Summary
Aquí, presentamos un protocolo para mostrar cómo photoconversion celular se logra a través de la exposición Ultravioleta a áreas específicas que expresan la proteína fluorescente, Eos, en animales vivos.
Abstract
Tejido animal y vegetal se compone de distintas poblaciones de células. Estas células interactúan en el tiempo para construir y mantener los tejidos y pueden causar enfermedad cuando interrumpió. Los científicos han desarrollado técnicas inteligentes para investigar las características y dinámica natural de estas células dentro del tejido intacto por expresión de proteínas fluorescentes en subconjuntos de células. Sin embargo, a veces, los experimentos requieren más seleccionado visualización de células dentro del tejido, a veces en la forma unicelular o población de células. Para lograr esto y visualizar las células dentro de una población de células, los científicos han utilizado sola célula photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demostrar esta técnica, aquí mostramos cómo a la luz UV a una celda de Eos-expresión de interés en un intacto, vive de zebrafish. Entonces a la imagen de esas células de Eos+ photoconverted 24 h más tarde para determinar cómo ha cambiado en el tejido. Se describen dos técnicas: solo celular photoconversion y photoconversions de las poblaciones de la célula. Estas técnicas pueden utilizarse para visualizar las interacciones célula-célula, destino celular y diferenciación y migraciones celulares, lo que es una técnica que es aplicable en muchas de las preguntas biológicas.
Introduction
Varias celdas distintas interactúan para construir y mantener los tejidos animales y vegetales complejos. Estas células son a menudo intercalados y difíciles de distinguir de los vecinos a un nivel unicelular sin microscopía de alta resolución que requieren fijación del tejido. Sin embargo, para entender cómo estas forman los tejidos, se mantiene y se convierten en enfermos, ha sido esencial para investigar cómo solo las células dentro del tejido están interactuando con el tiempo. Idealmente, estos experimentos requieren el etiquetado de células individuales dentro de un tejido de una manera no invasiva sin necesidad de fijación. Los científicos ahora han desarrollado numerosas técnicas para lograr esta tarea1,2,3,4.
El descubrimiento y la aplicación de la proteína fluorescente de Medusa verde (GFP) es un enfoque interesante que permitió para el etiquetado de distintas células en un tejido medio ambiente1. Utilizando promotores específicos de la célula, es posible seleccionar genéticamente un subconjunto de las células que llevan la etiqueta1. Alternativamente, viral inducido expresión de GFP puede ser utilizado para la expresión seleccionada por el usuario de GFP3,4. Aunque muy útil, expresión génica mediada de GFP no permite expresión seleccionada por el usuario dentro de un subconjunto de las células en el tejido; y viral expresión de GFP, aunque ventajosa, puede ser invasivo. Con la llegada de los derivados GFP y técnicas inteligentes como Brainbow para expresar distintas proteínas fluorescentes más escasamente en los tejidos, es posible visualizar las células y las interacciones entre ellos en el complejo tejido2, 5. sin embargo, estos enfoques etiqueta de células al azar. Si el experimento deseado requiere la visualización de una sola célula o población de células que se define por el experimentador, por lo tanto son limitados. Con tales experimentos, sería ventajoso tener una proteína fluorescente genéticamente expresa que puede ser manipulada para distinguir, en forma unicelular, de otras células fluorescentes y no fluorescentes.
Para alcanzar esta meta y visualizar la biología celular de las células en un tejido complejo de la vida, la comunidad científica utiliza photoconversion unicelular de diferentes proteínas fluorescentes6,7,8. Utilizando genéticamente controlada expresión de una proteína photoconvertible (es decir, eos, kaede, etc.) que las transiciones de un verde a rojo estado fluorescente cuando se exponen a los rayos UV (488 nm) luz, podemos distinguir una sola célula de su fluorescencia marcada vecinos6,7,8. Este enfoque utiliza un aparato conectado a nuestro microscopio confocal que puede dirigir la luz de una pila de láser a una región limitada de la difracción de interés. Con esta técnica, o bien podemos etiquetar las células o poblaciones más grandes en una manera definida por el usuario9,10,11. La técnica es mínimamente invasiva en comparación con las inyecciones de célula de GFP viral. Como una prueba de concepto, demostramos que podemos photoconvert las células dentro de un ganglio en el sistema nervioso periférico y photoconvert poblaciones más grandes como células situadas en el lado ventral de la médula espinal9,10, 11,12. Entonces podemos visualizar estas poblaciones de células de la photoconverted 24 h más tarde para ganar la penetración en su movimiento y diferenciación durante el desarrollo.
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Protocol
Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Notre Dame Animal cuidado institucional y Comité de uso.
1. preparación de la muestra de pez cebra
- Coloque un macho adulto y una Tg femenino adulto (proteína convertible) en una cámara de acoplamiento por procedimientos estándar13. En este manuscrito, utilice Tg(sox10:eos) de pescado9 por acceso pero otras líneas transgénicas con proteínas de photoconvertible puede ser utilizado igualmente. Configurar más de una cámara en caso de que no ponga el pescado. Permita que el pescado permanezca en la cámara durante la noche.
- A la mañana siguiente, recoger los huevos en cajas Petri de 100 mm. Permiten huevos madurar a la fertilización después de 24 h (hpf) antes de la proyección.
- Si arriba los animales eran heterocigotos para el transgen, platos de pantalla 24 hpf embriones Tg(sox10:eos) + con una fuente de luz nm y GFP 488 filtran de conjuntos en un microscopio de disección. Aislar Tg(sox10:eos) + embriones y dejar para madurar hasta 48 hpf.
- Dechorionate embriones manualmente con una aguja o unas pinzas.
- Preparar y microondas 5 mL de solución de agarosa de punto de bajo punto de fusión de 0,8%.
- Una vez que la agarosa es fría al tacto, lugar Tg anestesiados de 3-4 (sox10:eos) + 48 peces hpf en el centro de un cubreobjetos de cristal 10 mm plato de Petri de fondo.
- Añadir suficiente agarosa para cubrir la superficie del cubreobjetos, aproximadamente 1 mL. Utilice una aguja de punta de prueba para arreglar pescado en sus lados. Permita que la agarosa se solidifique para asegurar el montaje de los animales. Puede ser necesario reorganizar continuamente el pez cebra hasta que el agar solidifica14. Solidificación tarda aproximadamente 2 minutos.
- Después de la agarosa ha solidificado por 2 min, lentamente agregar medio embrión que contiene 0.02% éster del ácido paraaminobenzoico (Metanosulfonato) a plato hasta que la superficie del fondo del agar y plato quede sumergida. Este debe ser aprox. 3mL.
2. microscopio montaje y proyección de imagen de conversión previa
- Confocal software abierto y seleccione las ventanas de captura y enfoque [figura 1]. Debajo de la ventana de captura, seleccione conversión específica de laboratorio de imagen bajo la captura ajuste desplegable pestaña [figura 1]. Aquí, el ajuste del laboratorio específico se llama "proyección de imagen de peces".
- Coloque el espécimen en ámbito confocal y enfocar con el curso y las perillas de ajuste fino.
- Abra la ventana de foco y localizar la región deseada de interés (es decir, los ganglios de raíz dorsal).
- Seleccione el láser c488 bajo el menú filtro. Ajustar la exposición a 300 m, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2].
- Marque la casilla 3D en la sección tipo de captura . En la sección 3D de captura , seleccione posición actual y Compruebe la gama alrededor de corriente. En la misma sección, establecer el rango a 35, el número de aviones a 36 y el tamaño de paso 1. La gama puede aumentarse o disminuirse para acomodar la profundidad de la zona de proyección de imagen. Para la médula espinal un valor entre 35-40 pilas normalmente es suficiente [figura 5].
- Seleccione la ubicación actual [figura 5].
- Haga clic en Inicio en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir imagen.
3. single-cell Photoconversion
- Confocal software abierto y seleccione las ventanas de captura y enfoque [figura 1]. Debajo de la ventana de captura, seleccione conversión específica de laboratorio de imagen bajo la captura ajuste desplegable pestaña [figura 1]. Aquí, el ajuste del laboratorio específico se llama "Pescado ablar chip completo".
- Seleccione el láser c488 y c541 bajo el menú filtro. Si no utiliza el mismo software del microscopio, encontrar el menú para seleccionar diferentes láseres y seleccione el 488 nm y láseres de 541 nm. Establecer las exposiciones a 300 m, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2]. Estos ajustes del láser son seleccionados basado en la producción de suficiente señal fluorescente sin causar fotoblanqueo o toxicidad. Si se visualiza la toxicidad o el fotoblanqueo, reducir la potencia del láser o la exposición.
- Abra la ventana de foco y haga clic en la ficha de Fotomanipulación en la ventana de foco. Ajustar los parámetros del láser en consecuencia. Cambiar la potencia de la pila de láser a 2 y a continuación, haga clic en ir. Cambiar el tamaño de bloque de trama 1 y haga clic en establecer. Cambiar el tamaño de doble clic 4. Cambia la línea láser a v405 [figura 3].
- Abra la configuración avanzada de la captura en la ventana de captura. Seleccione la ficha de Fotomanipulación y cambiar las repeticiones haga doble clic en 2. Haga clic en aceptar [figura 4].
- Seleccione la ficha XY en la ventana de foco. Verifique los parámetros del láser del paso 2 en la ficha de Fotomanipulación [figura 3, figura 4]. Configuración de láser para photoconvert la célula de interés sin photoconversion de las células circundantes.
- Si hay photoconversion de las células adyacentes, reducir la potencia del láser. Si no se produce photoconversion de las células, se pueden aumentar potencias láser. Ajuste óptimo, energía del laser a photoconvert sólo la región de interés y alrededores no.
- Marque la casilla de timelapse con tipo de captura. A continuación, haga clic en Inicio [figura 6A].
- Una vez que el timelapse en la ventana, seleccione la herramienta de círculo en la barra de herramientas superior [figura 7]
- Dibuja un círculo en la región más central de la célula. Haga clic con el botón derecho del círculo dibujado, seleccione región FRAPy espere 3 segundos. El área seleccionada debe convertirse en regulador [figura 8]. Haga clic en Detener captura.
- Si la proyección de imagen más de un animal, volver a la ficha XY en el menú de enfoque y posición seleccione 2. A continuación, repita los pasos 4.1-4.6.
- Para convertir a una población de células, siga los parámetros de protocolo y láser para pasos 4.1-4.4 excepto en lugar de dibujar un círculo para FRAP la región de interés, utilice la herramienta de línea. Trace una línea en la región de interés y FRAP la región utilizando los mismos parámetros mencionados anteriormente.
4. post-photoconversion la proyección de imagen
- Una vez que todos los puntos son photoconverted. Seleccionar la pila de imagen estándar de laboratorio específica ajuste descrito en el paso 3 la proyección de imagen de precoversion. Esto se encuentra bajo la captura ajuste desplegable pestaña en la ventana de captura [figura 5].
- Seleccione el láser c488 y ajustar la exposición a 300ms, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2].
- Seleccione el c541 láser en el mismo menú que el láser c488. Ajustar la exposición a 500 ms, laser de potencia de 10 e intensificar a 75 [figura 9].
- Marque la casilla 3D en la sección tipo de captura . En la sección 3D de captura , seleccione posición actual y Compruebe la gama alrededor de corriente. En la misma sección, establecer el rango a 35, el número de aviones a 36 y el tamaño de paso 1. El número de rango puede aumentar o disminuir para acomodar la profundidad de imagen deseada [figura 5].
- Si hay múltiples puntos en la ficha de atención XY, seleccione la opción lista multipunto en la ventana de captura. Si no, seleccione la ubicación actual.
- Haga clic en Inicio en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir imagen.
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Representative Results
Photoconversion de proteínas fluorescentes puede utilizarse para etiquetar las distintas células dentro de un tejido6. Para demostrar esto, Tg(sox10:eos) pescado9 fueron utilizados para expresar la proteína photoconvertible Eos en las secuencias reguladoras de sox10. Los animales Tg(sox10:eos) en 48 hpf fueron montados primero y luego reflejada para detectar cualquier photoconversion no específicos que puede haber ocurrido. El Eos señal fluorescente con poco Eos photoconverted fluorescente era entonces visualizado (figura 10). Animales fueron mantenidos en la oscuridad para photoconversion no específica es mínima. Luego, las regiones de interés fueron expuestas a la luz UV mediante la configuración del microscopio confocal. Para confirmar que las células eran photoconverted como consecuencia de la exposición UV, tomamos z-pila del área que abarca la región de photoconverted. De acuerdo con photoconversion éxito, había poca detección de Eos no convertido fuera de la región de interés y photoconverted Eos estaba claramente presente en la región de interés. La imagen resultante muestra una sola celda dentro de un ganglio que es definitivamente de sus vecinos (figura 10).
Para demostrar la utilidad de esta técnica de photoconversion, una población de células también fue expuesta a la luz UV. En este paradigma, se tomaron imágenes de pre-photoconversion y no hay señal de las Naciones Unidas-photoconverted Eos estaba presente. A continuación, el lado ventral de la médula espinal fue expuesto a UV utilizando una línea (figura 11). Para confirmar el éxito photoconversion, se tomaron imágenes de post-photoconversion y photoconverted Eos en las células ventrales de la médula espinal en la localización de la línea de interés que nos dibujó fueron visualizados (figura 11). Señal de no-photoconverted Eos era visible en todas las demás áreas. Para ampliar esta técnica entonces tomamos imágenes idénticas 24 horas después de la photoconversion. En estas imágenes, photoconverted Eos+ células fueron consideradas dispersas en toda la región de la médula espinal en posiciones dorsales y ventrales (figura 12). Estos datos son consistentes con la hipótesis de que las células espinales ventrales trasladó a lugares dorsales anteriormente descrito10. Juntas estas dos técnicas demuestran que photoconversion de Eos puede utilizarse para visualizar células o poblaciones de células dentro de una región de tejido de manera definida por el usuario. Esto ha contribuido a una mejor comprensión de características celulares tales como la migración celular, la comunicación y la dinámica.
Figura 1 : Capturar y enfocar Windows. Captura de pantalla del software que representan la ubicación de ventanas de captura y enfoque y el laboratorio específico "Pescado ablar chip completo" desplegable pestaña. Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : c488 Laser parámetros. Captura de pantalla de la ventana de captura que muestra los parámetros específicos para el láser c488. La exposición es la Sra. 300 potencia del láser es 5. Intensificar es 75. Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Parámetros de láser de Photoconversion. Captura de pantalla de la ficha de Fotomanipulación en la ventana de foco sobre la configuración específica de láser necesarios para photoconversion. El poder Laserstack es 2. Haga doble clic en el tamaño es 4. Tamaño del bloque de trama es 1. Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Photoconversion Laser parámetros avanzados. Captura de pantalla de la configuración avanzada del láser en la ventana de captura. Esto abre la ventana de preferencias de captura con la ficha de Fotomanipulación. Las repeticiones de doble clic se establece en 2. Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : La conversión de parámetros de la proyección de imagen. Imágenes de las ventanas de captura y enfoque. Pone de relieve los parámetros específicos de la ventana de captura necesarios para la conversión de imágenes. La configuración de captura es "Proyección de imagen de peces." La casilla 3D bajo el tipo de captura. Y la configuración de captura 3D se especifica como; Rango es de 35, número de planos es 36, tamaño de paso es 1, y desplazamiento es -15. También se seleccionan las casillas de "gama alrededor de corriente" y "posición actual". Ver cajas rojas. Describe cómo seleccionar uno o múltiples puntos en la ventana de captura (izquierda) y cómo seleccionar puntos individuales en la ventana de foco (derecha). Ver cajas verdes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Abrir la ventana de Photoconversion. Captura de pantalla que representa el tipo de captura de timelapse se selecciona según parámetros previamente establecidos. Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Configuración de la Photoconversion. Captura de pantalla que muestra la ubicación de la herramienta de círculo (arriba) y la ventana de control de captura que aparece (derecha). Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Unicelular Photoconversion. Menú desplegable pantalla que representa el uso de la herramienta de photoconversion del círculo y el clic derecho. La acción de conversión "FRAP todas las regiones" se encuentra en el menú desplegable clic derecho. Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9 : Parámetros de c561Laser post-Photoconversion. Captura de pantalla de la ventana de captura que muestra los parámetros específicos para el láser de c561. La exposición es la Sra. 500 energía del Laser es de 10. Intensificar es 75. Ver cajas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10 : Unicelular Photoconversion. (A). z-proyecciones esquemáticas y confocales de pez cebra de Tg(sox10:eos) en 48 ganglios de raíz dorsal hpf muestra en sistema nervioso periférico antes de photoconversion. Línea punteada indica la ubicación aproximada de la entrada de la médula espinal DRG... (B). z-proyecciones esquemáticas y confocales de pez cebra de Tg(sox10:eos) en 48 ganglios de raíz dorsal hpf muestra en sistema nervioso periférico durante el photoconversion. Línea punteada indica entrada de médula espinal DRG. Círculo amarillo indica sitio de conversión y la iluminación indica exposición a la luz UV. (C). z-proyecciones esquemáticas y confocales de pez cebra de Tg(sox10:eos) en 48 ganglios de raíz dorsal hpf muestra en el post-photoconversion del sistema nervioso periférico. Línea punteada indica entrada de médula espinal DRG. CNS es una abreviatura para sistema nervioso central y PNS es una abreviatura para el sistema nervioso periférico (A-C). Barra de escala es igual a 10 um. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11 : Procedimiento de Photoconversion en una región más grande de la médula espinal. (A). z-proyecciones esquemáticas y confocales de pez cebra de Tg(sox10:eos) en 48 mostrando hpf OPC y los ganglios de raíz dorsal en la región ventral de la médula espinal antes de photoconversion. Línea punteada indica la región dorsal de la médula espinal. (B). esquema y confocales z-proyecciones del pez cebra Tg(sox10:eos) en 48 mostrando hpf OPC y los ganglios de raíz dorsal en la región ventral de la médula espinal durante la photoconversion. Línea amarilla continua indica el área seleccionada para photoconversion. Línea punteada indica la región dorsal de la médula espinal. (C). z-proyecciones esquemáticas y confocales de pez cebra de Tg(sox10:eos) en 48 mostrando hpf OPC y los ganglios de raíz dorsal en la región ventral de la médula espinal después de photoconversion. Las líneas punteadas indican la región dorsal de la médula espinal. Barra de escala es igual a 10 um.
Figura 12 : Seguimiento y visualización celular post-photoconversion. (A). esquema de pez cebra de Tg(sox10:eos) la médula espinal en 48 mostrando hpf OPC y los ganglios de raíz dorsal en la región ventral de la médula espinal después de photoconversion. Rayo indica la conversión de luz UV. (B). Confocal z-proyecciones de Tg(sox10:eos) pez cebra de la médula espinal a partir de las 48 que muestra hpf OPC y los ganglios de raíz dorsal en la región ventral de la médula espinal después de photoconversion. Rayo indica la conversión de luz UV. Barra de escala es igual a 10 um.
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Discussion
En tejidos complejos, distintos tipos de células se organizan en dominios específicos. Recientemente se han utilizado técnicas a las células individuales de la etiqueta dentro de estos tejido grandes estructuras1,2,3. Aquí muestran dos técnicas que pueden utilizarse igualmente para visualizar las interacciones de la célula y las interacciones de población de células dentro de tejidos complejos. La ventaja de la técnica de photoconversion es el control espacial, que el científico tiene que etiquetar claramente una célula. Con un microscopio que tiene la capacidad para exponer más pequeños imágenes áreas dentro de la ventana imagen, tan pequeños como células individuales o áreas de células individuales pueden ser etiquetadas diferentemente que otras células. Múltiples proteínas de photoconvertible ahora se han introducido a la comunidad haciendo de este un más extensa técnica7. Con la capacidad de photoconvert las proteínas dentro de las células, los científicos han utilizado esta técnica o métodos similares para investigar la migración celular, diferenciación celular y análisis de circuitos neuronales.
Aunque el software y los parámetros de láser específicos son específicos de nuestro laboratorio, este artículo demuestra la capacidad universal para utilizar la proteína de photoconvertable Eos en la distinción de las células dentro de un ganglio. Desafortunadamente, la mayoría genéticas regiones reguladoras que pueden utilizarse para conducir proteínas fluorescentes expresa ampliamente dentro de los ganglios en las etapas tempranas de desarrollo. Esto es probablemente porque estas células se generan de piscinas similares de progenitoras y los marcadores identifican aquellas progenitoras Estados9. Por lo tanto es difícil visualizar las interacciones de las células dentro de los ganglios más grandes durante estas etapas del desarrollo anteriores. Los enfoques se muestra a continuación representa una técnica que puede marcar células individuales dentro de un ganglio y así podría ser utilizada para analizar cuestiones científicas sobre el desarrollo de los ganglios.
Sin embargo, esta técnica de photoconversion no se limita a los estudios de desarrollo de los ganglios. Por ejemplo, en estudios de regeneración, photoconversion de condiciones previo a la lesión puede ser utilizado para determinar cómo las células específicas dentro de una respuesta del ganglio posterior a la lesión. Estos estudios pueden ayudar a aclarar el potencial como progenitoras de células específicas en un ganglio. Asimismo, photoconversion de las células del tumor específico y el seguimiento de esas células con el tiempo podrían revelar propiedades de las células en tumores complejos. Esta aplicación de photoconversion de la célula por lo tanto expande el potencial de la técnica para hacer descubrimientos significativos en la comunidad biomédica.
Este enfoque puede etiquetar también selectivamente las células dentro de un área de la médula espinal. En desarrollo, las células a menudo migran de áreas de precursor para producir células diferenciadas en ubicaciones madura11,14. Asignación de destino a largo plazo con Cre ha sido utilizado eficientemente para diseccionar esos procesos. Con técnicas de Cre, resolución espacial está limitada a las regiones genomic reguladoras que Cre transcripción15. Con photoconversion, se puede lograr esta resolución espacial junto con la posibilidad de elegir el momento cuando se produce la photoconversion y la resolución temporal. Por lo tanto, de más corto plazo asignación de destino, esta técnica de photoconversion tiene muchas ventajas sobre Cre asignación de destino. Sin embargo, en muestras donde la luz UV no puede ser alcanzada fácilmente, como en un ratón intacto, este enfoque de photoconversion es probable que trabajan15. Además, asignación de destino Cre etiquetas permanentemente células permitiendo a más largo plazo asignación de destino de photoconversion que pierde su etiqueta como la versión photoconverted de la proteína se disipa y la nueva proteína es producida por la célula. Sin embargo, dependiendo de la pregunta científica, photoconversion puede ser una herramienta útil para la asignación de destino de poblaciones celulares.
Pero son sólo dos ejemplos de la aplicación de photoconversion, numerosos estudios han demostrado su eficacia. Dependiendo de la precisión espacial necesaria, se puede realizar photoconversion con acceso a una fuente de luz UV. Si el deseo es solo la etiqueta células más avanzadas de imagen como microscopía confocal o dos fotones pueden ser necesarias. Sin embargo, la capacidad para seleccionar el área espacial y temporal de las células etiquetadas claramente de otras células en un tejido intacto se ha photoconversion UV-inducida una técnica poderosa para analizar cuestiones biológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Bernard Kulemaka y miembros del laboratorio de Smith por sus comentarios útiles y orientación de reactivo, Sam Connell y Brent Redford de 3i para enviar imágenes preguntas y Deborah Bang, Karen Heed y Kay Stewart para el cuidado del pez cebra. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Notre Dame, la Elizabeth y Michael Gallagher Family, el Alfred P. Sloan Foundation, centro de investigación de pez cebra en la Universidad de Notre y centro de las células madre y medicina regenerativa en la Universidad de Notre Dame. Todos los estudios en animales se realizaron en cumplimiento de la Universidad de Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
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