde komplekse dyre- og plantearter væv. Disse celler er ofte indtrængere og vanskelige at skelne fra naboer på en enkelt celle niveau uden høj opløsning mikroskopi, der kræver fiksering af væv. Men for at forstå, hvordan disse væv form, er fastholdt, og blive syge, det har været nødvendigt at undersøge, hvordan enkelt celler inden for væv interagerer over tid. Ideelt, kræver disse eksperimenter, mærkning af enkelt celler i et væv i en ikke-invasiv måde uden kravet om fiksering. Forskere har nu udviklet mange teknikker til at udføre denne opgave1,2,3,4.
Opdagelsen af og gennemførelse af vandmænd grøn fluorescerende proteiner (NGL) var en spændende tilgang, der er tilladt for mærkning af forskellige celler i en væv miljø1. Via celle-specifikke initiativtagere, er det muligt at genetisk vælge et undersæt af celler, der er mærket1. Alternativt, viral induceret udtryk for normal god landbrugspraksis kan udnyttes til bruger-valgte udtryk for normal god landbrugspraksis3,4. Selvom ganske nyttigt, tillader genetiske medieret udtryk for normal god landbrugspraksis ikke brugervalgte udtryk inden for en delmængde af celler i vævet; og viral udtryk for normal god landbrugspraksis, selv om fordelagtige, kan være invasive. Med fremkomsten af normal god landbrugspraksis derivater og smarte teknikker som Brainbow til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner mere sparsomt i væv, er det blevet muligt at visualisere enkelt celler og interaktioner blandt dem i komplekse væv2, 5. men disse tilgange label celler i en tilfældig måde. Hvis den ønskede eksperiment kræver visualisering af en enkelt celle eller befolkning af celler, der er defineret af eksperimentatoren, er de derfor begrænset. Med sådanne eksperimenter, ville det være en fordel at have en genetisk udtrykt fluorescerende proteiner, der kan manipuleres til at skelne, i en enkelt celle mode, det fra andre fluorescerende og ikke-fluorescerende celler.
For at nå dette mål og Visualiser cellebiologi af enkelt celler i et komplekst levende væv, bruger det videnskabelige samfund enkelt celle photoconversion af forskellige fluorescerende proteiner6,7,8. Ved hjælp af genetisk kontrolleret udtryk for en photoconvertible protein (i.e., eos, kaede, osv.), der overgange fra en grøn til rød fluorescerende tilstand når den udsættes for UV (488 nm) lys, vi kan skelne en enkelt celle fra sin fluorescently mærket naboer6,7,8. Denne metode udnytter et apparat, der er knyttet til vores Konfokal mikroskop, som kan direkte lys fra en laser stak en diffraktion-begrænset region af interesse. Med denne teknik, kan vi enten mærke enkelt celler eller større populationer i en brugerdefineret måde9,10,11. Teknikken er minimalt invasiv sammenlignet med enkelt celle injektioner af viral normal god landbrugspraksis. Som en proof of concept viser vi, at vi kan photoconvert enkelt celler i en ganglion i de perifere nervesystem og photoconvert større befolkningsgrupper, som cellerne ligger på den ventrale side af rygmarven9,10, 11,12. Vi kan derefter visualisere disse photoconverted cellepopulationer 24 timer senere for at få indblik i deres bevægelse og differentiering under udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Notre Dame institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. forberedelse af zebrafisk model
- Placer en voksen mand og en voksen kvinde Tg (konvertible protein) i en parring kammer per standard procedurer13. I dette håndskrift, bruge Tg(sox10:eos) fisk9 på grund af adgang, men andre transgene linjer med photoconvertible protein kan bruges lige så. Oprette mere end ét kammer i tilfælde af fisk ikke fastlægges. Tillad fisk at forblive i salen natten over.
- Den næste morgen, indsamle æg i petriskåle med 100 mm. Tillad æg til at modne til 24 timer efter befrugtning (hpf) før screening.
- Hvis dyr ovenfor var heterozygote for transgenet, filtrere skærmen 24 hpf retter for Tg(sox10:eos) + embryoner med en 488 nm lyskilde og normal god landbrugspraksis sæt på en dissekere mikroskop. Isolere Tg(sox10:eos) + embryoner og lad den modne til 48 hpf.
- Dechorionate embryoner manuelt med en nål eller pincet.
- Forberede og mikrobølgeovn 5 mL af 0,8% lav-smeltende punkt Agarosen løsning.
- Når Agarosen er kølig at røre, placere 3-4 bedøvede Tg (sox10:eos) + 48 hpf fisk i midten af en 10 mm glas-coverslip bund petriskål.
- Tilføje nok Agarosen for at dække overfladen af coverslip, ca. 1 mL. Brug en sonde nål til at arrangere fisk på deres sider. Tillad Agarosen størkne for montering af dyr. Det kan være nødvendigt at konstant re-arrangere zebrafisk indtil agaren størkner14. Størkning tager ca 2 min.
- Efter Agarosen er størknet for 2 min, tilsættes langsomt embryo medium indeholdende 0,02% aminobenzoic syre ester (Tricaine) til parabol indtil bunden overfladen af agaren og parabol er neddykket. Dette bør være ca. 3mL.
2. mikroskop montering og før konvertering Imaging
- Åbn Konfokal software og vælg vinduerne opsamling og fokus [figur 1]. Under opsamling-vindue, skal du vælge indstillingen lab-specifikke konvertering imaging under erobringen oprettelse drop-down under fanen [figur 1]. Her, kaldes lab-specifikke indstilling "fisk Imaging."
- Placer modellen på Konfokal anvendelsesområde og bringe i fokus ved hjælp af kursus og fine justeringsknapperne.
- Åbn vinduet fokus og Find den ønskede region af interesse (dvs. en dorsalrodsganglier).
- Vælg c488 laser under menuen Filter Set. Indstille eksponering til 300 ms, laser power til 5 og intensivere til 75 [figur 2].
- 3D afkrydsningsfeltet under afsnittet fange type . Vælg Brug aktuelle position og kontrollere vifte omkring nuværendei sektionen 3D Capture . Angive intervallet til 35, antallet af fly til 36, og skridt nummer 1 i afsnittet samme. Rækken kan forhøjes eller nedsættes for at tage højde for dybden af det billeddiagnostiske område. Rygmarven er en række værdi mellem 35-40 stakke typisk tilstrækkeligt [figur 5].
- Vælg aktuelle placering [figur 5].
- Klik på start i bunden af vinduet fange at erhverve billedet.
3. enkelt-celle Photoconversion
- Åbn Konfokal software og vælg vinduerne opsamling og fokus [figur 1]. Under opsamling-vindue, skal du vælge indstillingen lab-specifikke konvertering imaging under erobringen oprettelse drop-down under fanen [figur 1]. Her, kaldes lab-specifikke indstilling "Fisk ablate fuld chip."
- Vælg c488, og c541 laseren under menuen Filter Set. Hvis ikke bruger den samme mikroskop software, find menuen at vælge forskellige lasere og vælg 488 nm og 541 nm lasere. Angive engagementer med 300 ms, laser power til 5 og intensivere til 75 [figur 2]. Disse laser indstillinger vælges baseret på at producere nok fluorescerende signal uden at forårsage photobleaching eller toksicitet. Hvis toksicitet eller photobleaching er visualiseret, reducere laser power eller eksponering.
- Åbn vinduet fokus og klik på fanen photomanipulation i vinduet fokus. Justere laser parametre i overensstemmelse hermed. Ændre laser stak magt til 2, og klik derefter på gå. Ændre blokstørrelse Raster til 1 og klik på sæt. Ret størrelsen på Dobbeltklik til 4. Ændre laser linje til v405 [figur 3].
- Åbn avancerede fange indstillinger i vinduet capture. Vælg fanen photomanipulation og ændre Dobbeltklik gentagelser til 2. Klik på OK [figur 4].
- Vælg fanen XY i vinduet fokus. Dobbelt tjek parametrene laser fra trin 2 i fanen photomanipulation [figur 3, figur 4]. Indstil laser indstillinger til photoconvert i cellen af renter uden photoconversion af omkringliggende celler.
- Hvis photoconversion af tilstødende celler er til stede, reducere laser power. Hvis photoconversion af celler ikke opstår, kan laser beføjelser øges. Indstille optimalt, laser power til photoconvert kun region af interesse og ikke omkringliggende områder.
- Afkrydsningsfeltet timelapse under fange type. Klik derefter på Start [figur 6A].
- Når vinduet live timelapse åbner, Vælg værktøjet cirkel på den øverste værktøjslinje [figur 7]
- Tegne en cirkel i regionen Performing i cellen. Højreklik på den tegnede cirkel, Vælg FRAP region, og vent 3 sekunder. Det valgte område bør blive lysdæmper [figur 8]. Klik på stop capture.
- Hvis imaging mere end ét dyr, gå tilbage til fanen XY i fokus menu og vælg position 2. Gentag derefter trin 4.1-4.6.
- For at konvertere en befolkning på celler, Følg protokol og laser parametrene for trin 4.1-4.4 undtagen i stedet for at tegne en cirkel til FRAP region af interesse, skal du bruge stregværktøjet. Tegn en streg på det pågældende område og FRAP regionen ved hjælp af de samme parametre, der er anført ovenfor.
4. post-photoconversion Imaging
- Når alle punkter er photoconverted. Vælg den standard billedstak fra lab-specifikke indstilling beskrevet i precoversion imaging trin 3. Dette er fundet under erobringen indstilling drop ned fane i vinduet capture [figur 5].
- Vælg c488 laser og indstille eksponering til 300ms, laser power til 5 og intensivere til 75 [figur 2].
- Vælg den c541 laser fundet under den samme menu som c488 laser. Indstille eksponering til 500 ms, laser power til 10 og intensivere til 75 [figur 9].
- 3D afkrydsningsfeltet under afsnittet fange type . Vælg Brug aktuelle position og kontrollere vifte omkring nuværende i sektionen 3D Capture . Angive intervallet til 35, antallet af fly til 36, og skridt nummer 1 i afsnittet samme. Række antallet kan forøge eller formindske til at rumme de ønskede imaging dybde [figur 5].
- Hvis der er flere punkter i fokus under fanen XY, markere indstillingen multipoint liste i vinduet capture. Hvis ikke, skal du vælge aktuelle placering.
- Klik på start i bunden af vinduet fange at erhverve billedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photoconversion af fluorescerende proteiner kan bruges til at mærke forskellige celler i en væv6. For at demonstrere dette, blev Tg(sox10:eos) fisk9 brugt til at udtrykke photoconvertible protein Eos under de regulerende sekvenser af sox10. Tg(sox10:eos) dyr på 48 hpf blev først monteret, og derefter afbildet for at afsløre eventuelle ikke-specifikke photoconversion, der kan være opstået. Eos uomvendte fluorescerende signal med lille Eos photoconverted fluorescerende signal blev derefter visualiseres (figur 10). Dyrene blev holdt i mørke til at sikre ikke-specifik photoconversion er minimal. Derefter, regioner af interesse blev udsat for UV-lys ved hjælp af en Konfokal mikroskop set-up. For at bekræfte, at enkelte celler blev photoconverted som følge af UV-eksponering, tog vi z-stakke af det område, der strækker sig over photoconverted regionen. Overensstemmelse med succesfulde photoconversion, der var lidt påvisning af ikke-konverterede Eos uden for det pågældende område og photoconverted Eos var tydeligt tilstede i det pågældende område. Den resulterende billede viser en enkelt celle i en ganglion, der hedder absolut fra sine naboer (figur 10).
For at påvise nytten af denne photoconversion teknik, blev en befolkning af celler også udsat for UV-lys. I dette paradigme, pre-photoconversion billeder er taget og ingen FN-photoconverted Eos signal var til stede. Næste, den ventrale side af rygmarven blev udsat for UV-ved hjælp af en linie (Figur 11). For at bekræfte vellykkede photoconversion, post-photoconversion billeder er taget og photoconverted Eos i ventrale rygmarven celler på placeringen af linje af interesse, at vi trak blev visualiseret (fig. 11). Non-photoconverted Eos signal var synlig på alle andre områder. For at udvide denne teknik tog vi derefter identiske billeder 24 timer efter photoconversion. I disse billeder, blev photoconverted Eos+ celler set spredt ud over hele regionen rygmarven i dorsal og ventral lokaliteter (figur 12). Disse data er i overensstemmelse med den hypotese, at ventrale spinal celler flyttet til dorsale steder som tidligere beskrevet10. Sammen disse to teknikker viser, at photoconversion af Eos kan udnyttes til at visualisere enkelt celler eller populationer af celler i et væv region i en bruger-defineret mode. Dette har bidraget til en bedre forståelse af cellulære karakteristika såsom celle migration, kommunikation og dynamik.
Figur 1 : Fange og fokusere Windows. Skærmbillede af software skildrer opsamling og fokus vinduer og lab specifikke "Fisk ablate fuld chip" drop down under fanen placering. Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : c488 Laser parametre. Screenshot af capture-vinduet viser de specifikke parametre for c488 laser. Eksponering er 300 ms. Laser power er 5. Intensivere er 75. Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Photoconversion Laser parametre. Skærmhentningsbillede af fanen photomanipulation i vinduet fokus skitsere de specifikke laser indstillinger behov for photoconversion. Laserstack magt er 2. Dobbeltklik på størrelse er 4. Raster blokstørrelse er 1. Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Avancerede Photoconversion Laser parametre. Screenshot af avanceret laser indstillinger i vinduet capture. Dette åbner vinduet fange indstillinger med fanen photomanipulation. Dobbeltklik på gentagelser er indstillet til 2. Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Før konvertering Imaging parametre. Screenshots af vinduerne fokus og opsamling. Fremhæver capture vinduet specifikke parametre behov for før konvertering billeddannelse. Capture indstilling er "Fisk Imaging." 3D boksen tjekkes under typen capture. Og 3D-hentningsindstillinger er angivet som; Range er 35, antallet af fly er 36, skridt nummer er 1 og forskydning er -15. Den "nuværende position" og "range omkring aktuelle" kasser er også valgt. Se røde bokse. Skildrer hvordan at vælge én eller flere punkter på vinduet capture (venstre) og vælge enkelte punkter på vinduet fokus (til højre). Se grønne kasser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Åbner vinduet Photoconversion. Screenshot skildrer timelapse capture typen vælges i overensstemmelse med tidligere sæt parametre. Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Opsætning af Photoconversion. Screenshot viser placeringen af værktøjet cirkel (øverst) og fange kontrol vindue, der vises (til højre). Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Én celle Photoconversion. Screenshot skildrer brugen af værktøjet cirkel photoconversion og den lige falde i hak drop down menuen. Handlingen "FRAP alle regioner" konvertering er beliggende i den lige falde i hak drop-down menuen. Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Post-Photoconversion c561Laser parametre. Screenshot af capture-vinduet viser de specifikke parametre for c561 laser. Eksponering er 500 ms. Laser power er 10. Intensivere er 75. Se røde bokse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 : Én celle Photoconversion. A. skematisk og konfokal z-fremskrivninger af Tg(sox10:eos) zebrafisk på 48 hpf viser dorsalrodsganglier i det perifere nervesystem før photoconversion. Stiplet linje angiver omtrentlig placering af DRG rygmarven post... B. skematisk og konfokal z-fremskrivninger af Tg(sox10:eos) zebrafisk på 48 hpf viser dorsalrodsganglier i det perifere nervesystem under photoconversion. Stiplet linje angiver DRG rygmarven post. Gul cirkel angiver konvertering hjemmeside og belysning bolt angiver UV-lys eksponering. C. skematisk og konfokal z-fremskrivninger af Tg(sox10:eos) zebrafisk på 48 hpf viser dorsalrodsganglier i det perifere nervesystem post-photoconversion. Stiplet linje angiver DRG rygmarven post. CNS er en forkortelse for centralnervesystemet og PNS er en forkortelse for perifere nervesystem (A-C). Skalalinjen er lig med 10 um. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11 : Photoconversion procedure i et større område, rygmarven. A. skematisk og konfokal z-fremskrivninger af Tg(sox10:eos) zebrafisk på 48 hpf viser OPCs og dorsalrodsganglier ventrale omkring rygmarven før photoconversion. Stiplet linje angiver dorsale område af rygmarven. B. skematisk og konfokal z-fremskrivninger af Tg(sox10:eos) zebrafisk på 48 hpf viser OPCs og dorsalrodsganglier ventrale omkring rygmarven under photoconversion. Solid gul linje angiver valgte område for photoconversion. Stiplet linje angiver dorsale område af rygmarven. C. skematisk og konfokal z-fremskrivninger af Tg(sox10:eos) zebrafisk på 48 hpf viser OPCs og dorsalrodsganglier ventrale omkring rygmarven efter photoconversion. Stiplede linjer angiver dorsale område af rygmarven. Skalalinjen er lig med 10 um.
Figur 12 : Cellulære tracking og visualisering post-photoconversion. A. skematisk Tg(sox10:eos) zebrafisk rygmarv på 48 hpf viser OPCs og dorsalrodsganglier ventrale omkring rygmarven efter photoconversion. Lyn angiver UV lys konvertering. B. Konfokal z-fremskrivninger af Tg(sox10:eos) zebrafisk rygmarv begynder på 48 hpf viser OPCs og dorsalrodsganglier ventrale omkring rygmarven efter photoconversion. Lyn angiver UV lys konvertering. Skalalinjen er lig med 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I komplekse væv organisere særskilt celletyper i bestemte domæner. Seneste har teknikker været udnyttet til etiketten individuelle celler inden for disse store væv strukturer1,2,3. Her viser vi to teknikker, der kan ligeledes udnyttes til at visualisere både enkelt celle interaktioner og celle befolkning interaktioner i komplekse væv. Fordelen ved photoconversion teknikken er fysisk kontrol videnskabsmanden har tydeligt mærke en celle. Med et mikroskop, der har evnen til at udsætte mindre imaging områder inden for vinduet større imaging områder så lille som enkelt celler eller områder af enkelt celler kan mærkes anderledes end andre celler. Flere photoconvertible proteiner er nu blevet indført til Fællesskabet, hvorved dette en mere udbredt teknik7. Med mulighed for at photoconvert proteiner i cellerne, har forskere udnyttet denne teknik eller lignende metoder til at undersøge celle migration, Celledifferentiering og neurale kredsløb analyse.
Selvom software og særlige laser parametrene er specifikke for vores lab, demonstreres i denne artikel universal evnen til at bruge photoconvertable protein Eos skelne enkelt celler i en ganglion. Desværre, de fleste genetiske regulerende regioner, der kan bruges til at drive fluorescerende proteiner udtrykkelige bredt indenfor ganglier på tidlige udviklingsmæssige faser. Dette er sandsynligvis, fordi disse celler er genereret fra samme Stamform puljer og markører identificere disse stamfader stater9. Det er derfor svært at visualisere interaktioner af enkelt celler inden for de større ganglier under disse tidligere udviklingsstadier. Metoderne vist her repræsenterer en teknik, der kan mærke individuelle celler i et ganglion og således kunne bruges til at dissekere videnskabelige spørgsmål om ganglier udvikling.
Denne photoconversion teknik er imidlertid ikke begrænset til undersøgelser af ganglier udvikling. For eksempel, i undersøgelser af regenerering, kan photoconversion før skade betingelser udnyttes til at bestemme, hvordan specifikke celler i en ganglion reagere efter skade. Disse undersøgelser kan bidrage til at belyse stamfader-lignende potentialet i bestemte celler i en ganglion. Tilsvarende kunne photoconversion af specifikke tumorceller og sporing af disse celler med tiden afsløre egenskaber af enkelt celler inden for komplekse tumorer. Denne anvendelse af enkelt celle photoconversion udvider derfor potentiale af teknikken at gøre meningsfuld opdagelser i biomedicinsk Fællesskabet.
Denne tilgang kan også selektivt mærke celler i et område af rygmarven. I udvikling vandrer celler ofte fra forløber områder til at producere differentierede celler i modne steder11,14. Langsigtet skæbne kortlægning med Cre er effektivt blevet udnyttet til at dissekere sådanne processer. Med Cre teknikker er rumlige opløsning begrænset til de genomiske lovgivningsmæssige områder, der drive Cre transskription15. Med photoconversion, kan denne rumlige opløsning opnås sammen med evnen til at vælge den tid, når photoconversion der opstår og den tidsmæssige opløsning. Derfor, for kortere sigt skæbne-mapping, denne photoconversion teknik har mange fordele i forhold til Cre skæbne-kortlægning. I prøver hvor UV-lys ikke kan nås let, er som i en intakt mus, denne photoconversion tilgang imidlertid usandsynligt, at arbejde15. Derudover etiketter Cre skæbne-mapping permanent celler giver mulighed for mere langsigtede skæbne kortlægning end photoconversion, der mister sin etiket som photoconverted versionen af proteinet afleder og nye uomvendte protein er produceret af cellen. Ikke desto mindre, afhængigt af det videnskabelige spørgsmål, photoconversion kan være et nyttigt redskab for skæbne-kortlægning af cellepopulationer.
Selv om kun to eksempler på anvendelsen af photoconversion er angivet, har talrige undersøgelser vist sin effektivitet. Afhængigt af den geografiske præcision kræves, kan photoconversion udføres med adgang til en UV-lyskilde. Hvis ønsket er at mærke enkelt kan celler mere avancerede imaging som Konfokal eller to-foton mikroskopi være nødvendigt. Ikke desto mindre har mulighed for at vælge begge den rumlige og tidsmæssige område i mærket celler tydeligt fra andre celler i en intakt væv gjort UV-induceret photoconversion en kraftfuld teknik til at dissekere biologiske spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Bernard Kulemaka og medlemmer af Smith lab for deres nyttige bemærkninger og reagens vejledning, Sam Connell og Brent Redford af 3i for fielding imaging spørgsmål og Deborah Bang, Karen Heed og Kay Stewart for zebrafisk pleje. Dette arbejde blev støttet af University of Notre Dame, Elizabeth og Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Center for zebrafisk forskning på University of Notre og centrum af stamceller og regenerativ medicin ved University of Notre Dame. Alle animalske undersøgelser blev udført i overensstemmelse med University of Notre Dame IACUC til Dr. Cody Smith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
