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Developmental Biology

सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार

Published: March 19, 2018 doi: 10.3791/57024
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

Summary

यहां, हम दिखाने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान कैसे सेल photoconversion विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन, Eos, रहने वाले पशुओं में व्यक्त क्षेत्रों के लिए यूवी जोखिम के माध्यम से हासिल की है ।

Abstract

पशु और संयंत्र ऊतक कोशिकाओं की अलग आबादी से बना है । इन कोशिकाओं को समय के निर्माण और बनाए रखने के ऊतकों पर बातचीत और रोग का कारण बन सकता है जब बाधित । वैज्ञानिकों चालाक तकनीकों कोशिकाओं के सबसेट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त द्वारा बरकरार ऊतक के भीतर इन कोशिकाओं की विशेषताओं और प्राकृतिक गतिशीलता की जांच करने के लिए विकसित किया है । हालांकि, कई बार, प्रयोगों में ऊतक के भीतर कक्षों के अधिक चयनित विज़ुअलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है, कभी-कभार एकल-कक्ष या जनसंख्या-कक्ष तरीके से. इस लक्ष्य को प्राप्त करने और कोशिकाओं की आबादी के भीतर एकल कोशिकाओं कल्पना, वैज्ञानिकों फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एकल सेल photoconversion का उपयोग किया है । इस तकनीक का प्रदर्शन, हम यहां दिखाने के लिए कैसे एक Eos-एक बरकरार, रहने zebrafish में ब्याज की सेल व्यक्त करने के लिए यूवी प्रकाश प्रत्यक्ष । हम तो उन photoconverted Eos+ कोशिकाओं 24 h बाद में निर्धारित करने के लिए कि वे कैसे ऊतक में बदल छवि । हम दो तकनीकों का वर्णन: सेल की आबादी के एकल सेल photoconversion और photoconversions । इन तकनीकों सेल सेल बातचीत, सेल भाग्य और भेदभाव, और सेल प्रवास कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह एक तकनीक है कि कई जैविक प्रश्नों में लागू है बना रही है ।

Introduction

एकाधिक अलग कोशिकाओं के निर्माण और जटिल पशु और संयंत्र के ऊतकों को बनाए रखने के लिए बातचीत । इन कोशिकाओं को अक्सर intercalated और उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी कि ऊतक के निर्धारण की आवश्यकता के बिना एक एकल कोशिका स्तर पर पड़ोसियों से अलग करने के लिए मुश्किल हैं. हालांकि, समझने के लिए कैसे इन ऊतकों के रूप, बनाए रखा है, और रोगग्रस्त हो जाते हैं, यह जांच करने के लिए आवश्यक हो गया है कि कैसे ऊतक के भीतर एक कोशिकाओं को समय के साथ बातचीत कर रहे हैं । आदर्श रूप में, इन प्रयोगों एक गैर इनवेसिव तरीके से एक ऊतक के भीतर एकल कोशिकाओं के लेबल निर्धारण की आवश्यकता के बिना की आवश्यकता है । वैज्ञानिकों ने अब कई तकनीक विकसित की है इस कार्य को पूरा करने के लिए1,2,3,4।

खोज और जेलिफ़िश ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कार्यांवयन (GFP) एक रोमांचक दृष्टिकोण है कि एक ऊतक पर्यावरण1में अलग कोशिकाओं के लेबल के लिए अनुमति दी गई थी । कक्ष-विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करके, यह संभव है कि1लेबल किए गए कक्षों के किसी सबसेट का आनुवंशिक रूप से चयन करें । वैकल्पिक रूप से, GFP के वायरल प्रेरित अभिव्यक्ति GFP3,4के उपयोगकर्ता चयनित अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जा सकता है । हालांकि काफी उपयोगी, GFP की आनुवंशिक मध्यस्थता अभिव्यक्ति ऊतक में कोशिकाओं के एक सबसेट के भीतर उपयोगकर्ता-चयनित अभिव्यक्ति की अनुमति नहीं है; और GFP के वायरल अभिव्यक्ति है, हालांकि लाभप्रद, आक्रामक हो सकता है । GFP डेरिवेटिव और Brainbow तरह चालाक तकनीक के आगमन के साथ विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन और अधिक विरल ऊतकों के भीतर व्यक्त करने के लिए, यह एक कोशिकाओं कल्पना और जटिल ऊतक में उन के बीच बातचीत करने के लिए संभव हो गया है2, 5. हालांकि, इन दृष्टिकोण एक यादृच्छिक फैशन में लेबल कोशिकाओं । यदि वांछित प्रयोग को किसी एकल कक्ष या उन कक्षों की जनसंख्या के विज़ुअलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है जो experimenter द्वारा परिभाषित किए जाते हैं, तो वे इसलिए सीमित हैं. ऐसे प्रयोगों के साथ, यह एक आनुवंशिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि अलग करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है लाभप्रद होगा, एक ही सेल फैशन में, यह अन्य फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं से.

इस लक्ष्य को प्राप्त करने और एक जटिल रहने वाले ऊतक के भीतर एकल कोशिकाओं के सेल जीवविज्ञान कल्पना, वैज्ञानिक समुदाय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन6,7,8के एकल कोशिका photoconversion का उपयोग करता है । एक photoconvertible प्रोटीन की आनुवंशिक रूप से नियंत्रित अभिव्यक्ति का उपयोग (यानी, eos, kaede, आदि) है कि एक हरे रंग से लाल फ्लोरोसेंट राज्य के लिए संक्रमण जब यूवी (488 एनएम) प्रकाश को उजागर, हम अपनी फ्लोरोसेंट लेबल से एक एकल कोशिका भेद कर सकते है पड़ोसियों6,7,8। इस दृष्टिकोण एक हमारे फोकल माइक्रोस्कोप जो एक लेजर से प्रकाश प्रत्यक्ष कर सकते है के लिए संलग्न तंत्र का इस्तेमाल एक विवर्तन ब्याज की सीमित क्षेत्र में ढेर । इस तकनीक के साथ, हम या तो एक प्रयोक्ता में एक कोशिकाओं या बड़ी आबादी लेबल कर सकते है निर्धारित तरीके से9,10,11। तकनीक वायरल GFP के एकल सेल इंजेक्शन की तुलना में न्यूनतम इनवेसिव है । अवधारणा का एक सबूत के रूप में, हम बताते है कि हम परिधीय तंत्रिका तंत्र में एक नाड़ीग्रंथि के भीतर एकल कोशिकाओं photoconvert कर सकते है और photoconvert रीढ़ की हड्डी के ventral ओर स्थित कोशिकाओं की तरह बड़ी आबादी9,10, 11,12. हम तो इन photoconverted सेल आबादी 24 ज बाद में अपने आंदोलन और विकास के दौरान भेदभाव में अंतर्दृष्टि हासिल कल्पना कर सकते हैं ।

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Protocol

सभी पशु अध्ययन Notre डेम संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. Zebrafish नमूना तैयार करना

  1. एक वयस्क पुरुष और एक वयस्क महिला टीजी (परिवर्तनीय प्रोटीन) मानक प्रक्रियाओं13प्रति एक संभोग कक्ष में प्लेस । इस पांडुलिपि में, टीजी (sox10: eos) का उपयोग करें मछली9 क्योंकि उपयोग की लेकिन photoconvertible प्रोटीन के साथ अंय ट्रांसजेनिक लाइनों समान रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है । मामले में एक से अधिक चैंबर सेट मछली करना नहीं है । मछली रात भर चैंबर में रहने के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. अगली सुबह, 100 मिमी पेट्री व्यंजन में अंडे इकट्ठा । अंडे की अनुमति दें करने के लिए परिपक्व 24 एच के बाद निषेचन (hpf) स्क्रीनिंग से पहले ।
  3. यदि ऊपर जानवरों transgene के लिए heterozygotes थे, टीजी के लिए स्क्रीन 24 hpf व्यंजन (sox10: eos) + एक 488 एनएम प्रकाश स्रोत और एक विदारक माइक्रोस्कोप पर GFP फ़िल्टर सेट के साथ भ्रूण । अलग टीजी (sox10: eos) + भ्रूण और 48 hpf को परिपक्व करने की अनुमति ।
  4. Dechorionate एक सुई या चिमटी के साथ मैन्युअल रूप से भ्रूण ।
  5. तैयार और माइक्रोवेव 0.8% कम पिघलने बिंदु agarose समाधान की 5 मिलीलीटर ।
    1. एक बार agarose स्पर्श करने के लिए शांत है, जगह 3-4 anesthetized टीजी (sox10: eos) + 48 hpf मछली एक 10 मिमी ग्लास-coverslip नीचे पेट्री डिश के केंद्र में ।
    2. coverslip की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त agarose जोड़ें, लगभग 1 मिलीलीटर । एक जांच सुई का उपयोग करने के लिए उनके पक्ष पर मछली की व्यवस्था । agarose पशुओं के बढ़ते सुनिश्चित करने के लिए जमना के लिए अनुमति दें । यह लगातार फिर से zebrafish की व्यवस्था करने के लिए आवश्यक हो सकता है जब तक आगर14जम । Solidification लगभग 2 मिनट लेता है ।
  6. के बाद agarose 2 मिनट के लिए जम गया है, धीरे से भ्रूण को जोड़ने 0.02% aminobenzoic एसिड एस्टर (Tricaine) डिश के लिए जब तक कि आगर और पकवान के नीचे की सतह जलमग्न है । यह लगभग 3mL होना चाहिए ।

2. माइक्रोस्कोप बढ़ते और पूर्व रूपांतरण इमेजिंग

  1. ओपन फोकल सॉफ्टवेयर और कब्जा और फोकस विंडोज [चित्रा 1] का चयन करें । कैप्चर विंडो के अंतर्गत, कैप्चर सेटिंग ड्रॉप डाउन टैब [चित्र 1] के अंतर्गत लैब-विशिष्ट कनवर्ज़न इमेजिंग सेटिंग का चयन करें । यहां, प्रयोगशाला विशेष सेटिंग कहा जाता है "मछली इमेजिंग."
  2. फोकल दायरे पर जगह नमूना और पाठ्यक्रम और ठीक समायोजन knobs का उपयोग कर ध्यान में लाना.
  3. फोकस विंडो खोलें और ब्याज की वांछित क्षेत्र (यानी पृष्ठीय रूट गैंग्लिया) का पता लगाएं ।
  4. फ़िल्टर सेट मेनू के अंतर्गत c488 लेज़र का चयन करें । सेट करने के लिए 300 एमएस, लेजर पावर के लिए 5, और तेज करने के लिए 75 [चित्रा 2].
  5. कैप्चर प्रकार अनुभाग के तहत 3d बॉक्स को चेक करें । 3d कैप्चर अनुभाग में, वर्तमान स्थिति का उपयोग करें का चयन करें और वर्तमान के आसपास की श्रेणीजांचें । एक ही अनुभाग में, रेंज सेट करने के लिए 35, विमानों की संख्या 36 करने के लिए, और चरण आकार करने के लिए 1 । श्रेणी बढ़ाया जा सकता है या इमेजिंग क्षेत्र की गहराई के लिए समायोजित करने के लिए कम हो । रीढ़ की हड्डी के लिए 35-40 ढेर के बीच एक सीमा मूल्य आमतौर पर पर्याप्त है [चित्र 5] ।
  6. वर्तमान स्थान का चयन करें [चित्र 5] ।
  7. छवि प्राप्त करने के लिए कैप्चर विंडो के निचले भाग में प्रारंभ क्लिक करें ।

3. सिंगल सेल Photoconversion

  1. ओपन फोकल सॉफ्टवेयर और कब्जा और फोकस विंडोज [चित्रा 1] का चयन करें । कैप्चर विंडो के अंतर्गत, कैप्चर सेटिंग ड्रॉप डाउन टैब [चित्र 1] के अंतर्गत लैब-विशिष्ट कनवर्ज़न इमेजिंग सेटिंग का चयन करें । यहां, प्रयोगशाला विशेष सेटिंग कहा जाता है "मछली ablate पूर्ण चिप."
  2. फ़िल्टर सेट मेनू के अंतर्गत c488 और c541 लेज़र का चयन करें । एक ही माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग नहीं करते हैं, तो विभिन्न पराबैंगनीकिरण का चयन करें और 488 एनएम और 541 एनएम पराबैंगनीकिरण का चयन करने के लिए मेनू पाते हैं । 300 एमएस के लिए एक्सपोजर सेट, लेजर शक्ति 5, और 75 के लिए तेज [चित्रा 2] । इन लेजर सेटिंग्स photobleaching या विषाक्तता के कारण के बिना पर्याप्त फ्लोरोसेंट संकेत उत्पादन के आधार पर चयन कर रहे हैं । यदि विषाक्तता या photobleaching की कल्पना है, लेजर शक्ति या जोखिम को कम ।
  3. फ़ोकस विंडो खोलें और फ़ोकस विंडो में photomanipulation टैब पर क्लिक करें । तदनुसार लेजर मापदंडों को समायोजित करें । लेज़र स्टैक पावर को 2 में बदलें, और उसके बाद जाएंक्लिक करें । रैस्टर ब्लॉक आकार को 1 में बदलें और Setक्लिक करें । डबल-क्लिक आकार को 4 में परिवर्तित करें । लेजर लाइन को v405 [चित्रा 3] में बदलें ।
  4. कैप्चर विंडो में उंनत कैप्चर सेटिंग्स खोलें । photomanipulation टैब का चयन करें, और 2 के लिए डबल-क्लिक करें reदोहरावों बदलें । ठीक क्लिक करें [चित्रा 4] ।
  5. फ़ोकस विंडो में XY टैब का चयन करें । डबल photomanipulation टैब में चरण 2 से लेजर मापदंडों की जांच करें [चित्रा 3, चित्रा 4] । आसपास के कक्षों की photoconversion के बिना ब्याज की कोशिका को photoconvert करने के लिए लेज़र सेटिंग सेट करें.
    1. यदि आसंन कोशिकाओं के photoconversion मौजूद है, लेजर शक्ति को कम । यदि कोशिकाओं की photoconversion नहीं होती है, लेजर शक्तियों को बढ़ाया जा सकता है । इष्टतम, लेजर शक्ति सेट करने के लिए केवल ब्याज के क्षेत्र और आसपास के क्षेत्रों photoconvert नहीं है ।
  6. कैप्चर प्रकारके अंतर्गत डीकॉक बॉक्स को चेक करें । फिर, प्रारंभ [चित्रा 6A] क्लिक करें ।
  7. लाइव डीकॉक विंडो खुलने के बाद, शीर्ष टूलबार पर सर्कल टूल का चयन करें [चित्रा 7]
  8. कक्ष के centermost क्षेत्र में एक वृत्त आरेखित करना । आरेखित वृत्त पर दायां क्लिक करें, frap हैक्षेत्र का चयन करें, और 3 सेकंड रुको । चयनित क्षेत्र dimmer [चित्रा 8] बन जाना चाहिए । कैप्चर रोकेंक्लिक करें ।
  9. यदि एक से अधिक पशु इमेजिंग, तो फ़ोकस मेनू में XY टैब पर वापस जाएं और 2 स्थिति का चयन करें । उसके बाद, चरण 4.1-4.6 दोहराएँ ।
  10. किसी जनसंख्या को कक्षों में कनवर्ट करने के लिए, frap है के क्षेत्र के लिए कोई वृत्त आरेखित करने के स्थान को छोड़कर चरण 4.1-4.4 के लिए प्रोटोकॉल और लेज़र पैरामीटर्स का पालन करें, पंक्ति उपकरण का उपयोग करें । ब्याज के क्षेत्र पर एक लाइन ड्रा और ऊपर सूचीबद्ध एक ही पैरामीटर का उपयोग कर क्षेत्र frap है ।

4. पोस्ट-photoconversion इमेजिंग

  1. एक बार सभी अंक photoconverted हैं । में वर्णित लैब-विशिष्ट मानक छवि स्टैक सेटिंग का चयन करें । इस कैप्चर सेटिंग ड्रॉप डाउन टैब कैप्चर विंडो में [चित्र 5] के अंतर्गत पाया जाता है ।
  2. c488 लेजर का चयन करें और 300ms के लिए जोखिम सेट, लेजर पावर 5 करने के लिए, और 75 के लिए तेज [चित्रा 2] ।
  3. c488 लेजर के रूप में एक ही मेनू के तहत पाया c541 लेजर का चयन करें । 500 ms करने के लिए एक्सपोजर सेट, लेजर 10 करने के लिए शक्ति, और 75 के लिए तेज [चित्रा 9].
  4. कैप्चर प्रकार अनुभाग के तहत 3d बॉक्स को चेक करें । 3d कैप्चर अनुभाग में, वर्तमान स्थिति का उपयोग करें का चयन करें और वर्तमान के आसपास की श्रेणी जांचें । एक ही अनुभाग में, रेंज सेट करने के लिए 35, विमानों की संख्या 36 करने के लिए, और चरण आकार करने के लिए 1 । श्रेणी संख्या में वृद्धि या इच्छित इमेजिंग गहराई [चित्र 5] को समायोजित करने के लिए कम हो सकती है ।
  5. यदि XY फ़ोकस टैब में एकाधिक बिंदु हैं, तो कैप्चर विंडो में बहु सूची विकल्प का चयन करें । यदि नहीं, तो वर्तमान स्थान का चयन करें ।
  6. छवि प्राप्त करने के लिए कैप्चर विंडो के निचले भाग में प्रारंभ क्लिक करें ।

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Representative Results

फ्लोरोसेंट प्रोटीन की Photoconversion एक ऊतक के भीतर अलग कोशिकाओं लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है6. इस प्रदर्शन के लिए, टीजी (sox10: eos) मछली9 sox10के विनियामक दृश्यों के तहत photoconvertible प्रोटीन eos व्यक्त करते थे । टीजी (sox10: eos) 48 hpf में पशु पहले घुड़सवार थे, और फिर किसी भी गैर विशिष्ट photoconversion है कि हो सकता है का पता लगाने की छवि । eos थोड़ा eos photoconverted फ्लोरोसेंट संकेत के साथ फ्लोरोसेंट संकेत अनजाना तो visualized था (चित्रा 10) । पशुओं को अंधेरे में रखा गया था सुनिश्चित करने के लिए गैर विशिष्ट photoconversion ंयूनतम है । फिर, ब्याज के क्षेत्रों में फोकल माइक्रोस्कोप सेट अप का उपयोग कर यूवी प्रकाश से अवगत कराया गया । कि एकल कोशिकाओं यूवी जोखिम का एक परिणाम के रूप में photoconverted थे की पुष्टि करने के लिए, हम photoconverted क्षेत्र में फैले क्षेत्र के जेड पोट ले लिया । सफल photoconversion के साथ सुसंगत, वहां गैर का पता लगाने के हित के क्षेत्र के बाहर और photoconverted eos परिवर्तित eos था अलग ब्याज के क्षेत्र में मौजूद था । परिणामी छवि एक नाड़ीग्रंथि है कि अपने पड़ोसियों से निश्चित रूप से लेबल है के भीतर एक एकल सेल से पता चलता है (चित्र 10) ।

इस photoconversion तकनीक की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, कोशिकाओं की आबादी भी यूवी प्रकाश के संपर्क में था । इस प्रतिमान में, पूर्व photoconversion छवियों और ले जाया गया कोई संयुक्त राष्ट्र photoconverted Eos संकेत मौजूद था । अगले, रीढ़ की हड्डी के ventral पक्ष यूवी को उजागर किया गया एक पंक्ति (चित्र 11) का उपयोग कर । सफल photoconversion, पोस्ट-photoconversion छवियों की पुष्टि करने के लिए और ले जाया गया ब्याज की रेखा के स्थान पर ventral स्पाइनल कॉर्ड कोशिकाओं में Eos कि हम आकर्षित किया गया (चित्र 11) visualized थे । गैर photoconverted Eos संकेत अंय सभी क्षेत्रों में दिखाई दे रहा था । इस तकनीक का विस्तार करने के लिए हम तो photoconversion के बाद 24 घंटे समान छवियां लिया । इन छवियों में, photoconverted Eos+ कोशिकाओं दोनों पृष्ठीय और ventral स्थानों में रीढ़ की हड्डी क्षेत्र भर में बिखरे हुए देखा गया (चित्रा 12) । ये डेटा इस परिकल्पना के अनुरूप है कि ventral स्पाइनल कक्ष पहले वर्णित10के रूप में पृष्ठीय स्थानों पर स्थित हैं । एक साथ इन दो तकनीकों का प्रदर्शन है कि Eos के photoconversion एक उपयोगकर्ता फैशन परिभाषित में एक ऊतक क्षेत्र के भीतर एक कोशिकाओं या कोशिकाओं की आबादी कल्पना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । यह सेलुलर विशेषताओं जैसे सेल माइग्रेशन, संचार, और गतिशीलता के लिए एक बेहतर समझ में योगदान दिया है ।

Figure 1
चित्र 1 : कैप्चर और फ़ोकस Windows. कब्जा और फोकस खिड़कियों और प्रयोगशाला विशिष्ट "मछली ablate पूर्ण चिप" ड्रॉप डाउन टैब के स्थान का चित्रण सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : c488 लेजर पैरामीटर. कैप्चर विंडो का स्क्रीनशॉट c488 लेज़र के लिए विशिष्ट पैरामीटर्स दिखा रहा है । एक्सपोजर है 300 ms. लेज़र पावर 5 है । तेज 75 है । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : Photoconversion लेजर पैरामीटर. फोकस विंडो में photomanipulation टैब के स्क्रीनशॉट विशिष्ट लेजर photoconversion के लिए आवश्यक सेटिंग्स रूपरेखा । Laserstack पावर 2 है । डबल-क्लिक आकार 4 है । रैस्टर ब्लॉक आकार 1 है । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : उन्नत Photoconversion लेज़र पैरामीटर. कैप्चर विंडो में उन्नत लेज़र सेटिंग्स का स्क्रीनशॉट. यह photomanipulation टैब के साथ कैप्चर प्राथमिकताएं विंडो को खोलता है । डबल-क्लिक पुनरावृत्ति 2 के लिए सेट किया गया है । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : पूर्व रूपांतरण इमेजिंग पैरामीटर. फ़ोकस और कैप्चर windows के स्क्रीनशॉट । कैप्चर विंडो विशिष्ट पैरामीटर पूर्व रूपांतरण इमेजिंग के लिए आवश्यक पर प्रकाश डाला गया । कब्जा सेटिंग "मछली इमेजिंग है." 3d बॉक्स कैप्चर प्रकार के नीचे जांचा जाता है । और 3 डी कैप्चर सेटिंग्स के रूप में निर्दिष्ट कर रहे हैं; रेंज 35 है, विमानों की संख्या 36 है, चरण आकार 1 है, और ऑफसेट-15 है । "वर्तमान स्थिति" और "वर्तमान के आसपास श्रेणी" बॉक्स भी चयनित हैं । लाल बक्से देखें । दर्शाया गया है कि कैप्चर विंडो (बाएं) पर एकल या एकाधिक बिंदुओं का चयन कैसे करें और फ़ोकस विंडो (दाएं) पर व्यक्तिगत बिंदुओं का चयन कैसे करें । हरे बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : Photoconversion विंडो खोलना । डीकॉक कैप्चर प्रकार का चित्रण स्क्रीनशॉट पहले सेट मापदंडों के अनुसार चुना जाता है । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : Photoconversion की स्थापना. सर्किल उपकरण (ऊपर) और कब्जा नियंत्रण खिड़की है कि (सही) प्रकट होता है के स्थान दिखा स्क्रीनशॉट । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : एकल-कक्ष Photoconversion. सर्किल photoconversion उपकरण और सही क्लिक करें ड्रॉप डाउन मेनू के उपयोग का चित्रण स्क्रीनशॉट । "frap है सभी क्षेत्र" रूपांतरण कार्रवाई सही क्लिक ड्रॉप डाउन मेनू के भीतर स्थित है । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : पोस्ट-Photoconversion c561Laser पैरामीटर. कैप्चर विंडो का स्क्रीनशॉट c561 लेज़र के लिए विशिष्ट पैरामीटर्स दिखा रहा है । एक्सपोजर है 500 ms. लेज़र पावर है 10. तेज 75 है । लाल बक्से देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 : एकल-कक्ष Photoconversion. (क). योजनाबद्ध और फोकल जेड- टीजी (sox10: eos) के अनुमानों zebrafish 48 hpf परिधीय तंत्रिका तंत्र में photoconversion से पहले पृष्ठीय रूट गैंग्लिया दिखा रहा है । डैश्ड रेखा डीआरजी रीढ़ की हड्डी में प्रवेश के अनुमानित स्थान को इंगित करता है.. (ख). योजनाबद्ध और फोकल जेड-टीजी के अनुमानों (sox10: eos) zebrafish 48 hpf में photoconversion के दौरान परिधीय तंत्रिका तंत्र में पृष्ठीय रूट गैंग्लिया दिखा रहा है । डैश्ड रेखा डीआरजी रीढ़ की हड्डी में प्रवेश को इंगित करता है । पीला चक्र इंगित करता है रूपांतरण साइट और प्रकाश बोल्ट यूवी प्रकाश जोखिम इंगित करता है । (ग). योजनाबद्ध और फोकल जेड-टीजी के अनुमानों (sox10: eos) 48 hpf परिधीय तंत्रिका तंत्र के बाद photoconversion में पृष्ठीय रूट गैंग्लिया दिखा रहा है पर zebrafish । डैश्ड रेखा डीआरजी रीढ़ की हड्डी में प्रवेश को इंगित करता है । सीएनएस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए एक संक्षिप्त नाम है और पीएन परिधीय तंत्रिका तंत्र (ए-सी) के लिए एक संक्षिप्त नाम है । स्केल पट्टी 10 um के बराबर होती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11 : एक बड़ा रीढ़ की हड्डी क्षेत्र में Photoconversion प्रक्रिया । (क). योजनाबद्ध और फोकल जेड-अनुमानों के टीजी (sox10: eos) zebrafish पर 48 hpf दिखा OPCs और गैंग्लिया से पहले रीढ़ की हड्डी के ventral क्षेत्र में पृष्ठीय जड़ photoconversion. डैश्ड रेखा रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय क्षेत्र को इंगित करता है । (ख). योजनाबद्ध और फोकल जेड- टीजी (sox10: eos) के अनुमानों गैंग्लिया के दौरान रीढ़ की हड्डी के ventral क्षेत्र में OPCs और पृष्ठीय जड़ photoconversion दिखा 48 hpf में zebrafish । ठोस पीली रेखा चयनित क्षेत्र को photoconversion के लिए इंगित करती है । डैश्ड रेखा रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय क्षेत्र को इंगित करता है । (ग). योजनाबद्ध और फोकल जेड-अनुमानों के टीजी (sox10: eos) zebrafish पर 48 hpf दिखा OPCs और गैंग्लिया के बाद रीढ़ की हड्डी के ventral क्षेत्र में पृष्ठीय जड़ photoconversion. डैश्ड रेखाएं रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय क्षेत्र को इंगित करती हैं । स्केल पट्टी 10 um के बराबर होती है ।

Figure 12
चित्र 12 : सेलुलर ट्रैकिंग और दृश्य पोस्ट-photoconversion । (क). टीजी की योजनाबद्ध (sox10: eos) zebrafish रीढ़ की हड्डी में 48 गैंग्लिया के बाद रीढ़ की हड्डी के ventral क्षेत्र में OPCs और पृष्ठीय जड़ photoconversion दिखा hpf । बिजली बोल्ट यूवी प्रकाश रूपांतरण इंगित करता है । (ख). फोकल जेड-टीजी के अनुमानों (sox10: eos) zebrafish रीढ़ की हड्डी में शुरू 48 hpf गैंग्लिया के बाद रीढ़ की हड्डी के ventral क्षेत्र में OPCs और पृष्ठीय रूट photoconversion दिखा रहा है । बिजली बोल्ट यूवी प्रकाश रूपांतरण इंगित करता है । स्केल पट्टी 10 um के बराबर होती है ।

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Discussion

जटिल ऊतकों में, विशिष्ट सेल प्रकारों को विशेष डोमेन में व्यवस्थित करता है । हाल ही में तकनीक के लिए इन बड़े ऊतक संरचनाओं के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं लेबल1,2,3का उपयोग किया गया है । यहाँ हम दो तकनीकों है कि इसी तरह जटिल ऊतकों के भीतर दोनों एकल सेल बातचीत और सेल जनसंख्या बातचीत कल्पना करने के लिए उपयोग किया जा सकता का प्रदर्शन. photoconversion तकनीक का लाभ स्थानिक नियंत्रण वैज्ञानिक को अलग से एक सेल लेबल है । एक खुर्दबीन कि बड़े इमेजिंग खिड़की के भीतर छोटे इमेजिंग क्षेत्रों को बेनकाब करने की क्षमता है के साथ, एकल कोशिकाओं या एकल कोशिकाओं के क्षेत्रों के रूप में छोटे क्षेत्रों अन्य कोशिकाओं की तुलना में अलग से लेबल किया जा सकता है. एकाधिक photoconvertible प्रोटीन अब यह एक अधिक व्यापक तकनीक7बनाने समुदाय के लिए शुरू किया गया है । कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन photoconvert करने की क्षमता के साथ, वैज्ञानिकों इस तकनीक या इसी तरह के दृष्टिकोण सेल प्रवास की जांच करने के लिए उपयोग किया है, सेल विभेद और तंत्रिका सर्किट विश्लेषण ।

हालांकि सॉफ्टवेयर और विशिष्ट लेजर मानकों हमारे प्रयोगशाला के लिए विशिष्ट हैं, इस लेख सार्वभौमिक एक नाड़ीग्रंथि के भीतर एकल कोशिकाओं में भेद में photoconvertable प्रोटीन Eos का उपयोग करने की क्षमता को दर्शाता है । दुर्भाग्य से, सबसे आनुवंशिक नियामक क्षेत्रों है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन ड्राइव जल्दी विकास चरणों में गैंग्लिया के भीतर व्यापक रूप से व्यक्त किया जा सकता है । यह संभावना है क्योंकि इन कोशिकाओं को समान जनक पूल से उत्पंन कर रहे है और मार्करों उन जनक राज्यों की पहचान9। यह इसलिए इन पहले विकास चरणों के दौरान बड़े गैंग्लिया के भीतर एकल कोशिकाओं की बातचीत कल्पना करने के लिए मुश्किल है । यहां दिखाए गए दृष्टिकोण एक तकनीक है कि एक नाड़ीग्रंथि के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं को लेबल कर सकते है और इस प्रकार गैंग्लिया विकास के बारे में वैज्ञानिक प्रश्नों काटना इस्तेमाल किया जा सकता का प्रतिनिधित्व करता है ।

हालांकि, यह photoconversion तकनीक गैंग्लिया विकास की पढ़ाई तक ही सीमित नहीं है । उदाहरण के लिए, पुनर्जनन के अध्ययन में, पूर्व चोट की स्थिति के photoconversion कैसे एक नाड़ीग्रंथि के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं चोट के बाद जवाब निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । ये अध्ययन किसी नाड़ीग्रंथि में विशिष्ट कक्षों की जनक-एक्टिविटी क्षमता को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं. इसी तरह, विशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं के photoconversion और समय के साथ उन कोशिकाओं की ट्रैकिंग जटिल ट्यूमर के भीतर एकल कोशिकाओं के गुणों को उजागर कर सकता है । एकल कोशिका photoconversion के इस आवेदन इसलिए जैव चिकित्सा समुदाय में सार्थक खोजों बनाने के लिए तकनीक की क्षमता का विस्तार.

यह दृष्टिकोण भी चुनिंदा रीढ़ की हड्डी के एक क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं लेबल कर सकते हैं । विकास में, कोशिकाओं को अक्सर परिपक्व स्थानों11,14में विभेदित कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए अग्रदूत क्षेत्रों से पलायन । Cre के साथ दीर्घकालिक भाग्य मानचित्रण कुशलतापूर्वक ऐसी प्रक्रियाओं काटना करने के लिए उपयोग किया गया है । Cre तकनीकों के साथ, स्थानिक संकल्प जीनोमिक विनियामक क्षेत्रों है कि ड्राइव Cre प्रतिलेखन15तक ही सीमित है । photoconversion के साथ, इस स्थानिक संकल्प समय जब photoconversion होता है और लौकिक संकल्प का चयन करने की क्षमता के साथ साथ प्राप्त किया जा सकता है । इसलिए, छोटी अवधि के भाग्य के लिए मानचित्रण, इस photoconversion तकनीक Cre भाग्य मानचित्रण पर कई फायदे हैं । हालांकि, नमूनों में जहां यूवी प्रकाश आसानी से हासिल नहीं किया जा सकता है, एक बरकरार माउस में की तरह, इस photoconversion दृष्टिकोण के लिए15काम की संभावना नहीं है । इसके अतिरिक्त, Cre भाग्य-स्थाई रूप से मानचित्रण के लिए अनुमति कोशिकाओं लेबल और अधिक दीर्घकालिक भाग्य मानचित्रण photoconversion कि प्रोटीन के रूप में अपने लेबल खो देता है के रूप में photoconverted के अपव्यय और नए परिवर्तित प्रोटीन कोशिका द्वारा उत्पादित है । बहरहाल, वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है, photoconversion भाग्य के लिए एक उपयोगी उपकरण-सेल आबादी की मानचित्रण हो सकता है ।

यद्यपि photoconversion के आवेदन के केवल दो उदाहरण प्रदान किए गए हैं, कई अध्ययनों ने इसकी प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है. स्थानिक परिशुद्धता की आवश्यकता पर निर्भर करता है, photoconversion एक यूवी प्रकाश स्रोत के लिए उपयोग के साथ किया जा सकता है । यदि इच्छा एकल कोशिकाओं को लेबल करने के लिए है और फोकल या दो की तरह उंनत इमेजिंग-फोटॉन माइक्रोस्कोपी आवश्यक हो सकता है । फिर भी, एक बरकरार ऊतक के भीतर अंय कोशिकाओं से अलग लेबल कोशिकाओं के स्थानिक और लौकिक क्षेत्र दोनों का चयन करने की क्षमता यूवी प्रेरित photoconversion जैविक प्रश्नों काटना एक शक्तिशाली तकनीक बना दिया है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम बर्नार्ड Kulemaka और उनके सहायक टिप्पणियां और मार्गदर्शन के लिए स्मिथ लैब के सदस्यों को धंयवाद, सैम Connell और 3i के ब्रेंट Redford इमेजिंग सवाल और दबोरा बैंग, करेन रस्ते और zebrafish देखभाल के लिए Kay स्टीवर्ट के लिए । यह काम Notre डेम, एलिजाबेथ और माइकल Gallagher परिवार, अल्फ्रेड पी Sloan फाउंडेशन, Notre विश्वविद्यालय में Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र और स्टेम सेल और Notre विश्वविद्यालय में अपक्षयी दवा के केंद्र में विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था डेम. सभी पशु अध्ययन विश्वविद्यालय Notre डेम IACUC के साथ डॉ कोड़ी स्मिथ के अनुपालन में किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish VWR 25384-302
Embryo medium Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose dot scientific inc 9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish Ted Pella Inc. 14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) Fluka analytical A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets 3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion 405 nm laser
Slidebook software 3i
Methylene blue Kordon

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 133 zebrafish photoconversion Eos फोकल माइक्रोस्कोपी
सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार
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Green, L., Smith, C. J. Single-cell… More

Green, L., Smith, C. J. Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish. J. Vis. Exp. (133), e57024, doi:10.3791/57024 (2018).

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