Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以显示如何实现细胞 photoconversion 是通过紫外线照射到特定区域表达荧光蛋白, Eos, 在活体动物。
Abstract
动物和植物组织由细胞的不同的人口组成。这些细胞随着时间的推移相互作用, 以建立和维持组织, 并可能导致疾病时中断。科学家们通过在细胞子集中表达荧光蛋白, 开发出巧妙的技术来研究这些细胞在完整组织中的特性和自然动力学。然而, 有时, 实验需要更多的细胞在组织内的可视化, 有时候是在单细胞或细胞群的方式。为了实现这一目标, 并在细胞中显示单个细胞, 科学家们利用了荧光蛋白的单细胞 photoconversion。为了演示这项技术, 我们在这里展示了如何将紫外线照射到一个在完整的、活的斑马鱼身上表达出感兴趣的 Eos 细胞。然后, 我们在24小时后对那些 photoconverted Eos+单元格进行映像, 以确定它们在组织中的变化。我们描述了两种技术: 单细胞 photoconversion 和 photoconversions 的细胞群。这些技术可用于可视化细胞相互作用, 细胞命运和分化, 细胞迁移, 使其成为一种技术, 适用于许多生物学问题。
Introduction
多个不同的细胞相互作用, 建立和维持复杂的动物和植物组织。这些细胞往往是夹层和难以区分与邻居在一个单一的细胞水平没有高分辨率显微镜, 需要固定的组织。然而, 要了解这些组织是如何形成的, 如何保持, 并成为病态, 就必须研究组织内的单个细胞在一段时间内是如何相互作用的。理想情况下, 这些实验要求在不需要固定的情况下, 用非侵入性的方式对组织内的单个细胞进行标记。科学家们现在已经开发了许多技术来完成这个任务1,2,3,4。
水母绿色荧光蛋白 (GFP) 的发现和实施是一种令人兴奋的方法, 允许在组织环境1中标记不同的细胞。使用特定于单元格的启动器, 可以从遗传学上选择标记为1的单元格子集。或者, 病毒诱导的 gfp 表达可以用于 gfp3,4的用户选择的表达式。虽然很有用, 基因介导的 GFP 表达不允许用户选择的表达在组织中的细胞子集;和病毒表达的 GFP, 虽然有利, 可侵入。随着 GFP 衍生物的出现和像 Brainbow 这样的巧妙的技术, 在组织中表达出不同的荧光蛋白更稀少, 它已经成为可能的可视化单个细胞和它们之间的相互作用在复杂的组织2,5. 但是, 这些方法以随机方式标记单元格。如果所需的实验需要对实验者定义的单个细胞或细胞的数量进行可视化, 那么它们是有限的。通过这样的实验 , 有一个基因表达的荧光蛋白 , 可以纵 , 以区别 , 在一个单一的细胞的方式 , 它从其他荧光和非荧光细胞 , 这将是有利的。
为了实现这一目标, 并可视化一个复杂的活体组织内单细胞生物学, 科学界使用的单一细胞 photoconversion 的独特的荧光蛋白6,7,8。使用 photoconvertible 蛋白的基因控制表达 (即, eos, 枫等), 当暴露于紫外线 (488 nm) 光时, 从绿色到红色荧光状态过渡, 我们可以区分单个细胞与它的荧光标记邻居6,7,8。这种方法利用连接到我们共焦显微镜的仪器, 它可以将激光栈中的光定向到感兴趣的衍射有限区域。使用此技术, 我们可以用用户定义的方式 (9、10、11) 来标记单个单元格或更大的填充。这项技术是微创与单细胞注射的病毒 GFP。作为概念的证明, 我们表明, 我们可以 photoconvert 在神经节内的单个细胞在周围神经系统和 photoconvert 更大的人群, 如位于脊髓腹侧的细胞9,10, 11,12。然后, 我们可以想象这些 photoconverted 细胞群24小时后, 以了解他们的运动和分化过程中的发展。
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Protocol
所有动物研究都是由圣母大学机构动物保育和使用委员会批准的。
1. 斑马鱼标本的制备
- 将一个成年男性和一个成年女性 Tg (可转换蛋白) 放入每个标准过程的交配室13。在这篇手稿中, 使用 Tg (sox10: eos) 鱼9由于访问, 但其他转基因线与 photoconvertible 蛋白可以同样使用。设置一个以上的房间, 以防鱼不下蛋。允许鱼一夜之间留在房间里。
- 第二天早上, 在100毫米培养皿中收集鸡蛋。在筛查前允许卵成熟到24小时后受精 (hpf)。
- 如果上面的动物是杂合子的转基因, 屏幕 24 hpf 菜肴为 Tg (sox10: eos) + 胚胎与 488 nm 光源和 GFP 过滤器集在解剖显微镜。分离 Tg (sox10: eos) + 胚胎, 并允许成熟到 48 hpf。
- 用针或镊子手动 Dechorionate 胚胎。
- 准备和微波5毫升的0.8% 低熔点琼脂糖溶液。
- 一旦琼脂糖是凉爽的触摸, 地方3-4 麻醉 Tg (sox10: eos) + 48 hpf 鱼的中心10毫米玻璃盖玻片底部培养皿。
- 添加足够的琼脂糖, 以覆盖盖玻片的表面, 大约1毫升。用探针针在它们的两侧排列鱼。允许琼脂糖固化以确保动物的安装。可能需要不断重新安排斑马鱼, 直到琼脂固化14。凝固需要大约2分钟。
- 琼脂糖凝固2分钟后, 慢慢加入含有0.02% 苯甲酸酸酯 (Tricaine) 的胚培养基, 直到琼脂和盘子的底面被淹没。这应该是大约3mL。
2. 显微镜安装和预转换成像
- 打开共焦软件并选择捕获和焦点窗口 [图 1]。在 "捕获" 窗口下, 选择 "捕获设置" 下拉选项卡下的实验室特定的转换成像设置 [图 1]。在这里, 实验室特定的设置称为 "鱼映像"。
- 将标本放在共聚焦范围内, 使用过程和微调旋钮将试样聚焦。
- 打开焦点窗口, 找到所需的感兴趣区域 (即背根神经节)。
- 在 "过滤器集" 菜单下选择 c488 激光器。将曝光率设置为300毫秒, 激光功率为 5, 并增强为 75 [图 2]。
- 选中捕获类型部分下的3D 框。在3D 捕获部分中, 选择使用当前位置并在当前周围检查范围。在同一节中, 将范围设置为 35, 将平面数设为 36, 并将步长调整为1。范围可以增加或减少, 以适应成像区域的深度。对于脊髓, 35-40 栈之间的范围值通常是足够的 [图 5]。
- 选择当前位置 [图 5]。
- 单击 "捕获" 窗口底部的 "开始" 以获取图像。
3. 单细胞 Photoconversion
- 打开共焦软件并选择捕获和焦点窗口 [图 1]。在 "捕获" 窗口下, 选择 "捕获设置" 下拉选项卡下的实验室特定的转换成像设置 [图 1]。在这里, 实验室特定的设置称为 "鱼消融全芯片。
- 在 "过滤器集" 菜单下选择 c488 和 c541 激光器。如果不使用相同的显微镜软件, 找到菜单选择不同的激光器, 并选择 488 nm 和 541 nm 激光器。将曝光设置为300毫秒, 激光功率为 5, 并增强为 75 [图 2]。这些激光设置是根据产生足够的荧光信号而不引起漂白或毒性而选择的。如果毒性或漂白可视化, 减少激光功率或曝光。
- 打开焦点窗口, 然后单击 "焦点" 窗口中的 "photomanipulation" 选项卡。相应地调整激光参数。将激光堆栈电源更改为 2, 然后单击转到。将光栅块大小更改为 1, 然后单击设置。请将双击大小更改为4。将激光线更改为 v405 [图 3]。
- 在 "捕获" 窗口中打开高级捕获设置。选择 "photomanipulation" 选项卡, 然后将双击重复次数更改为2。单击 "确定" (图 4)。
- 在焦点窗口中选择 XY 选项卡。双击 photomanipulation 选项卡中的步骤2中的激光参数 [图 3,图 4]。设置激光设置, 以 photoconvert 细胞的兴趣, 没有 photoconversion 的周围细胞。
- 如果相邻细胞 photoconversion 存在, 则减少激光功率。如果 photoconversion 细胞不发生, 激光功率可以增加。优选地, 设置激光功率 photoconvert 仅感兴趣的区域和不附近区域。
- 选中捕获类型下的 timelapse 框。然后, 单击开始[图 6A]。
- 打开 "实时 timelapse" 窗口后, 选择顶部工具栏上的 "圆圈" 工具 [图 7]
- 在单元格的靠近中心区域中绘制一个圆。右键单击绘制的圆圈, 选择酶区域, 然后等待3秒。选定区域应变暗 [图 8]。单击停止捕获。
- 如果成像多个动物, 请返回焦点菜单中的 XY 选项卡, 然后选择 "位置 2"。然后, 重复步骤 4.1-4.6。
- 要转换单元格的数量, 请按照步骤 4.1-4.4 中的协议和激光参数进行操作, 但不要绘制一个圆来酶感兴趣的区域, 请使用 "线条" 工具。在感兴趣的区域上绘制一条线, 并使用上面列出的相同参数酶区域。
4. photoconversion 后成像
- 一旦所有的点都 photoconverted。选择 precoversion 映像步骤3中描述的实验室特定的标准图像堆栈设置。这是在捕获窗口的 "捕获设置" 下拉选项卡下找到的 [图 5]。
- 选择 c488 激光器并将曝光设置为 300ms, 激光功率为 5, 并加强到 75 [图 2]。
- 选择与 c488 激光器在同一菜单下发现的 c541 激光器。将曝光率设置为500毫秒, 激光功率为 10, 并增强为 75 [图 9]。
- 选中捕获类型部分下的3D 框。在3D 捕获部分中, 选择使用当前位置并检查当前范围。在同一节中, 将范围设置为 35, 将平面数设为 36, 并将步长调整为1。范围数可能会增加或减小以适应所需的图像深度 [图 5]。
- 如果 "XY 焦点" 选项卡中有多个点, 请在 "捕获" 窗口中选择 "多位列表" 选项。如果没有, 请选择 "当前位置"。
- 单击 "捕获" 窗口底部的 "开始" 以获取图像。
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Representative Results
Photoconversion 荧光蛋白可用于标记组织中的不同细胞6。为了证明这一点, Tg (sox10: eos)鱼9被用来表达 photoconvertible 蛋白 eos 下的调节序列sox10。Tg (sox10: eos)动物在 48 hpf 第一次安装, 然后成像, 以检测任何可能发生的非特定 photoconversion。然后, 将 eos 未转换的荧光信号与小 Eos photoconverted 荧光信号进行可视化 (图 10)。动物被保存在黑暗中, 以确保非特定的 photoconversion 是最小的。然后, 利用共焦显微镜的建立, 将感兴趣的区域暴露在紫外线照射下。为了确认单个细胞由于紫外线照射而 photoconverted, 我们采取了跨越 photoconverted 地区的 z 栈。与成功的 photoconversion 一致的是, 在感兴趣的区域之外没有被转换的 eos 的发现, 并且 photoconverted eos 在感兴趣的区域清楚地存在。由此产生的图像显示一个神经节内的单个单元格, 它的标记肯定来自其邻居 (图 10)。
为了证明这种 photoconversion 技术的实用性, 细胞的数量也暴露在紫外线照射下。在这个范例中, 拍摄了预 photoconversion 图像, 没有 photoconverted 的 Eos 信号存在。其次, 脊髓的腹侧被暴露在紫外线下使用一条线 (图 11)。为了确认成功的 photoconversion, photoconversion 后的图像被采取, 并在腹脊髓细胞 photoconverted Eos 在我们绘制的兴趣线的位置可视化 (图 11)。非 photoconverted Eos 信号在所有其他区域都可见。为了扩展这种技术, 我们在 photoconversion 24 小时后拍摄了相同的图像。在这些图像中, photoconverted Eos+细胞被看到散落在脊髓区域的背部和腹部位置 (图 12)。这些数据符合假设, 即腹侧脊柱细胞重新定位到背部的位置, 如前所述的10。这两种技术结合在一起, 证明了 Eos 的 photoconversion 可以用来在一个组织区域内以用户定义的方式来可视化单个细胞或细胞的数量。这有助于更好地理解细胞迁移、通讯和动力学等细胞特性。
图 1: 捕获和焦点窗口.屏幕截图的软件描绘的位置捕获和焦点窗口和实验室特定的 "鱼消融全芯片" 下拉标签。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: c488 激光参数.捕获窗口的截图, 显示 c488 激光器的特定参数。曝光率为300毫秒, 激光功率为5。强化是75。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: Photoconversion 激光参数."焦点" 窗口中 "photomanipulation" 选项卡的屏幕快照, 概述了 photoconversion 所需的特定激光设置。Laserstack 功率为2。双击 "大小" 为4。光栅块大小为1。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 高级 Photoconversion 激光参数.捕获窗口中高级激光设置的截图。这将使用 "photomanipulation" 选项卡打开到 "捕获首选项" 窗口。双击重复设置为2。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 预转换成像参数.屏幕截图的焦点和捕捉窗口。突出显示预转换图像所需的捕获窗口特定参数。捕获设置为 "鱼映像"。在捕获类型下检查3D 框。和3D 捕获设置指定为;范围为 35, 平面数为 36, 步长为 1, 偏移量为-15。还选择了 "当前位置" 和 "当前范围" 框。看到红色的盒子。描述如何在 "捕获" 窗口 (左) 上选择单个或多个点, 以及如何在焦点窗口 (右) 上选择单个点。看到绿色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 打开 Photoconversion 窗口.根据先前设置的参数选择了描述 timelapse 捕获类型的截图。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 设置 Photoconversion.显示 "圆" 工具 (顶部) 位置和显示 (右) 的捕获控制窗口的屏幕截图。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 单单元格 Photoconversion.屏幕截图, 描绘了圆圈 photoconversion 工具的使用和右击下拉菜单。"酶所有区域" 转换操作位于右击下拉菜单中。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 后 Photoconversion c561Laser 参数.捕获窗口的截图, 显示 c561 激光器的特定参数。曝光率为500毫秒, 激光功率为10。强化是75。看到红色的盒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: 单单元格 Photoconversion.(A). Tg (sox10: eos)斑马鱼的示意图和共聚焦 z 投影在 48 hpf 显示在 photoconversion 前周围神经系统的背根神经节。虚线表示根背节脊髓进入的近似位置。(B). Tg (sox10: eos)斑马鱼的示意图和共聚焦 z 投影在 48 hpf 显示 photoconversion 期间周围神经系统的背根神经节。虚线表示背根脊柱脊髓进入。黄色圆圈表示转换站点和照明螺栓表示 UV 光曝光。(C). Tg (sox10: eos)斑马鱼的示意图和共聚焦 z 投影在 48 hpf 显示 photoconversion 后周围神经系统的背根神经节。虚线表示背根脊柱脊髓进入。CNS 是中枢神经系统的简称, 而三七总苷是周围神经系统的简称 (-c)。缩放条等于 10 um。请单击此处查看此图的较大版本.
图 11: 在较大的脊髓区域 Photoconversion 过程.(A). Tg (sox10: eos)斑马鱼的示意图和共聚焦 z 投影在 48 hpf 显示在 photoconversion 前脊髓腹区的 OPCs 和背根神经节。虚线表示脊髓背侧区域。(B). Tg (sox10: eos)斑马鱼的示意图和共聚焦 z 投影 48 hpf 显示 photoconversion 期间脊髓腹区的 OPCs 和背根神经节。实心黄线表示 photoconversion 的选定区域。虚线表示脊髓背侧区域。(C). Tg (sox10: eos)斑马鱼的示意图和共聚焦 z 投影在 48 hpf 显示 photoconversion 后脊髓腹区的 OPCs 和背根神经节。虚线表示脊髓的背侧区域。缩放条等于 10 um。
图 12: 细胞跟踪和可视化后 photoconversion.(A). Tg (sox10: eos)的示意图 48 hpf 的斑马鱼脊髓, 显示 photoconversion 后脊髓腹区 OPCs 和背根神经节。闪电指示 UV 光转换。(B). Tg (sox10: eos)斑马鱼脊髓的共聚焦 z 投影 48 hpf 开始于 photoconversion 后脊髓腹区的 OPCs 和背根神经节。闪电指示 UV 光转换。缩放条等于 10 um。
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Discussion
在复杂组织中, 不同的细胞类型组织成特定的领域。最近的技术已经被用来标记这些大型组织结构中的单个细胞1,2,3。在这里, 我们演示了两种技术, 同样可以用来可视化的单细胞相互作用和细胞群的相互作用, 在复杂的组织。photoconversion 技术的优势在于, 科学家必须对细胞进行清晰的标记。借助显微镜, 它能够在较大的成像窗口中暴露较小的成像区域, 像单个细胞或单个细胞区域这样小的区域可以被标记为不同于其他细胞。现在已向社区引入了多种 photoconvertible 蛋白, 使之成为一种更广泛的技术7。在细胞内 photoconvert 蛋白质的能力下, 科学家们利用这种技术或类似的方法来研究细胞迁移、细胞分化和神经回路分析。
虽然软件和特定的激光参数是特定于我们的实验室, 本文展示了普遍的能力, 使用 photoconvertable 蛋白 Eos, 以区分单个细胞内的神经节。不幸的是, 大多数可用于驱动荧光蛋白的基因调控区域在早期发育阶段广泛地表达在神经节内。这很可能是因为这些单元格是从相似的祖池生成的, 标记标识这些祖状态9。因此, 在这些早期发育阶段, 很难想象在大神经节中单个细胞的相互作用。这里所示的方法是一种可以标记神经节内单个细胞的技术, 因此可以用来解剖神经节发育的科学问题。
然而, 这种 photoconversion 技术并不局限于神经节发育的研究。例如, 在再生研究中, photoconversion 损伤前的条件可以用来确定神经节内特定细胞在损伤后的反应。这些研究可以帮助阐明神经节中特定细胞的祖样电位。同样, 特定肿瘤细胞的 photoconversion 和这些细胞的跟踪时间可以揭示复杂肿瘤中单个细胞的特性。因此, 单细胞 photoconversion 的应用扩大了该技术在生物医学界进行有意义发现的潜力。
这种方法还可以选择性地标记脊髓区域内的细胞。在开发中, 细胞经常从前体区域迁移到在成熟位置产生分化的细胞11,14。长期的命运映射与创可有效地用于解剖这些过程。有了这项技术, 空间分辨率仅限于驱动该转录的基因组调控区域 (15)。与 photoconversion, 这个空间分辨率可以实现, 同时有能力选择的时间时, photoconversion 发生和时态分辨率。因此, 对于较短的命运映射, 这种 photoconversion 技术在命运映射方面具有诸多优势。但是, 在无法轻松实现 UV 光的示例中, 如在完整的鼠标中, 此 photoconversion 方法不太可能工作15。此外, photoconversion 的命运-映射永久标签细胞允许更长期的命运映射比失去其标签的 photoconverted 版本的蛋白质消散和新的未转换蛋白是由细胞产生。然而, 根据科学问题, photoconversion 可能是一个有用的工具, 命运-地图的细胞群。
虽然仅提供了 photoconversion 应用的两个例子, 但许多研究表明了它的有效性。根据所需的空间精度, photoconversion 可以使用 UV 光源进行访问。如果想要对单个细胞进行标记, 则可能需要更高级的成像, 如共焦或双光子显微术。然而, 在一个完整的组织中, 从其他细胞中选择标记细胞的空间和时间区域的能力使得紫外线诱导 photoconversion 成为解剖生物学问题的有力技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢伯纳德 Kulemaka 和史密斯实验室的成员为他们提供有用的评论和试剂指导, Sam 康奈尔和布伦特. 雷德福3i 的成像问题和黛博拉砰, 凯伦注意和凯斯图尔特为斑马鱼护理。这项工作得到了圣母大学、伊丽莎白和迈克尔？加拉格尔家族的支持, 在巴黎圣母院, 圣母大学斑马鱼研究中心, 圣母大学的干细胞和再生医学中心。圣母.所有动物研究都是按照圣母大学 IACUC 博士的要求进行的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
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