Summary
ここでは、蛍光蛋白質、Eos、生きている動物の表現する特定の領域に紫外線暴露により光電セルを達成する方法を表示するためのプロトコルを提案する.
Abstract
動物や植物の組織細胞の異なる集団で構成されます。これらの細胞と組織を維持・構築に時間をかけて対話中断されるとき病気を引き起こすことができます。科学者は、細胞のサブセットに蛍光蛋白質を表現することによって特徴とそのまま組織内でこれらの細胞の自然動態を調査するためのテクニックを開発しました。しかし、時は、実験は時単一細胞または細胞の人口のように、組織内の細胞より選択した可視化する必要があります。科学者はこれを実現し、セルの人口内の単一のセルを可視化する蛍光タンパク質の単一セルの光電を活用しています。このテクニックを示すためには、方法を示しますここをそのまま、興味の Eos を表現する細胞に UV ライトを指示するゼブラフィッシュの生活します。私たちは、どのように彼らは組織の変更を確認するそれらの photoconverted Eos+セル 24 時間後をイメージします。二つの手法: 単一セルの光電とセルの人口の photoconversions。これらの技術は、細胞間相互作用、細胞運命と分化、細胞移動、作りそれ多数の生物的質問に適用する技術を視覚化する使用できます。
Introduction
複数の異なる細胞が複雑な動物や植物の組織の維持・構築に対話します。これらの細胞は、インターカ レートとティッシュの固定を必要とする高分解能顕微鏡なしの単一セルのレベルで近所の人から区別することは困難。しかし、どのようにこれらの組織フォームを理解、維持、病気になるには、組織内の単一のセルを調べることが不可欠がされて時間をかけて相互作用しています。理想的には、これらの実験は、固定する必要がなく非侵襲的な方法で組織内の単一セルのラベルを必要とします。科学者は今この作業1,2,3、4を達成するために多数の技術を開発しました。
発見とクラ ゲの緑色蛍光タンパク質 (GFP) の実装は、組織環境1の異なるセルのラベルの 1 つの刺激的なアプローチだった。細胞特異的発現プロモーターを使用して、それは遺伝子1のラベルが付いているセルのサブセットを選択することが可能です。また、GFP3,4のユーザー選択式の GFP の発現するウイルスを利用できます。GFP 発現の遺伝的媒介が; 組織における細胞のサブセットの内でユーザーが選択した式を許可しませんが、非常に便利でき、GFP のウイルス発現が有利な侵襲的です。単一細胞および複雑な組織2,でそれらの間の相互作用を視覚化することが可能なっている GFP 誘導体および Brainbow 組織内よりまばら異なる蛍光蛋白質を表現するような巧妙な技術の出現で、5します。 ただし、これらのアプローチがランダムな方法で細胞をラベルします。目的の実験には、単一細胞の可視化や実験者によって定義されているセルの人口が必要とする場合そのため制限されます。そのような実験と区別する単一のセル方式で操作できる遺伝子発現蛍光タンパク質を持っているに有利であろう他の蛍光・非蛍光性の細胞から。
この目標を達成するため、複雑な生体組織内の単一セルの細胞生物学を視覚化は、科学的なコミュニティは、異なる蛍光タンパク質6,7,8の単一セルの光電を使用します。緑から赤の蛍光状態紫外線にさらされたときに移行蛍光蛋白質 (すなわち、eos、楓等) の表現を制御する遺伝子を使用して (488 nm) 光、我々 は蛍光に分類されたからの単一のセルを区別できます。隣人6,7,8。このアプローチは、回折限界領域にレーザー スタックからライトを指示することができます私たちの共焦点の顕微鏡に接続されている装置を利用しています。この手法により、我々 はどちらか単一セルまたはユーザー定義の方法9,10,11より大きい人口ラベルできます。手法は、ウイルス ・ GFP の単一細胞注射に比べて低侵襲です。Photoconvert 末梢神経系と脊髄9,10の腹側に位置する細胞のようなより大きい人口を photoconvert 神経節内の単一細胞ことを示して我々 の概念の証拠として 11,12。彼らの動きや開発中に分化に洞察力を得るためにこれら photoconverted のセル人口 24 h 後、視覚化できます。
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Protocol
すべての動物の研究は、ノートルダム大聖堂機関動物ケアおよび使用委員会の大学によって承認されました。
1. ゼブラフィッシュ標本の作製
- 標準的な手順13あたり交尾商工会議所にオス一匹と 1 つアダルト女性 Tg (転換タンパク質) を配置します。本稿では、Tg(sox10:eos) 魚9アクセスが蛍光蛋白質と他の形質転換線を同様に使用することができますを使用します。魚では、配置を行う場合に 1 つ以上の区域を設定します。一晩部屋のままに魚を許可します。
- 次の朝は、100 mm のペトリ皿に卵を収集します。上映前に卵を成熟させ 24 時間後受精 (hpf) を許可します。
- 上記の動物の遺伝子のヘテロ接合体なら、Tg(sox10:eos) + 488 nm 光源と GFP と胚の画面 24 hpf 料理は解剖顕微鏡のセットをフィルターします。Tg(sox10:eos) + 胚を分離でき、48 に成熟する hpf。
- 針やピンセットを使って手動で Dechorionate 胚。
- 準備、0.8% 低溶解点アガロース溶液の 5 mL を電子レンジします。
- Agarose が touch にクール、場所 3-4 麻酔 Tg (sox10:eos) +48 10 mm のガラス基板の中央に hpf 魚底シャーレ。
- カバーガラス、約 1 mL の表面をカバーする十分な agarose を追加します。探針を使用すると、その両側に魚を配置できます。動物の取付を確実に固めるための agarose を許可します。寒天の凝固14まで、ゼブラフィッシュを継続的に再配置する必要があります。凝固は約 2 分です。
- 2 分の agarose が凝固した後、ゆっくりと胚培 0.02% アミノ安息香酸エステル (Tricaine) 寒天や皿の底面を水中まで皿を追加します。これは、約 3 mL をする必要があります。
2. 顕微鏡取り付けと事前変換イメージング
- 共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャ、フォーカス ウィンドウ [図 1] を選択します。キャプチャ ウィンドウの下には、[キャプチャ設定] タブ [図 1] ドロップダウン ラボ固有の変換イメージング設定を選択します。ここでは、ラボ固有の設定「魚イメージングします」と呼びます
- 共焦点範囲に試験片を置き、コースと微調整ノブを使用してフォーカスに。
- フォーカス ウィンドウを開き、興味 (すなわち後根神経節) の目的の地域を探します。
- C488 レーザー フィルターを設定] メニューの [を選択します。300 ms に露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。
- キャプチャの種類] セクションの [3 D] ボックスを確認します。[ 3 D キャプチャ] セクションで、現在の位置を使用してを選択し、電流のまわりの範囲をチェックします。同じセクションの範囲を 35、36、飛行機と 1 ステップ サイズの数に設定します。範囲を増加またはイメージング領域の深さに対応して縮小することができます。脊髄の間 35-40 スタック範囲の値は通常、[図 5] は。
- [図 5] の現在の場所を選択します。
- 画像を取得するには、[キャプチャ] ウィンドウの下部に [開始。
3. 単一セルの光電
- 共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャ、フォーカス ウィンドウ [図 1] を選択します。キャプチャ ウィンドウの下には、[キャプチャ設定] タブ [図 1] ドロップダウン ラボ固有の変換イメージング設定を選択します。ここでは、ラボ固有の設定は「魚は全チップを切除」と呼ばれる
- C488 c541 レーザー フィルターを設定] メニューの [を選択します。同じ顕微鏡のソフトウェアを使用していない場合、は、別のレーザーと選択、488 nm と 541 nm のレーザーを選択するメニューを見つけます。300 ms への露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。これらのレーザーの設定は、退色または毒性を引き起こすことがなく十分な蛍光シグナルを生成に基づいて選択されます。毒性や退色が視覚化されるレーザー パワーや露出を減らします。
- フォーカス ウィンドウを開き、フォーカス ウィンドウの [photomanipulation] タブをクリックします。レーザーのパラメーターを調整します。2、スタックのレーザー出力を変更しをクリックしてGo。ラスター ブロック サイズを 1 に変更し、設定をクリックします。ダブルクリックしてサイズを 4 に変更します。レーザー ラインを v405 に変更 [図 3]。
- キャプチャ ウィンドウの高度なキャプチャ設定を開きます。[Photomanipulation] タブを選択し、ダブルクリックして繰り返しを 2 に変更します。[図 4] [ok] をクリックします。
- フォーカス ウィンドウで、[XY] タブを選択します。[図 3,図 4] の [photomanipulation] タブで手順 2 からレーザーのパラメーターを再確認してください。Photoconvert なく周囲のセルの光電細胞にレーザーの設定を設定します。
- 隣接するセルの光電が存在する場合は、レーザー出力を下げます。セルの光電が発生しない場合は、レーザーを増やすことができます。最適な photoconvert 興味のない周辺地域のみにレーザーの出力を設定します。
- タイムラプスをオンにすると、下の種類をキャプチャします。[図 6A] を開始をクリックします。
- ライブ タイムラプス ウィンドウが開いたら、[図 7] の上部のツールバーで、[円] ツールを選択します。
- セルの中央地域で円を描きます。引かれた円を右クリックして、 FRAP 地域を選択し、3 秒間待ちます。選択した領域は暗くなるべき [図 8]。キャプチャを停止をクリックします。
- 1 つ以上の動物をイメージングする場合フォーカス メニューと選択位置 2 [XY] タブに戻ります。手順 4.1 4.6 を繰り返します。
- セルの人口を変換するには、手順 4.1 4.4 FRAP 関心領域は、線ツールを使用して円を描くのではなくのプロトコルおよびレーザーのパラメーターします。関心領域に直線を描くし、上記の同じパラメーターを使用して、領域を FRAP します。
4. ポスト光電イメージング
- すべてのポイントが photoconverted です。Precoversion イメージング手順 3 に記載されている設定ラボ固有の標準画像のスタックを選択します。これは、キャプチャ キャプチャ ウィンドウ [図 5] タブのドロップダウンの設定下にあります。
- C488 レーザーを選択し ms に露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。
- C488 レーザーと同じメニューの下にある c541 レーザーを選択します。500 ms に露出を設定、レーザーの電源を 10、および 75 [図 9] を強化します。
- キャプチャの種類] セクションの [3 D] ボックスを確認します。[ 3 D キャプチャ] セクションで、現在の位置を使用してを選択し、電流のまわりの範囲をチェックします。同じセクションの範囲を 35、36、飛行機と 1 ステップ サイズの数に設定します。増加または [図 5] 希望のイメージング深さに合わせて減少する範囲数。
- XY フォーカス] タブで複数のポイントがある場合は、キャプチャ ウィンドウでマルチポイント リスト オプションを選択します。ない場合は、現在の場所を選択します。
- 画像を取得するには、[キャプチャ] ウィンドウの下部に [開始。
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Representative Results
組織6内の個別のセルにラベルを付けるには、蛍光タンパク質の光変換を使用できます。これを示すには、 Tg(sox10:eos)魚9 sox10の規制のシーケンス下の蛍光蛋白質 Eos を表現する使用されました。48 Tg(sox10:eos)動物 hpf が最初にマウントされていると、可能性があります任意の非特異的光電検出イメージを作成します。未変換の蛍光信号と小さな Eos photoconverted 蛍光信号が当時 Eos 視覚化 (図 10)。動物は、非固有光電は最低限確保するため暗闇の中で保たれました。その後、関心領域は、共焦点顕微鏡のセットアップを使用して紫外線にさらされました。単一セルされた紫外線暴露の結果として photoconverted であることを確認するには、photoconverted 地域にまたがる領域の z スタックしました。成功した光電と一致して、非変換 Eos 関心領域の外のほとんどの検出、photoconverted Eos 関心領域の内ではっきりと存在していた。結果のイメージは、隣国 (図 10) から間違いなくラベルは神経節内の単一セルを示しています。
この光電手法の有用性を示すためには、セルの人口も紫外線にさらされました。このパラダイムで pre 光電画像が撮影され、国連 photoconverted Eos 信号が存在しません。次に、脊髄の腹側はライン (図 11) を使用して紫外線にさらされました。成功した光電を確認するポスト光電画像が撮影され、我々 を描いた興味の線の位置で腹側脊髄細胞の Eos が photoconverted 可視化 (図 11)。非 photoconverted Eos 信号は他のすべての領域で表示されていた。この手法を拡張するには、私たち、同一の画像を取った光変換後 24 時間。これらの画像で photoconverted Eos+細胞が脊髄の背側と腹側の両方の場所 (図 12) 地域も散乱して認められました。これらのデータは記述されている10の以前として場所を背に腹側脊髄細胞が移転仮説と一致しています。一緒にこれらの 2 つの手法を示すその光電 Eos の単一のセルまたはユーザ定義の方法で組織の領域内のセルの人口を視覚化する利用することができます。これは、細胞の移動、コミュニケーション、ダイナミクスなど細胞の特性の理解に貢献しています。
図 1: キャプチャして Windows をフォーカスします。キャプチャおよびフォーカス ウィンドウ、ラボ特定「魚アブレーションにおけるチップ」ドロップ ダウン タブの場所を描いたソフトウェアのスクリーン ショット。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: c488 レーザー パラメーター 。C488 レーザーの特定のパラメーターを示すキャプチャ ウィンドウのスクリーン ショット。露出は 300 さんレーザー パワー 5 です。強化 75 です。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 光電レーザー パラメーター 。アウトラインの特定のレーザー設定フォーカス ウィンドウの [photomanipulation] タブのスクリーン ショットは、光電に必要です。Laserstack 電源は 2 です。ダブルクリック サイズ 4 です。ラスター ブロック サイズは 1 です。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 光電レーザーのパラメーターの詳細設定します。キャプチャ ウィンドウの高度なレーザー設定のスクリーン ショット。[Photomanipulation] タブでキャプチャ設定ウィンドウが開きます。ダブルクリックの繰り返しは 2 に設定されます。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 事前変換パラメーターをイメージングします。フォーカスおよびキャプチャ ウィンドウのスクリーン ショット。事前変換イメージングに必要なキャプチャ ウィンドウの特定のパラメーターを強調表示します。キャプチャ設定は「魚イメージング」キャプチャ タイプの下に 3 D のボックスがチェックされます。3D キャプチャ設定が指定されています。範囲は 35、面の数は 36、ステップ サイズは 1 で、オフセットは-15。「現在位置」と「現在の周りの範囲」ボックスも選択されます。赤いボックスを参照してください。(左) キャプチャ ウィンドウで 1 つまたは複数のポイントを選択する方法、およびフォーカス ウィンドウ (右) の個々 の点を選択する方法を示しています。緑色のボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 光変換ウィンドウを開くします。設定したパラメーターに従って描いたタイムラプス キャプチャ タイプのスクリーン ショットを選択します。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 光変換を設定します。[円] ツール (上) と (右) に表示されるキャプチャ コントロール ウィンドウの位置を示すスクリーン ショット。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 単一セルの光電。サークル光変換ツールと右クリックの使用を描いたスクリーン ショットはドロップ ダウン メニュー。「FRAP すべて地域」変換アクションは、右のドロップ ダウン メニュー内にあります。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: ポスト光電 c561Laser パラメーター 。C561 レーザーの特定のパラメーターを示すキャプチャ ウィンドウのスクリーン ショット。露出は、500 さんのレーザー出力は 10 です。強化 75 です。赤いボックスを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 単一セルの光電。(A). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ光電前に末梢神経系で 48 hpf 示す後根神経節での回路図と共焦点の z-予測。破線は、後根神経節脊髄エントリのおおよその位置を示して.(B). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ光電中に末梢神経系で 48 hpf 示す後根神経節での回路図と共焦点の z-予測。破線は、後根神経節脊髄エントリを示します。黄色の円は変換サイトを表し、照明ボルトは紫外線暴露を。(C). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ末梢神経系ポスト光電で 48 hpf 示す後根神経節での回路図と共焦点の z-予測。破線は、後根神経節脊髄エントリを示します。中枢神経系は中枢神経系の略と PNS は、末梢神経系 (A ~ C) の略。スケール バーでは、10 um と同じです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: 脊髄のより大きい地域の光電プロシージャ。(A). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ 48 hpf 示す Opc と光電前に脊髄の腹側領域に後根神経節での回路図と共焦点の z-予測。破線は、脊髄の背側領域を示します。(B). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ 48 hpf 示す Opc と光電中に脊髄の腹側領域に後根神経節での回路図と共焦点の z-予測。黄色い線は、光変換の選択した領域を示します。破線は、脊髄の背側領域を示します。(C). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ 48 hpf 示す Opc と光電後脊髄の腹側領域に後根神経節での回路図と共焦点の z-予測。破線は、脊髄の背側領域を示しています。スケール バーでは、10 um と同じです。
図 12: 携帯電話の追跡と可視化のポスト光電。(A). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ脊髄 48 hpf 示す Opc と光電後脊髄の腹側領域に後根神経節での概略図。稲妻は、UV 光変換を示します。(B). Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュ脊髄光電以降 48 hpf 示す Opc と脊髄の腹側の地域における後根神経節での共焦点 z 予測。稲妻は、UV 光変換を示します。スケール バーでは、10 um と同じです。
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Discussion
複雑な組織の種類セルは特定のドメインに整理します。最近の技術はこれらの大規模な組織の構造の1,2,の3の内で個々 のセルをラベルに利用されています。単一細胞の相互作用および複雑な組織内で細胞人口の相互作用を視覚化する同様に利用できる 2 つの手法を示します。光電技術の利点は、科学者はセルをはっきりとラベル、空間コントロールです。小さいを公開する機能を持つ顕微鏡とイメージングの領域拡大画像ウィンドウ内で単一のセルまたは単一のセルの領域を他のセルとは異なる分類ことができるような小さな領域を実行します。複数の蛍光タンパク質より広範な技術7を作るこのコミュニティに導入されている今。Photoconvert タンパク質の細胞内に能力を持つ科学者はこの技術や細胞移動、細胞分化と神経回路解析を調べると同様のアプローチを活用しています。
ソフトウェアおよび特定のレーザーのパラメーターが当研究室に固有、神経内の単一のセルを区別するに photoconvertable タンパク質 Eos を使用する普遍的な能力を説明します。残念ながら、ほとんど遺伝的規制の地域発達の初期の段階で蛍光タンパク質を神経節内で広く特急運転するために使用できます。これは、これらの細胞と同様の前駆プールから生成され、マーカーを識別するそれらの前駆状態9ため可能性が高いです。したがって、これら以前の発達段階の中に大きな神経節内の単一セルの相互作用を視覚化することは困難です。ここに示すアプローチは、神経内の個々 のセルにラベルを付けることができます、大脳核開発に関する科学的な質問を解剖する使用することができる 1 つの方法を表します。
しかし、この光電技術は核開発の研究に限定ではありません。たとえば、損傷神経応答内の特定のセルを決定するため、再生の研究で中古損傷条件を利用できます。これらの研究は、神経の特定の細胞の前駆細胞のような可能性を明らかにすることができます。同様に、特定の腫瘍細胞のと時間をかけて、それらのセルの追跡は、複雑な腫瘍内の単一のセルのプロパティを示す可能性があります。単一セルの光電のこのアプリケーションは、したがって医学コミュニティで意味ある発見をする手法の可能性を展開します。
このアプローチも選択的に脊髄の領域内のセルにラベルを付けることができます。開発では、細胞はしばしば成熟した場所11,14に分化した細胞を生成する前駆体領域から移行します。Cre の長期運命マッピングは、このようなプロセスを分析する効率的に利用されています。Cre を用いて、空間分解能はドライブの Cre 転写15ゲノムの規制領域に限定されます。光電と光変換が発生した時刻と時間分解能を選択する機能と共にこの空間分解能を実現できます。したがって、マッピング - 短い言葉は運命、この光電技術は Cre 運命マッピングに比べて多くの利点を持ちます。しかし、紫外線を簡単に実現することはできませんサンプルでのようなそのままのマウス、この光電手法はありません15を動作する可能性が。さらに、Cre 運命マッピングは完全に蛋白質の photoconverted 版が散るし、新しい変換されていないタンパク質が細胞によって生み出されるラベルを失う光電よりもっと長期的な運命のマッピングを可能にする細胞をラベル付けします。それにもかかわらず、科学的な質問に応じて、光電セル人口の運命-マッピングのための有用なツールができます。
光電のアプリケーションの唯一の 2 つの例が、数多くの研究はその有効性を実証しています。必要な空間的な精度に応じて光電は UV 光源へのアクセスを実行できます。単一にラベルを付けるにはより高度な共焦点または 2 光子顕微鏡のようなイメージング細胞が必要かもしれません。それにもかかわらず、そのまま組織内の他のセルからはっきりとラベル付きセルの空間的で、一時的な領域を選択する能力は生物学的質問を解剖する強力な手法 UV 誘起光電を作った。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ベルナール ・ Kulemaka とサム ・ コネルとブレント レッドフォード 3i ゼブラフィッシュ ケアのため画像の質問とデボラ ビッグバン カレン耳を傾ける、ケイ ・ スチュワートの守備のための有用なコメントと試薬指導、スミス研究室のメンバーに感謝しますこの作品は、ゼブラフィッシュ研究幹細胞のセンターとノートルダム大学とノートルダム大学で再生医療のノートルダム大学、エリザベスとマイケル ・ ギャラガー家族、アルフレッド ・ p. スローン財団、センターによって支えられました。大聖堂。すべての動物の研究は、博士コーディ スミスに IACUC ノートルダム大学に準拠して行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
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