Vi beskriver en dramatisk forbedret metode til musen kloning ved hjælp af trichostatin A, vitamin C og deioniseret bovint serumalbumin. Vi viser et forenklet, reproducerbare protokol, der understøtter effektiv udvikling af klonede embryoner. Derfor kunne denne metode blive en standardiseret procedure for musen kloning.
Kropsceller (SCNT) giver en enestående mulighed for direkte producerer en klonede dyr fra en donor celle, og det kræver brug af dygtige teknikker. Derudover er effektivitetsgevinsterne af kloning forblevet lave siden den vellykkede produktion af klonede dyr, især mus. Der har været mange forsøg på at effektivisere kloning, og trichostatin A (TSA), en Histon deacetylase hæmmer, har været meget anvendt til at øge effektiviteten af kloning. Her rapporterer vi en dramatisk forbedret kloning metode i mus. Denne somatisk overførsel af cellekerner metode indebærer brugen af Hemagglutinating virus af Japan kuvert (HVJ-E), som giver mulighed for nem manipulation. Desuden er behandling ved hjælp af to små molekyler, TSA og C-vitamin (VC), med deioniseret bovint serumalbumin (dBSA), meget effektiv til embryonale udvikling. Denne tilgang kræver hverken yderligere injektion eller genetisk manipulation, og dermed præsenterer en enkel og egnet metode til praktisk brug. Denne metode kunne blive en teknisk muligt tilgang til forskere til at producere genetisk modificerede dyr fra dyrkede celler. Derudover kan det være en nyttig måde til redning af truede dyr via kloning.
SCNT-teknologi giver mulighed for fremstilling af klonede dyr ved hjælp af kun én somatisk celle eller en kerne skal overføres til en kerneløse oocyt. Et af formålene med SCNT teknik er afledning af overførsel af cellekerner embryonale stamceller (NT-sektorrådene) linjer fra klonede embryoner. I 1998, Wakayama mfl., rapporterede producerer en vellykket klonede mus ved navn Cumulina for første gang1. Siden da, kloning af mus har været almindeligt studerede, og mange vigtige indsigter i nukleare omprogrammering af somatiske cellekerner er opnået. På den anden side, denne teknik er ledsaget af talrige micromanipulation trin, som er ganske vanskeligt at master, som kræver intensiv træning af mere end 3 måneder2.
Fremstilling af klonede mus ved hjælp af SCNT har udviklet sig fra den oprindelige Honolulu metode1, den electrofusion metode3, at metoden celle sammensmeltning af Hemagglutinating virus af Japan (HVJ)4. Dog, den direkte indsprøjtning af en cellekerne gennem cytomembrane tendens til at negativt påvirker oocyt overlevelse. Electrofusion er lav i effektivitet, da hver celle membranen har forskellige hårdhed, hvilket gør det vanskeligt at bestemme en optimal tilstand. Håndtering af HVJ er besværlige, fordi det kræver særligt udstyr for sikkerheden for forskere og forsøgsdyr. For nylig, for at sammensmelte donor celle og oocyt cytoplasma, HVJ-E er blevet brugt5. HVJ-E har kun mulighed for at sammensmelte membraner uden at proliferativ eller smitsomme virus. Genomisk RNA’er HVJ er helt inaktiveret i HVJ-E. Brugen af HVJ-E understøtter således let håndtering af cellefusion under SCNT.
Flere rapporter har vist, at behandling af SCNT embryoner med TSA, en Histon deacetylase hæmmer, væsentligt forbedrer produktionseffektivitet af levende unger fra mindre end 1% til 6,5%6,7. TSA behandling accelererer omprogrammering gennem ændring af Histon mærker i SCNT embryoner8. For nylig, injektion af særlige mRNAs, Histon lysin demethylase underfamilie 4 (KDM4), som fjerner Histon H3 lyzin 9 (H3K9) trimethylation i SCNT embryoner, især på reprograming-resistente regioner, har vist sig at øge udviklingen af klonede musen embryoner9. I mellemtiden, har VC, der også fungerer som en Histon modifier, faldt trimethylation H3K910. Derudover forbedrer VC fosterudviklingen i svin SCNT10. Det er blevet rapporteret, at injektion af dBSA i SCNT embryoner fører til en forbedring af fosterudviklingen11.
Vi har tidligere fundet at kombinationen af små molekyler, nemlig TSA og VC, sammen med dBSA, dramatisk forbedret udviklingen af SCNT embryoner12. Her, detalje vi tidligere rapporteret SCNT metoden for mus, som repræsenterer meget effektiv og enkel kloning procedurer12. Vi beskriver også håndteringen af HVJ-E. Disse kunne hjælpe mange forskere inden for udviklingsmæssige og reproduktiv biologi at bevare plantegenetiske ressourcer eller producere genetisk modificerede dyr gennem denne SCNT metode.
Afslutningsvis, tyder disse resultater på, at metoden præsenteres SCNT kunne reducere tekniske vanskeligheder, og øge effektiviteten af SCNT uden at kræve genetiske modifikationer og mRNA tilskud (tabel 1, tabel 2) og sikre stabil produktion af klonede embryoner. Denne metode gør det muligt at rekonstruere mere SCNT embryoner end konventionelle metoder på grund af bedre overlevelsesrate og forenklet protokol. I denne protokol er et kritisk skridt cellefusion. For at kunne producere klonede mus, er det afgørende at sikre, at det korrekte antal HVJ-E beskrevet i protokollen opretholdes under celle sammensmeltning proces og oocyter skal returneres til rugemaskine indenfor 10 min i skridt 6.2.3 – 6.2.5. Da 20 til 30 donor celler kan være indsugning sammen med HVJ-E ad gangen i manipulation pipette, er antallet af oocytter fremstillet ved en operation større end den eksisterende metode. I sidste ende kan vi producerer omkring 20 til 30 re konstrueret oocyter inden for 10 min. Selv når arbejder med et stort parti af oocyter (100 eller flere), celle fusion procedure bør tage en time eller mindre ved at gentage trin 6.2.3 – 6.2.5. Den metode og de teknikker præsenteret her kan fungere som effektive protokoller med forenklede tekniske krav.
På nuværende tidspunkt er de molekylære mekanismer bag udviklingen af SCNT embryoner stadig uklare. Denne forbedrede SCNT metode bidrager også til at studere sådanne omprogrammering mekanismer, da denne metode kan producere mange klonede embryoner i kun et eksperiment. Denne metode bruger somatiske celler med intakte cellemembraner for cellefusion. Således kan det være muligt at anvende denne fremgangsmåde til andre celler, såsom halespids celler16, sertoli celler17og embryonale stamceller (ES) celler18. Når konventionelle SCNT metoder bruges til indsprøjtning relativt store celler, såsom Hale spids celler, direkte ind i cytoplasmaet oocyt bliver det endnu mere teknisk krævende at få levende embryoner. Derudover er relativt hårdt celler, såsom sertoli celler, vanskeligt at bryde af pipettering til indsprøjtning. Når disse forskellige celletyper betragtes, er metoden celle fusion udnytte HVJ-E enkel og effektiv. Selv om den værdi og sikkerheden af HVJ-E har været overbevisende dokumenteret19,20, kan det være vigtigt at genoverveje muligheden for at bruge HVJ-E til fremstilling af klonede dyr til landbrugs- eller biomedicinske formål.
Desuden produceret for nylig en gruppe med succes klonede mus afledt af urin celler21. For at redde truede pattedyr arter, vil fremover SCNT ved hjælp af de celler, der opsamlet i en ikke-invasiv måde, som cellen urin være ideel. For nylig, en anden gruppe har direkte genereret klonede mus ved hjælp af antigen-specifikke CD4+ T celler22. Det ville være interessant at undersøge, om denne metode er også gældende for effektivt klon mus fra sådanne celler. Derudover er Latrunculin A blevet rapporteret som et bedre alternativ til at hæmme actin polymerisering under enucleation og parthenogenetic aktivering af SCNT oocyter23. Fremtidige undersøgelse kan afsløre, om Latrunculin A behandling, i stedet for cytochalasin B, yderligere forbedrer generation af klonet afkom. Derudover har TSA behandling held været anvendt i mus, svin24og kaniner25 ved at ændre indvirkningstid, periode og koncentration. Derudover VC ikke kun forbedrer fosterudviklingen i svin SCNT10, men også forbedrer iPS celle produktion i mennesker og mus26. Derfor er det plausibelt at spekulere at TSA og VC behandling kan også anvendes til andre pattedyr, og vi kan være nødvendigt at optimere tid, behandling af TSA og VC for hver art.
Til sidst, gør denne metode det muligt at generere klonede mus med en praktisk niveau af effektivitet med enkle procedurer. Derfor, resultaterne af denne undersøgelse kunne føre os til at anvende SCNT-teknologi for at bevare de genetiske ressourcer af sjældne dyr, og for at forstå de molekylære mekanismer af nukleare omprogrammering og tidlige embryonale udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI grant numre JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 til K.M. Sumitomo Foundation Grant for grundlæggende videnskab forskningsprojekter (150810 til K.M.). Kindai Universitet forskning tilskud (15-I-2 til K.M. og M.A.). M.O. anerkender den core støtte fra Cancer Research UK (C6946/A24843) og the Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Vi takker Ms. N. Backes-Kamimura og Mr. J. Horvat for korrekturlæsning.
NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |