Summary
Здесь мы представляем протокол проявить, как ячейки photoconversion достигается за счет УФ-облучения в конкретные районы, выражая флуоресцентный белок, Eos, в живых животных.
Abstract
Животных и растительных тканей состоит из отдельных популяций клеток. Эти клетки взаимодействуют со временем для построения и поддержания тканей и может вызвать болезнь, когда нарушена. Ученые разработали умные методы расследования характеристики и естественную динамику этих клеток в неповрежденной ткани выразить флуоресцентных белков в подмножества ячеек. Однако время от времени, эксперименты требуют более выбранных визуализации ячеек в ткани, иногда на одну ячейку или населения клетки образом. Для достижения этой цели и визуализации единичных клеток внутри населенность клеток, ученые использовали одну ячейку photoconversion флуоресцентных белков. Чтобы продемонстрировать эту технику, мы покажем здесь как прямой свет УФ Eos выражая ячейку интереса к нетронутым, живущих у рыбок данио. Мы затем изображение те клетки Eos+ photoconverted 24 h позже определить, как они изменили в ткани. Мы описываем две техники: Одноместный клеток photoconversion и photoconversions населения ячейки. Эти методы могут использоваться для визуализации ячеек взаимодействий, клетки судьба и дифференциации и миграции клеток, делает его технику, которая применима в многочисленных биологических вопросов.
Introduction
Несколько отдельных ячеек взаимодействуют для создания и поддержания сложных тканями растений и животных. Эти клетки часто вставными и трудно отличить от соседей на уровне отдельной ячейки без микроскопия высокого разрешения, которые требуют фиксации ткани. Однако, чтобы понять, как эти формы тканей, поддерживаются и стать больными, он был необходимым расследовать как сингл клеток в тканях, взаимодействующих с течением времени. В идеале эти эксперименты требуют маркировки единичных клеток в тканях неинвазивным способом без требования о фиксации. Теперь ученые разработали многочисленные методы для выполнения этой задачи1,2,и3,4.
Обнаружение и осуществление медузы Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) был один интересный подход, который позволил для маркировки отдельных клеток в тканях окружающей среды1. С помощью конкретных клеток промоутеров, возможна генетически выбрать подмножество ячеек, которые помечены как1. В качестве альтернативы вирусный индуцированных выражение гена GFP могут быть использованы для выбранного пользователем выражение гена GFP3,4. Хотя довольно полезным, генетических опосредованной выражение гена GFP не позволяют выбранного пользователем выражение в рамках подмножества клеток в тканях; и вирусный выражение GFP, хотя и выгодно, может быть инвазивными. С появлением производных GFP и умные методы как Brainbow выразить собственный флуоресцентные белки более редко в тканях стало возможным для визуализации единичных клеток и их взаимодействия в сложных ткани2, 5. Однако, эти подходы ярлык клетки случайным образом. Если нужный эксперимент требует визуализации одну ячейку или популяция клеток, определяемое экспериментатора, они таким образом ограничены. С таких экспериментов, было бы целесообразно иметь генетически выраженной флуоресцентный белок, который можно манипулировать, чтобы отличать, в одну ячейку моды, это от других флуоресцентные и не люминесцентные клеток.
Для достижения этой цели и визуализации клеточной биологии одиночных камер в сложных живых тканей, научное сообщество использует одну ячейку photoconversion собственный флуоресцентные белки6,,78. С помощью генетически контролируемых экспрессии белка photoconvertible (то есть, eos, Каэдэ и т.д.), который переходит от зеленых красных флуоресцентных состояние при воздействии УФ (488 нм) света, мы можем выделить одну ячейку от его дневно обозначенные соседи6,,78. Этот подход использует аппарат придает нашей Конфокальный микроскоп, который может направить свет от стека Лазерный дифракционный региона интерес. С этой техникой мы можем либо ярлык отдельные ячейки или больших популяций в форме, определяемой пользователем9,10,11. Методика является минимально инвазивной по сравнению с одной ячейке инъекции вирусных GFP. Как доказательство концепции мы показываем, что мы можем photoconvert отдельные ячейки в пределах ганглия в периферической нервной системы и photoconvert больших популяций как клетки, расположенные на вентральной стороне спинного9,10, 11,12. Затем мы можем визуализировать эти photoconverted клеточных популяций 24 часа позже, чтобы разобраться в их передвижения и дифференциация во время разработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были утверждены в Университете Нотр Дам институциональных животное уход и использование Комитета.
1. Подготовка образца данио рерио
- Место один взрослый самец и один взрослый женский тг (кабриолет белка) в камеру спаривания в стандартные процедуры13. В этой рукописи используйте Tg(sox10:eos)9 рыбы из-за доступ, но другие трансгенных линий с photoconvertible белком может использоваться одинаково. Настройка более чем в одной палате, в случае, если рыба не укладывать. Разрешить рыбу, чтобы остаться на ночь в камере.
- Следующим утром, Соберите яйца в чашках Петри 100 мм. Разрешить яйца созреть до 24 ч после оплодотворения (hpf) до скрининга.
- Если животные выше были heterozygotes для трансген, экран 24 hpf блюда для Tg(sox10:eos) + эмбрионов с 488 нм источник света и GFP фильтровать наборы на рассечения микроскопа. Изолировать Tg(sox10:eos) + эмбрионов и позволяют Зрелые 48 hpf.
- Dechorionate эмбрионы вручную с помощью иглы или пинцетом.
- Подготовить и микроволновой 5 мл раствора точки агарозы легкоплавких 0,8%.
- Как только агарозы прохладный на ощупь, место 3-4 наркотизированных тг (sox10:eos) + 48 hpf рыбы в центре стекла coverslip 10 мм снизу Петри.
- Добавьте достаточно агарозы для покрытия поверхности coverslip, примерно в 1 мл. Использование иглы зондов устроить рыбы на их сторонах. Разрешить агарозы для закрепления обеспечить монтаж животных. Это может быть необходимо постоянно заново организовать данио рерио, до тех пор, пока агар затвердевает14. Затвердевания занимает около 2 мин.
- После агарозы затвердевшим за 2 мин, медленно добавьте эмбриона носитель, содержащий Эстер аминобензойной кислоты 0,02% (Tricaine) чтобы блюдо до нижней поверхности агара и блюдо погружен. Это должно быть около 3 мл.
2. Микроскоп монтажа и предварительное преобразование изображений
- Откройте конфокальный программного обеспечения и выберите окна захвата и фокус [рис. 1]. Под окном захват выберите лаборатории особенностях преобразования изображений под захват, установив раскрывающегося вкладки [рис. 1]. Здесь специфичные для лаборатории Настройка называется «Imaging рыбы.»
- Поместите образец на конфокальный сферы и принести в фокус с помощью курс и плавная регулировка ручки.
- Открыть окно фокус и найдите нужный регион интереса (то есть Спинной корень ганглиев).
- Выберите c488 лазера под меню набор фильтров. Установить экспозицию до 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [рис. 2].
- В разделе записи тип установите флажок 3D. В разделе 3D захвата выберите использовать текущую позицию и проверьте диапазон вокруг тока. В этом же разделе Установите диапазон до 35, количество самолетов до 36 и размер шага 1. Диапазон может быть увеличивается или уменьшается для размещения для глубины области изображений. Для спинного значение диапазона между 35-40 стеками обычно является достаточно [рис. 5].
- Выберите текущее местоположение [рис. 5].
- Нажмите кнопку Пуск в нижней части окна захвата получить изображение.
3. сотовый Photoconversion
- Откройте конфокальный программного обеспечения и выберите окна захвата и фокус [рис. 1]. Под окном захват выберите лаборатории особенностях преобразования изображений под захват, установив раскрывающегося вкладки [рис. 1]. Здесь специфичные для лаборатории Настройка называется «Рыба удалять полный чип».
- Выберите c488 и c541 лазера под меню набор фильтров. Если не использовать то же программное обеспечение микроскопа, найдите меню для выбора различных лазеров и выберите 488 нм и 541 нм лазеры. Установите воздействия 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [рис. 2]. Эти параметры лазера выбираются основе производить достаточно флуоресцентного сигнала не вызывая Фотообесцвечивание или токсичности. Если визуализируется токсичности или Фотообесцвечивание, уменьшите мощность лазера или воздействия.
- Открыть окно фокус и нажмите на вкладку добавлены в окне фокус. Настройте параметры лазерного соответственно. Изменить стек мощность лазера 2 и затем нажмите кнопку Go. Изменить размер блока растр 1 и нажмите кнопку установить. Измените размер дважды на 4. Изменить линия лазера на v405 [рис. 3].
- Откройте расширенный записать параметры в окне захвата. Выберите вкладку добавлены и изменить дважды повторений до 2. Нажмите кнопку OK [рис. 4].
- Выберите вкладку XY в окне фокус. Дважды проверьте параметры лазерного из шага 2 в закладке добавлены [рис. 3, рис. 4]. Установите параметры лазерного photoconvert клетки интереса без photoconversion окружающих клеток.
- Если присутствует photoconversion смежных ячеек, уменьшите мощность лазера. Если не происходит photoconversion клеток, лазерной полномочий может быть увеличена. Оптимально установите мощность лазера photoconvert только региона интерес и не прилегающих районов.
- Установите флажок timelapse под захват типа. Нажмите кнопку начать [Рисунок 6A].
- После того, как откроется окно жить timelapse, выберите инструмент «круг» на верхней панели инструментов [Рисунок 7]
- Нарисуйте круг в регионе пища ячейки. Щелкните правой кнопкой мыши обращается круг, выберите регион FRAPи ждать 3 секунды. Выделенная область должна стать диммер [рис. 8]. Нажмите кнопку остановить запись.
- Если изображений более чем одного животного, вернитесь на вкладку XY в фокус меню и выберите позицию 2. Затем повторите шаги 4.1-4.6.
- Чтобы преобразовать популяция клеток, следуйте протокол и лазерной параметры для действия 4.1-4.4, за исключением вместо рисования круга FRAP региона интерес, используйте инструмент «линия». Нарисуйте линию на области интереса и FRAP региона, используя те же параметры, перечисленные выше.
4. пост photoconversion изображений
- После того как все точки photoconverted. Выберите стек лаборатории конкретных стандартных изображений, установка описана в precoversion изображений шаг 3. Это находится под захват, установив раскрывающегося вкладки в окне захвата [рис. 5].
- Выберите c488 лазера и установить экспозицию до 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [Рисунок 2].
- Выберите c541 лазер находится в том же меню как лазер c488. Установить экспозицию до 500 мс, мощность до 10 лазера и активизировать до 75 [рис. 9].
- В разделе записи тип установите флажок 3D. В разделе 3D захвата выберите использовать текущую позицию и проверьте диапазон вокруг тока. В этом же разделе Установите диапазон до 35, количество самолетов до 36 и размер шага 1. Номер диапазона может возрастать или уменьшаться для размещения на желаемую глубину визуализации [рис. 5].
- Если существует несколько точек на вкладке фокус XY, выберите вариант многоточечные список в окне захвата. Если нет, выберите текущее местоположение.
- Нажмите кнопку Пуск в нижней части окна захвата получить изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photoconversion флуоресцентных белков может использоваться для обозначения отдельных клеток внутри ткани6. Чтобы продемонстрировать это, Tg(sox10:eos) рыбы9 были использованы для выражения протеина photoconvertible Eos под регулирования последовательности sox10. Tg(sox10:eos) животных на 48 hpf были впервые установлены, а затем образ для обнаружения любых неспецифические photoconversion, которые могут иметь место. Eos необращенный флуоресцентного сигнала с мало Eos photoconverted флуоресцентного сигнала был затем визуализирована (Рисунок 10). Животные находились в темноте, чтобы убедиться, что неспецифические photoconversion минимальна. Затем регионы интереса подвергаются УФ света с помощью настройки конфокального микроскопа. Чтобы подтвердить, что отдельные клетки были photoconverted в результате воздействия УФ, мы взяли z стеки области, охватывающей photoconverted региона. В соответствии с успешным photoconversion, там было мало обнаружение не преобразован Eos вне области интереса и photoconverted Eos явно присутствовал в пределах области интереса. Результирующего изображения показывает одну ячейку в пределах ганглия, которая обозначена определенно от своих соседей (Рисунок 10).
Чтобы продемонстрировать полезность этой техники photoconversion, популяция клеток также подвергается УФ света. В этой парадигме pre-photoconversion изображения были взяты и нет сигнала Eos ООН photoconverted присутствовал. Далее вентральной стороне спинного подвергалась воздействию УФ линии (рис. 11). Для подтверждения успешной photoconversion, пост photoconversion изображения были взяты и photoconverted Eos в клетках вентральной спинного мозга в месте расположения линии интерес, который мы нарисовали были визуализированы (Рисунок 11). Non-photoconverted Eos сигнал был виден во всех других областях. Распространить эту технику мы затем взял одинаковых изображений через 24 часа после photoconversion. В этих образах photoconverted Eos+ клетки были замечены разбросаны во всем регионе спинного мозга в спинной и брюшной местах (Рисунок 12). Эти данные согласуются с гипотезой, что брюшной клеток спинного мозга переехал в спинной места, как ранее описанных10. Вместе эти две техники продемонстрировать что photoconversion Eos могут быть использованы для визуализации единичных клеток или популяции клеток в пределах региона ткани в форме, определяемой пользователем. Это способствовало более глубокому пониманию характеристик клеточной миграции клеток, коммуникации и динамика.
Рисунок 1 : Захват и сосредоточиться Windows. Снимок экрана с изображением расположение окна захвата и фокус и лаборатории конкретных «Рыба удалять полный чип» раскрывающегося вкладки программного обеспечения. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : параметры лазерного c488. Скриншот захвата окна показаны конкретные параметры для лазерной c488. Выдержка — это 5 300 г-жа мощность лазера. Активизировать 75. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Параметры лазерного Photoconversion. Скриншот добавлены вкладки в окне фокус с изложением конкретных лазерного параметры необходимые для photoconversion. Laserstack мощность-2. Дважды щелкните размер равен 4. Растровый размер блока равен 1. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Расширенные параметры лазерного Photoconversion. Скриншот передовые лазерные параметры в окне захвата. Это открывает окно настройки захвата с вкладкой добавлены. Дважды щелкните повторов равным 2. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Предварительное преобразование визуализации параметров. Скриншоты окон фокус и захват. Основные моменты захват окна конкретные параметры, необходимые для предварительного преобразования изображений. Установка захвата является «Рыба изображений.» В 3D установлен флажок под тип захвата. И захвата 3D параметры задаются в виде; Диапазон составляет 35, число самолетов 36, шаг размер равен 1, и смещение -15. «Текущее положение» и «диапазон вокруг ток» коробки также будут выбраны. Увидеть красные коробки. Изображает, как выбрать одну или несколько точек на окно захвата (слева) и для выбора отдельных точек на фокус окна (справа). Смотрите зеленый коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Открытие окна Photoconversion. Снимок экрана с изображением timelapse захвата тип выбирается в соответствии с ранее установленные параметры. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Настройка Photoconversion. Скриншот с указанием местоположения круг инструмент (вверху) и захвата управления окно, которое появляется (справа). Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Одной ячейки Photoconversion. Скриншот, изображающие использование инструмента photoconversion круг и правой кнопкой мыши выпадающем меню. Действия преобразования «FRAP всех регионов» расположен в правой кнопкой мыши меню падения вниз. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9 : Параметры пост-Photoconversion c561Laser. Скриншот захвата окна показаны конкретные параметры для лазерной c561. Выдержка — это 10 500 г-жа мощность лазера. Активизировать 75. Увидеть красные коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10 : Одной ячейки Photoconversion. (A). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 hpf показаны Спинной корень ганглиев в периферической нервной системе до photoconversion. Пунктирная линия показывает приблизительное местоположение DRG спинного вступления... (B). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 hpf показаны Спинной корень ганглиев в периферической нервной системе во время photoconversion. Пунктирная линия показывает запись спинного DRG. Желтый круг указывает сайт преобразование и освещение болт указывает под действием ультрафиолетовых лучей. (C). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 hpf показаны Спинной корень ганглиев в пост photoconversion периферической нервной системы. Пунктирная линия показывает запись спинного DRG. ЦНС-это аббревиатура для центральной нервной системы и ПНС это аббревиатура для периферической нервной системы (A-C). Линейки шкалы равен 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11 : Photoconversion процедура в больших спинного регионе. (A). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга до photoconversion. Пунктирная линия показывает спинной части спинного мозга. (B). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга во время photoconversion. Сплошная желтая линия показывает выбранную область для photoconversion. Пунктирная линия показывает спинной части спинного мозга. (C). схема и конфокальный z прогнозы данио рерио Tg(sox10:eos) на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга после photoconversion. Пунктирные линии указывают спинной части спинного мозга. Линейки шкалы равен 10 мкм.
Рисунок 12 : Клеточной отслеживания и визуализации пост photoconversion. (A). схема Tg(sox10:eos) данио рерио спинного мозга на 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга после photoconversion. Молния указывает УФ света преобразования. (B). конфокальный z прогнозы Tg(sox10:eos) данио рерио спинного начиная 48 показаны hpf OPCs и спинной корень ганглиев в регионе вентральной спинного мозга после photoconversion. Молния указывает УФ света преобразования. Линейки шкалы равен 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В сложных тканей различные типы клеток организовать в конкретных областях. Недавно были использованы методы для метки отдельных ячеек в этих больших ткани структур1,2,3. Здесь мы показываем, два метода, которые аналогичным образом могут быть использованы для визуализации взаимодействий в одной ячейки и ячейки населения взаимодействия в сложных тканей. Преимуществом метода photoconversion является пространственного управления, ученый имеет отчетливо пометить ячейку. С помощью микроскопа, который имеет возможность предоставления небольших изображений районах внутри окна больших изображений, как малые, как отдельные ячейки или области одиночных клеток могут быть помечены иначе, чем другие клетки. Несколько photoconvertible белки теперь были введены для сообщества, делая это более широкое распространение техника7. С возможностью photoconvert белков внутри клеток ученые использовали этот метод или аналогичных подходов для изучения миграции клеток, клеток и анализа нейронных цепей.
Хотя программное обеспечение и параметры конкретных лазерного являются специфическими для нашей лаборатории, эта статья демонстрирует универсальный возможность использования photoconvertable белка Eos в разграничении отдельные ячейки в пределах ганглия. К сожалению большинство генетических регулирования регионы, которые могут использоваться для привода флуоресцентные белки Экспресс широко в ганглиях на ранних этапах развития. Это, вероятно, потому, что эти клетки формируются из аналогичных прародитель бассейны и маркеры идентифицировать те прародитель государствами-9. Поэтому трудно визуализировать взаимодействие единичных клеток внутри большего ганглиев во время этих ранее этапах своего развития. Подходы, показанный здесь представляет один метод который можно пометить отдельные ячейки в пределах ганглия и таким образом могут быть использованы для того чтобы рассечь научные вопросы о развитии ганглии.
Однако этот метод photoconversion не ограничивается исследования развития ганглии. Например в исследованиях по регенерации, photoconversion дотравматозному условий могут быть использованы чтобы определить как конкретных клеток в ответ ганглия, после травмы. Эти исследования могут помочь в выяснении прародителя как потенциал конкретных клеток ганглия. Аналогично photoconversion конкретных опухолевых клеток и отслеживания этих клеток со временем может выявить свойства единичных клеток внутри комплекса опухоли. Это применение photoconversion одну ячейку таким образом расширяет потенциал технику, чтобы сделать значимых открытий в биомедицинских сообщества.
Этот подход можно также выборочно ярлык клетки в области спинного мозга. В развитии клетки часто мигрируют из районов прекурсоров для производства дифференцированных клеток в зрелых местах11,14. Долгосрочный судьба сопоставления с КРР эффективно использовались для анализировать такие процессы. С методами Cre пространственное разрешение ограничивается геномной регулирования регионов, которые водить Cre транскрипции15. С photoconversion наряду с возможностью выбрать время, когда происходит photoconversion и временное разрешение может быть достигнуто это пространственное разрешение. Таким образом за короткий срок судьба сопоставления, этот метод photoconversion имеет много преимуществ над Cre судьба сопоставления. Однако в образцах, где УФ света не может быть достигнут легко, как нетронутыми мыши, этот photoconversion подход вряд ли работать15. Кроме того КРР судьба картирование постоянно этикетки клетки позволяет для более долгосрочной судьбе сопоставления чем photoconversion, что теряет его метку версии photoconverted белка рассеивается и новые необращенный белка производится в ячейке. Тем не менее в зависимости от научной вопрос, photoconversion может быть полезным инструментом для судьбы картирование клеточных популяций.
Хотя предоставляются только два примера применения photoconversion, многочисленные исследования показали свою эффективность. В зависимости от пространственной точностью, требуемой photoconversion могут быть выполнены с доступом к источнику света UV. Если желание для обозначения единый расширенный визуализации как конфокальный или два Фотон микроскопии клетки может оказаться необходимым. Тем не менее возможность выбора пространственных и временных области помеченных клеток отчетливо из других ячеек в неповрежденной ткани сделал УФ индуцированной photoconversion мощный метод для того чтобы рассечь биологических вопросов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Бернард Kulemaka и члены лаборатории Смит за их полезные комментарии и руководство реагента, Sam Connell и Brent Redford 3i для Филдинг изображений вопросы и Дебора Bang, Карен прислушаться и Кей Стюарт для данио рерио ухода. Эта работа была поддержана в Университете Нотр-Дам, Элизабет и Майкл Галлагер семьи, Альфред P. Sloan фонд, центр данио рерио исследований в Университете Нотр и центр стволовых клеток и регенеративной медицины в Университете Нотр Дама. Все исследования на животных были сделаны в соответствии с Университет Нотр-Дам IACUC доктор Коди Смит.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
