हम trichostatin ए, विटामिन सी, और विज्ञानी गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन का उपयोग करके माउस क्लोनिंग के लिए एक नाटकीय रूप से बेहतर विधि का वर्णन करते हैं । हम एक सरल, reproducible प्रोटोकॉल है कि क्लोन भ्रूण के कुशल विकास का समर्थन करता है दिखाते हैं । इसलिए, इस विधि माउस क्लोनिंग के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया बन सकता है ।
दैहिक कोशिका परमाणु अंतरण (SCNT) एक अद्वितीय को सीधे एक दाता सेल से एक क्लोन जानवर का उत्पादन अवसर प्रदान करता है, और यह निपुण तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, क्लोनिंग की क्षमता कम बनी हुई है, विशेष रूप से पशुओं, खासकर चूहों के सफल उत्पादन के बाद से । क्लोनिंग दक्षता में सुधार करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं, और trichostatin एक (TSA), एक हिस्टोन deacetylase अवरोध करनेवाला, व्यापक रूप से क्लोनिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहां, हम चूहों में एक नाटकीय रूप से बेहतर क्लोनिंग विधि की रिपोर्ट । इस दैहिक कोशिका परमाणु हस्तांतरण विधि जापान लिफाफा (एचवीजे-E), जो आसान हेरफेर सक्षम बनाता है की Hemagglutinating वायरस के उपयोग शामिल है । इसके अलावा, दो छोटे अणुओं का उपयोग कर उपचार, TSA और विटामिन सी (कुलपति), के साथ एल्ब्युमिन गोजातीय सीरम (dBSA), अत्यधिक भ्रूण के विकास के लिए प्रभावी है । इस दृष्टिकोण न तो अतिरिक्त इंजेक्शन और न ही आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है, और इस तरह व्यावहारिक उपयोग के लिए एक सरल, उपयुक्त विधि प्रस्तुत करता है । इस पद्धति के शोधकर्ताओं के लिए एक तकनीकी रूप से व्यवहार्य दृष्टिकोण बन सकता है संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं से आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं का उत्पादन । इसके अलावा, यह क्लोनिंग के जरिए लुप्तप्राय जानवरों के बचाव के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है ।
SCNT प्रौद्योगिकी क्लोन पशुओं के उत्पादन केवल एक दैहिक कोशिका या एक नाभिक का उपयोग करके एक enucleated oocyte को हस्तांतरित करने के लिए सक्षम बनाता है । SCNT तकनीक के प्रयोजनों में से एक क्लोन भ्रूण से परमाणु हस्तांतरण भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (NT-ESCs) लाइनों के व्युत्पत्ति है । १९९८ में, वाकायामा एट अल, पहली बार1के लिए Cumulina नामक एक सफलतापूर्वक क्लोन माउस के उत्पादन की सूचना दी । तब से, चूहों की क्लोनिंग व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, और दैहिक नाभिक के परमाणु reprogramming में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त किया गया है । दूसरी ओर, इस तकनीक कई micromanipulation कदम है जो काफी गुरु के लिए मुश्किल है के साथ है, अधिक से अधिक 3 महीने के2के गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है ।
क्लोन चूहों का उत्पादन SCNT का उपयोग कर मूल होनोलूलू विधि1से विकसित किया गया है, electrofusion विधि3, सेल फ्यूजन विधि से जापान के Hemagglutinating वायरस (एचवीजे)4. हालांकि, cytomembrane के माध्यम से एक सेल नाभिक के प्रत्यक्ष इंजेक्शन हानिकारक oocyte अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए जाता है । electrofusion क्षमता में कम है, के बाद से प्रत्येक कोशिका झिल्ली अलग कठोरता है, यह मुश्किल एक इष्टतम स्थिति निर्धारित करने के लिए बना । एचवीजे की हैंडलिंग श्रमसाध्य है क्योंकि यह शोधकर्ताओं और प्रयोगशाला पशुओं की सुरक्षा के लिए विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता है । हाल ही में, दाता सेल और oocyte कोशिका द्रव्य फ्यूज करने के लिए, एचवीजे-E 5 इस्तेमाल किया गया है । एचवीजे-E केवल प्रफलन या वायरस की संक्रामक क्षमता के बिना झिल्ली फ्यूज करने की क्षमता है । एचवीजे-ए में एचवीजे के जीनोमिक RNAs पूरी तरह से निष्क्रिय हैं । एचवीजे का उपयोग-E इस प्रकार SCNT के दौरान सेल फ्यूजन के आसान हैंडलिंग का समर्थन करता है ।
कई रिपोर्टों से पता चला है कि TSA, एक हिस्टोन deacetylase अवरोध करनेवाला के साथ SCNT भ्रूण के उपचार, काफी से कम 1% से लाइव पिल्ले की उत्पादन क्षमता में सुधार ६.५%6,7। TSA उपचार SCNT भ्रूण में हिस्टोन के निशान को संशोधित करने के माध्यम से reprogramming में तेजी8। हाल ही में, विशेष mRNAs के इंजेक्शन, हिस्टोन lysine demethylase उपपरिवार 4 (KDM4) है, जो हिस्टोन H3 lysin 9 (H3K9) trimethylation भ्रूण में, विशेष रूप से reprograming-प्रतिरोधी क्षेत्रों में, निकाल दिया गया है क्लोन के विकास को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है माउस भ्रूण9। इस बीच, उपकुलपति, जो एक हिस्टोन संशोधक के रूप में भी कार्य करता है, H3K910के trimethylation में कमी आई है । इसके अलावा, कुलपति सुअर का SCNT 10 में भ्रूण विकास को बढ़ाता है । यह बताया गया है कि SCNT भ्रूण में dBSA के इंजेक्शन भ्रूण विकास के सुधार की ओर जाता है11.
हम पहले से पाया गया है कि छोटे अणुओं, अर्थात् TSA और कुलपति के संयोजन, साथ में dBSA, नाटकीय रूप से SCNT भ्रूण के विकास को बढ़ाकर12। यहाँ, हम विस्तार से चूहों के लिए पहले रिपोर्ट SCNT विधि, जो अत्यधिक कुशल और सरल क्लोनिंग प्रक्रियाओं12का प्रतिनिधित्व करता है. हम एचवीजे-ए की हैंडलिंग का भी वर्णन करते हैं । ये विकास और प्रजनन जीवविज्ञान के क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं मदद करने के लिए आनुवंशिक संसाधनों को बनाए रखने या इस SCNT विधि के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं का उत्पादन कर सकते हैं ।
अंत में, इन परिणामों का सुझाव है कि प्रस्तुत SCNT विधि तकनीकी कठिनाइयों को कम कर सकता है, और आनुवंशिक संशोधनों और mRNA पूरकता की आवश्यकता के बिना SCNT की क्षमता में वृद्धि (तालिका 1, तालिका 2), और सुनिश्चित क्लोन भ्रूण के स्थिर उत्पादन । इस विधि हमें बेहतर अस्तित्व दर और सरलीकृत प्रोटोकॉल के कारण पारंपरिक तरीकों से अधिक SCNT भ्रूण पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में, एक महत्वपूर्ण कदम सेल फ्यूजन है । सफलतापूर्वक क्लोन चूहों का उत्पादन करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एचवीजे की उचित मात्रा ई प्रोटोकॉल में वर्णित सेल संलयन प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा है और अंडाणुओं के लिए कदम 6.2.3-6.2.5 के दौरान 10 मिनट के भीतर मशीन को लौट जाने की जरूरत है । चूंकि 20 से 30 दाता कोशिकाओं को एक साथ एचवीजे-E हेरफेर पिपेट में एक समय में aspirated जा सकता है, एक आपरेशन द्वारा प्राप्त अंडाणुओं की संख्या मौजूदा पद्धति की तुलना में बड़ा है । अंत में, हम के बारे में उत्पादन कर सकते है 20 से 30 फिर से 10 मिनट के भीतर अंडाणुओं का निर्माण किया । यहां तक कि जब अंडाणुओं (१०० या अधिक) के एक बड़े बैच के साथ काम कर रहे हैं, सेल फ्यूजन प्रक्रिया एक घंटे या उससे कम कदम 6.2.3-6.2.5 दोहराने से लेना चाहिए । विधि और यहां प्रस्तुत तकनीक सरल तकनीकी आवश्यकताओं के साथ कुशल प्रोटोकॉल के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
वर्तमान में, आणविक SCNT भ्रूण के विकास अंतर्निहित तंत्र अभी भी अस्पष्ट है । यह सुधार SCNT विधि भी ऐसे reprogramming तंत्र का अध्ययन करने के लिए योगदान देता है, क्योंकि इस विधि केवल एक प्रयोग में कई क्लोन भ्रूण का उत्पादन कर सकते हैं । इस विधि सेल फ्यूजन के लिए बरकरार कोशिका झिल्ली के साथ दैहिक कोशिकाओं का उपयोग करता है । इस प्रकार, यह इस approach पूंछ युक्ति कक्ष16, sertoli कक्ष17, और भ्रूण स्टेम (ES) कक्ष18जैसे अंय कक्षों के लिए लागू करने के लिए संभव हो सकता है । जब पारंपरिक SCNT तरीके पूंछ टिप कोशिकाओं के रूप में अपेक्षाकृत बड़ी कोशिकाओं, इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है, सीधे oocyte कोशिका द्रव्य में, यह और भी तकनीकी रूप से रहते भ्रूण प्राप्त करने की मांग हो जाता है । इसके अलावा, अपेक्षाकृत कठिन कोशिकाओं, जैसे sertoli कोशिकाओं, इंजेक्शन के लिए pipetting द्वारा तोड़ने के लिए मुश्किल हैं । जब इन विभिंन प्रकार के सेल माना जाता है, सेल संलयन विधि का उपयोग एचवीजे-E सरल और प्रभावी है । हालांकि मूल्य और एचवीजे-e की सुरक्षा के कायल19,20का प्रदर्शन किया गया है, यह फिर से महत्वपूर्ण हो सकता है एचवीजे का उपयोग करने की व्यवहार्यता पर विचार-कृषि या जैव चिकित्सा प्रयोजनों के लिए क्लोन पशुओं के उत्पादन के लिए ई ।
इसके अलावा, हाल ही में एक समूह सफलतापूर्वक मूत्र कोशिकाओं21से व्युत्पंन क्लोन चूहों का उत्पादन किया । लुप्तप्राय स्तनधारी प्रजातियों से बचाव के लिए, इसके बाद से SCNT एक गैर इनवेसिव तरीके से एकत्र कोशिकाओं का उपयोग कर, जैसे मूत्र कोशिका, आदर्श हो जाएगा । हाल ही में, एक अंय समूह सीधे प्रतिजन-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं22का उपयोग कर चूहों क्लोन उत्पंन किया है । यह अगर इस विधि भी कुशलतापूर्वक ऐसी कोशिकाओं से चूहों क्लोन करने के लिए लागू होता है की जांच करने के लिए दिलचस्प होगा । इसके अलावा, Latrunculin एक enucleation और parthenogenetic SCNT के अंडाणुओं सक्रियण के दौरान actin बहुलकीकरण बाधा के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में सूचित किया गया है23। भविष्य के अध्ययन से पता चलता है कि Latrunculin एक उपचार, बजाय cytochalasin बी के, आगे क्लोन वंश की पीढ़ी में सुधार हो सकता है । इसके अतिरिक्त, TSA उपचार सफलतापूर्वक चूहों, सूअरों24में इस्तेमाल किया गया है, और25 खरगोशों उपचार के समय, अवधि, और एकाग्रता बदलकर । इसके अलावा, कुलपति न केवल सुअर का SCNT 10 में भ्रूण विकास को बढ़ाता है, लेकिन यह भी मानव और चूहों में आईपीएस सेल उत्पादन में सुधार 26. इस प्रकार, यह अटकलें है कि TSA और कुलपति उपचार भी अंय स्तनधारी प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है प्रशंसनीय है, और हम प्रत्येक प्रजातियों के लिए tsa और कुलपति के उपचार के समय का अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
अंत में, इस विधि सरल प्रक्रियाओं के साथ दक्षता का एक व्यावहारिक स्तर के साथ क्लोन चूहों उत्पन्न करने के लिए यह संभव बनाना होगा. इसलिए, इस अध्ययन के परिणाम हमें दुर्लभ पशुओं के आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण के लिए SCNT प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए, और परमाणु reprogramming और जल्दी भ्रूण विकास के आणविक तंत्र को समझने के लिए नेतृत्व कर सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर्स JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 को बेसिक साइंस रिसर्च प्रोजेक्ट्स (१५०८१० से. एम.) के लिए सुमितोमो. एम. फाउंडेशन ग्रांट द्वारा सपोर्ट किया गया । Kindai यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट (15-आई-2 टू. एम. और एमए) । M.O. कैंसर रिसर्च यूके (C6946/A24843) और वेलकम ट्रस्ट (203144/z/16/z) द्वारा प्रदत्त मुख्य समर्थन स्वीकार करते हैं । हम सुश्री एन य्-Kamimura और श्री जे Horvat को प्रूफ रीडिंग के लिए धन्यवाद देते हैं ।
NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |